重组子筛选.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重组子的筛选,并非所有的受体细胞都能导入重组子,DNA,分子,导入外源,DNA,分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组,DNA,的克隆子，必需利用载体、宿主细胞的特性对受体细胞进行,筛选或选择,。,重组子的筛选,导入外源,DNA,分子后能稳定存在的受体细胞称为,转化子,。,含有重组,DNA,分子的转化子称为,重组子,。,如果重组子中含有目的基因，称为,阳性克隆子,，或,期望重组子,。,重组子的筛选,重组子的筛选,将转化处理后的受体细胞接种在,选择培养基,上，培养一定时间，根据菌落生长情况挑选转化子。,在普通培养基中加入适量的某种,选择物,，即为选择培养基。,选择物由载体,DNA,分子上携带的,选择标记基因,所决定，如：抗生素、显色剂。,重组子的筛选,筛选方法主要包括：,1.,抗药性筛选,2.,显色筛选,3.,依据重组子结构特征筛选,抗药性筛选,利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。,氨苄青霉素（,Ap,或,Amp,）,，,bla,基因可以编码,丙酰胺酶，可降解,Ap,氯霉素（,Cm,或,Cmp,）,，,cat,基因编码氯霉素乙酰转酰基酶，使,Cm,乙酰化而失效,卡那霉素（,Km,或,Kan,）,，,Km,抗性基因可以转译一种能修饰,Km,的酶，阻断,Km,对核糖体的干扰。,抗药性筛选,四环素,(,Tc,或,Tet,),，,Tc,抗性基因转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止,Tc,进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。,链霉素,(,Sm,或,Str,),，,Sm,抗性基因转译一种能修饰,Sm,的酶，抑制,Sm,与核糖体结合。,抗药性筛选,抗药性筛选主要用于重组质粒,DNA,转化子的筛选。,正向选择,插入失活则成为负向选择,培养时间不宜过长,，,12,16h,，转化子菌落会降解药物，导致周围药物浓度降低，长出假转化子菌落。,抗药性筛选,插入失活,外源目的基因插入载体后，抑制筛选标记基因的表达。,插入表达,外源目的基因插入载体后，激活筛选标记基因的表达。,在筛选标记基因前连上一段,负调控序列,。,显色筛选,原理：,如果在载体,DNA,上组入,LacZ,，则重组,DNA,分子会在含有,X-gal,和,IPTG,的培养基中得到蓝色的转化子菌落。,由于被转化的基因产物作用于,X-gal,需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。,营养缺陷型筛选,一些参与核苷酸代谢的基因,酵母载体选择标记基因,培养基,依据重组子结构特征进行筛选,凝胶电泳分析：,在转化子筛选的基础上，依据有外源,DNA,片段的重组质粒与载体,DNA,之间的大小差别来区分重组子和非重组子。,1.,在平板上挑选菌落,2.,将菌落放入细菌裂解液，悬浮离心取上清,3.,电泳,优点：,直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。,缺点：,载体可能会与一个以上的外源,DNA,片段连接,依据重组子结构特征进行筛选,限制性核酸内切酶酶切分析：,从转化菌落中挑选菌落，提取质粒，用限制性核酸内切酶进行酶切，然后通过凝胶电泳分析。,优点：,可以判断,DNA,分子插入的方向及分子量的大小。,利用,PCR,方法筛选重组子,外源,DNA,两侧序列多数是已知的,通过两侧序列设计引物，扩增,电泳,噬菌斑筛选,对于,DNA,系统而言，转导受体菌后，转化子被裂解成噬菌斑，而非转化子则能正常生长，两者很容易,区分,。,1.,重组,DNA,必须在野生型,DNA,长度的,78105%,范围内才能成功包装。,2.,空载,DNA,也能正确包装，可以通过筛选标记基因进行筛选。,筛选植物转化细胞,在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因经常称为“,报告基因,”，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达筛选转化细胞。,筛选植物转化细胞,荧光素酶基因,（,LUC,）,:LUC,是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。,荧光素酶可以在植物细胞内正常表达,优点：,检测迅速、灵敏度高、无污染，是一种理想的报告基因。,筛选植物转化细胞,抗除草剂基因,(bar),：,bar,基因编码的酶能够解除非选择性除草剂的毒性,除草剂是一种谷氨酸类似物，强烈抑制谷胺酰胺合成酶，从而导致植物体内氨的积累，并使植物死亡,bar,基因可以将除草剂乙酰化，从而使植物具有除草剂的抗性。,筛选植物转化细胞,葡萄糖酸苷酶,（,GUS,），,GUS,可以催化人工合成的底物,4,甲基伞形花酮，产生一种荧光物质，可用荧光光度计定量测定。,简便快捷、灵敏度高，已被广泛应用与植物基因转化实验，尤其是进行外源基因瞬间表达的系统。,筛选植物转化细胞,氯霉素乙酰转移酶,（,CAT,），,可以催化氯霉素失活，因此，与外源,DNA,共转化的,Cat,基因能使转基因植物具有抗氯霉素的活性。,哺乳动物转基因细胞的筛选,胸苷激酶基因,(TK),二氢叶酸还原酶基因,（,DHFR,）,黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,（,XGPRT,）,这些基因参与核苷酸代谢，缺失后导致营养缺陷。,Thank You,