GA∕T 1618-2019 法庭科学 生物检材中美沙T检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中美沙酮检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for methadone in biological samplesLC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准由起草单位：公安部物证鉴定中心、济南市公安局刑事技术科学研究所。 本标准起草人：栾玉静、王瑞花、董颖、王爱华、任昕昕、王芳琳、常靖、宋歌、董林沛、武继锋、宋蕊。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中美沙酮检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材 （血、 尿、 肝、 肾、 胃及胃内容等） 中美沙酮的液相色谱-质谱 （LC-MS）检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中美沙酮的定性分析和定量分析。 其他可疑样品中美沙酮的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法检测，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水，除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 0.1mol/LHCl 溶液：移取浓盐酸 8.3mL，加水稀释至 1000mL； d) 5mmol/L 甲酸铵溶液（pH 值 3.5）：称取甲酸铵 0.315g，加水溶解并稀释至 1000mL，用甲酸调 pH 值为 3.5； e) 氨水； f) 标准溶液： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据美沙酮标准物质纯度和盐型换算后，称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL 美沙酮标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； GA/T 2 2） 10.0 g/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管； c) 有机系微孔滤膜：0.22m； d) 混合型阳离子交换 （Oasis MCX） 固相萃取柱或其他等效固相萃取柱， 依次用 1mL 甲醇， 1mL水活化。 注：Oasis MCX 固相萃取柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱-质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器； b) 电子天平； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL， 或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g于具盖离心管中。加入0.1mol/L HCl溶液4.0mL，混匀，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中，控制流速为1mL/min，依次用水1mL、甲醇1mL、乙腈1mL淋洗，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱2min， 用氨水/乙腈 （体积比5:95） 混合溶液1mL洗脱， 收集洗脱液置于浓缩器上50下浓缩至干，残留物用初始流动相1.0mL溶解，经有机系微孔滤膜过滤，供仪器分析。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无法取到相似基质样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加美沙酮标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 20ng/mL），与检材平行操作, 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱-质谱仪（离子阱质量分析器）条件 GA/T 3 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：C18色谱柱（2.1mm 150mm，3.5m）或其他等效柱； b) 流动相：A：乙腈，B：5mmol/L甲酸铵溶液（pH值3.5） ； c) 洗脱方式：梯度洗脱条件见表1； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 3.0 90% 10% 8.0 90% 10% 11.0 10% 90% 19.0 10% 90% d) 进样量：10 L； e) 柱温：30； f) 流速：0.3mL/min； g) 离子化模式：ESI+； h) 扫描方式：正离子扫描，采用二级全扫，母离子M+H+=310.2，定量子离子m/z=264.9； i) 鞘气（氮气） ：30arb； j) 辅助气（氮气） ：10arb； k) 喷雾电压：4.5kV； l) 毛细管电压：4.0V； m) 毛细管温度：290； n) 相对碰撞能：35%。 7.1.2.1.2 液相色谱-质谱仪（三重四级杆质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm 50mm,1.7m)或其他等效柱； 注：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱为 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：A：乙腈，B：5mmol/L甲酸铵溶液（pH值3.5）； c) 洗脱方式：梯度洗脱条件见表2； 表 2 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 60% 40% 1.8 60% 40% 2.0 10% 90% 3.5 10% 90% d) 柱温：35； GA/T 4 e) 流速：0.6mL/min； f) 离子源：电喷雾电离（ESI）； g) 检测方式：正离子； h) 毛细管电压：2.8kV； i) 源温度：150； j) 雾化气流速：1000L/h； k) 扫描模式：多反应离子监测（MRM）； l) MS参考条件（定量离子对、去簇电压、碰撞能）：见表3。 表 3 MS 参考条件 中文名称 定量离子对 定性离子 去簇电压 V 碰撞能量 eV 美沙酮 310.31105.04 310.31105.04 24 28 310.31265.18 14 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL5.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g5.0g两份，按7.1.1进行操作。 另取等量相相似基质的空白样品三份， 其中两份添加美沙酮标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(10050)% ），另一份作为空白样品，与检材平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、 空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按 7.1.2.1.2 的分析条件每个样品进样分析23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量： 添样添样添样VMAVMAW= . (1) 式中： W检材样品中目标物质的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（ g/mL） ； GA/T 5 A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值； M添添加样品中标准物质添加量，单位为微克（ g） ； V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL） ； A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值； M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL） ； V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差： %10021=XXXRD . (2) 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； X1、X2两份样品平行定量测定的含量数值； X两份样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致 （相对误差在2.5%之内） 、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 相对离子丰度 50% 20%50% 10%20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。美沙酮相关总离子流图和二级质谱图参见附录A中图A.1、图A.2。本方法美沙酮的检出限参见附录A。 8.2 定量结果评价 如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材样品的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。 美沙酮的中毒诊断参考资料参见附录B。 GA/T 6 附 录 A （资料性附录） 美沙酮的相关图谱 美沙酮的色谱质谱图见图A.1、图A.2。本方法美沙酮的检出限为20ng/mL。 RT: 0.00 - 14.0201234567891011121314Time (min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance8.078.338.719.6410.0210.9811.7012.477.931.911.252.576.5413.250.413.464.317.194.785.63NL: 1.58E7TIC F: + c ESI SRM ms2 310.0035.00 264.50-265.50, 309.50-310.50 MS 100ngdifennuozhi-MST100ngdifennuozhi-MST #507-524RT: 7.93-8.15AV: 6NL: 5.73E6F: + c ESI SRM ms2 310.0035.00 264.50-265.50, 309.50-310.50265270275280285290295300305310m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance264.96310.24 图A.1 美沙酮的HPLC-MS色谱质谱图 24-Aug-201219:28:32st-100ng/mlTime0.501.001.502.002.503.00%01000.501.001.502.002.503.00%010020120824-119MRM of 4 Channels ES+ 310.306 265.18 (Mehadone)4.93e61.4320120824-119MRM of 4 Channels ES+ 310.306 105.035 (Mehadone)2.21e61.43 图 A.2 美沙酮的 UPLC-MS 色谱质谱图 GA/T 7 附 录 B （资料性附录） 美沙酮的中毒诊断参考资料 B.1 理化性质 本品为无色结晶或白色结晶性粉末，溶于水，易溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。m.p.=230234。本品游离碱的 pKa（HB+）为 8.3，1%的水溶液 pH=4.56.5，水溶液不稳定，在光照下变色。 B.2 中毒症状 过量服用药物，可引起呼吸困难或变浅，极度疲劳或嗜睡、视力模糊、思维迟钝、语言行为异常，晕厥、头晕、意识混乱，中度中毒者可出现神志不清，呼之不应，四肢及口唇发绀，皮肤湿冷，体温下降，血压逐渐下降，呼吸变慢，平均每分钟 810 次，瞳孔显针尖样缩小，严重者出现潮式呼吸，甚至呼吸麻痹而致死亡。 B.3 中毒死亡机理 美沙酮为阿片类受体激动剂，主要作用于 受体。美沙酮通过降低呼吸中枢对二氧化碳张力的敏感性和抑制桥脑呼吸调节中枢，产生中枢性呼吸抑制作用，至呼吸麻痹而死亡。 B.4 美沙酮的中毒浓度 美沙酮的中毒血药浓度为2.0mg/L，致死血药浓度大于4.0mg/L。 _