沉默SOCS1对肝细胞癌患者树突状细胞表面抗原及其免疫调控的影响.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷肝细胞癌占原发性肝癌的 95%，居我国恶性肿瘤发病率第 3 位，在全球范围内，每年可造成近100 万人死亡1。切除、移植、化疗栓塞、乙醇注射和冷冻消融术是治疗肝细胞癌的潜在方法，但仅对小且具有局限性的肿瘤有效2。不幸的是，大多数肝细胞癌患者在诊断时已到晚期，目前治疗效果不佳。因此，迫切需要为肝细胞癌研究新的治疗策略。近年来，在癌症治疗中，生物免疫治疗作用越来越突出，抗原提呈细胞之一的树突状细胞（dendritic cell，DC）不仅参与 T 细胞的激活、免疫功能的恢复，并可促进相关细胞因子的释放等过程，从而发挥抗肿瘤效果3。细胞因子信号抑制因子 1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）作为细胞因子信号抑制因子（SOCS）家族的一员，近年来得到广泛关注。SOCS1 不仅参与细胞信号传导，而且参与泛素化介导的蛋白质降解过程，与 DC 分化、T 细胞功能以及肿瘤进展息息相关，这些功能在肿瘤细胞的生长和增殖中都起着重要作用4。微小 RNA-618（micro RNA-618，miR-618）能够调节 DC 以及 T 细胞，作为抗癌免疫治疗的新方法，miR-618 在肝癌中也可能发挥着重要的抑癌因子作用。因此，miR-618 作为 SOCS1的靶向 miRNA，探究其转录调控和相关功能对DC 表面抗原及其免疫调控的影响，对于指导肝细胞癌临床免疫治疗意义重大。1材料与方法1.1材料采集宁夏回族自治区人民医院 2020 年 10月至 2021 年 10 月收治的 60 例肝细胞癌患者的外周静脉血，其中男性 38 例，女性 22 例；年龄52耀75 岁，平均年龄（64.45依4.22）岁。通过淋巴细胞分离液离心得到外周血单核细胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMC）。PBS 缓冲液、Lipofec原tamineR3000 试剂盒、RPMI 1640 培养基和 GibcoOpti-MEM 培养基均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TransScriptR域Green One-Step文章编号：1674-6309（2023）08-0774-05论著收稿日期：2023-03-24基金项目：宁夏自然科学基金项目（2022AAC03366）作者简介：董晓微（1969），主任医师，研究方向为临床免疫检验学。E-mail：通信作者：樊瑞军（1972），硕士，主任技师，研究方向为免疫检验学。E-mail：沉默 SOCS1 对肝细胞癌患者树突状细胞表面抗原及其免疫调控的影响董晓微，郭东，柳斌，张俊华，樊瑞军（宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心，银川750002）摘要：目的分析沉默细胞因子信号抑制因子 1（SOCS1）对肝细胞癌患者树突状细胞表面抗原及其免疫调控的影响。方法采集宁夏回族自治区人民医院 2020 年 10 月至 2021 年 10 月收治的 60 例肝细胞癌患者的外周静脉血，通过淋巴细胞分离液离心得到外周血单核细胞，进行相关细胞表面标志物水平、SOCS1 蛋白表达、树突状细胞表面抗原及树突状细胞上清液中细胞因子水平检测。结果流式细胞术检测 CD3+细胞约占 94%，CD3+CD4+细胞约占 36%，而 CD3+CD8+细胞约占 52%。CD1a 和 CD83 分别为树突状细胞特异性和成熟的细胞标记物，CD1a+细胞约占 93%，CD1a+CD83+细胞约占 85%。在诱导 0、1、3 d 时 miR-618 表达水平无明显变化，在第 5、7 天 miR-618 表达水平均降低（P均约0.05）。双荧光素酶系统表明，miR-618 与SOCS1 表达具有靶向调控作用（P约0.05）。miR-618 过表达后，SOCS1 蛋白表达量低于 mimic NC 组（P约0.05）。与各对照组相比，miR-618 mimic 组和 SOCS1 shRNA 组 CD11c、HLA-DR 和 CD86 阳性细胞均增多（P均约0.05），CD4 阳性细胞无明显变化（P跃0.05）。miR-618 mimic+sh-SOCS1 组 CD11c、HLA-DR、CD86 阳性细胞数均增多（P均约0.05）。