重组DNA技术交.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重组,DNA,技术的发展简史,1865,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物。,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,第一节 重组,DNA,技术的相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,宿主细胞,一、克隆,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为,克隆化,(cloning),，即,无性繁殖,。,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),即,DNA,克隆,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,DNA,克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的,DNA,）与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称,基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,重组,DNA,技术,实现,DNA,克隆所采用的方法及相关的工作统称为,重组,DNA,技术或重组,DNA,工艺学,(recombinant DNA biotechnology),，又称为基因工程（遗传工程）。,二、工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,DNA,聚合酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,反转录酶,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基合成双链,DNA,聚合酶,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,限制性核酸内切酶,定义,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,分类,、,、,（基因工程技术中常用,型）,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GC,A,T,GC,CG,T,A,CG,Nco,C,GGTAC,CATGG,C,+,CCATGG,GGTACC,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,GTC,CAG,同功异源酶,来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为,同功异源酶,。（来源不同的同一种限制性内切酶）,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,，产生相同的粘性末端，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,同尾酶,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同裂酶（,isoschizomer,）,识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称为同裂酶（,isoschizomer,）。,Xma,Sma,CCCGGG,GGGCCC,CCCGGG,GGGCCC,C,GGGCC,CCGGG,C,+,+,CCC,GGG,GGG,CCC,第二节 重组,DNA,技术的基本原理,一、基本程序,目的基因的获取,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,二、重组,DNA,技术步骤,1.,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,2.,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),3.cDNA,文库,(cDNA library),4.,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR),（一）目的基因的获取,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,组织或细胞染色体,DNA,基因片断,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,从基因组,DNA,文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从,cDNA,文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,（三）外源基因与载体的连接,1.,粘性末端连接,方式：,(1),同一限制酶切位点连接,(2),不同限制酶切位点连接,配伍末端连接,非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.,平端连接,适用于：,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,载体自连,目的基因,自连,重组体,3.,同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,4.,人工接头,(linker),连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,。,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,导入受体菌,（五）重组体的筛选,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,原位杂交,Southern,印迹,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶联免疫检测分析等,(,插入失活法,),抗药性标记选择,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补,互补的检测,原位杂交,Southern,印迹,鸡的,肌球蛋白的克隆和检出,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为：,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.,原核表达体系,（,E.coli,表达体系最为常用）,标准：,选择标志强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足,不宜表达真核基因组,DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原,cDNA,的表达和分泌,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系,（,酵母、昆虫、乳类动物细胞）,表达载体,pFASTBACI,的物理图谱,一、疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,二、生,物制药,第三节 重组,DNA,技术与医学的关系,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,基因诊断,(genetic diagnosis),是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,三、基因诊断,基本过程,区分或鉴定,DNA,的异常,分离、扩增待测的,DNA,片断,标准,.,能正确扩增靶基因；,.,能准确区分单个碱基的差别；,.,本底或噪声低，不干扰,DNA,的鉴定,;,.,便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,四、基因治疗,定义,基因治疗,(gene therapy),是向有功能缺陷 的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿 其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗,(germ line gene therapy),1.,产前诊断,2.,携带者测试,3.,症候前诊断,4.,遗传病易感性,五、遗传疾病的预防,1.,什么是,DNA,克隆？什么是限制性核酸内切酶？,应用酶学的方法，在体外将各种来源的,DNA,与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，就称,为,DNA,克隆也称为基因克隆,。,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,【,思考题,】,2.,什么是基因组文库？什么是,cDNA,文库,？,采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体,DNA,切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组,DNA,转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组,DNA,分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体,DNA,片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组,DNA,的集合即称为基因组文库。,以细胞,mRNA,为模板，利用反转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,，再复制成双链,cDNA,片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应,cDNA,的大量克隆，这些克隆就构成了,cDNA,文库。,3.,重组,DNA,过程中所需要的酶主要有哪些？,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,DNA,聚合酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,反转录酶,4.,重组,DNA,技术的基本步骤有哪些？,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,5.,重组,DNA,技术在医学上有哪些应用？,进行致病基因的发现,进行疾病的分子诊断,进行基因治疗,用于发展生物制药,