与各对照组相比，miR-618mimic 组和 shRNA-SOCS1 组 TNF-酌、IL-12 和 IFN-琢 表达水平均上升（P均约0.05），miR-618 mimic+sh-SOCS1 组上述因子均增加（P均约0.05）。结论沉默 SOCS1 可以促进肝细胞癌患者树突状细胞活化，提高其免疫调控能力。关键词：肝细胞癌；细胞因子信号抑制因子 1；树突状细胞；抗原；免疫中图分类号：R735.7文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.08.003第 45 卷8 期2023 年 8 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University774窑窑8期RT-qPCR、SuperMix 试剂盒、TRIzol 试剂盒、RI原PA 裂解液、BCA 试剂盒、白细胞介素（interleukin，IL）12、干扰素-琢（interferon-琢，IFN-琢）和肿瘤坏死因子-酌（tumor necrosis factor-酌，TNF-酌）、E蕴陨杂粤试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；HEK-293T 细胞来自国家中心细胞库，所有序列均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；所有抗体均购自美国 Abcam 公司；pmirGLO 质粒、质粒提取试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司；FC 500 MCL 型五色流式细胞仪、7500 型全自动 PCR 仪及 UniCel DxI 800 型全自动化学发光免疫分析仪均购自美国 Beckman 公司。1.2方法1.2.1DC 孵育在 RPMI 1640 全培养基中培养PBMC，第 2 天去原培养液，加入等量含有 IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）与肝细胞癌细胞裂解液的新培养液继续孵育约 7 d，在其分化成未成熟的 DC 时去原培养液，更换等量IFN-琢 的培养液，孵育至第 9 天时获得成熟的 DC。1.2.2T 细胞孵育使用含 10%牛血清的培养液将细胞 PBMC 配成计数为 4伊107个/mL。使用37 益培养液洗涤尼龙毛柱，以约 6 滴/min 放出Hanks 液，在尼龙毛柱中加入 0.5 mL 的 PBMC 悬液后，马上加 0.2 mL 培养液后封闭塑料管，放入CO2培养箱中使 PBMC 充分黏附尼龙毛柱，约培养 60 min。接着用 5 mL 培养液洗脱尼龙毛柱并收集，2 500 r min-1离心 8 min，去上清，继续常规孵育。1.2.3分组与转染根据 LipofectamineR3000说明书，将 DC 转染和细胞培养后进行分组：仅含 mimic 脂质体阴性对照组（mimic NC 组）、仅含miR-618 mimic 脂质体组（miR-618 mimic 组）、仅含 SOCS1 shRNA 质粒脂质体组（sh-SOCS1 组）、仅含 shRNA NC 质粒脂质体对照组（shRNA-NC组）、含 SOCS1 shRNA 与 miR-618 mimic 脂质体组（miR-618 mimic+sh-SOCS1 组）。1.3检测方法1.3.1相关细胞表面标记物水平的检测首先将培养基重悬细胞配成计数为 2伊106个/mL。接着在流式细胞管中分别加入 50 滋L 的 CD3 抗原提呈细胞（CD3-APC）、CD4 异硫氰酸荧光素（CD4fluorescein isothiocyanate，CD4-FITC）或 CD8 藻红 蛋 白（CD8 phycoerythrin，CD8-PE）以 及 相应的50 滋L 细胞，混匀后冰浴 20 min。在 4 益下2 500 r min-1离心 8 min，去上清，加入 500 滋LPBS 吹洗，重复 2 次。最后加入 400 滋L PBS，使用FC 500 MCL 型五色流式细胞仪分析结果。1.3.2沉默 SOCS1由生工生物工程（上海）股份有限公司合成野生型 SOCS1 及突变型 3 UTR，随后将其克隆到含荧光素酶报告基因 pmirGLO上游，提纯备用。按 LipofectamineR3000 说明书将对照序列 miR-618 mimic 和阴性转染至 HEK-293T 细胞，孵育 48 h 后收获细胞。检测细胞的相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶值/海肾荧光素酶值）。1.3.3miR-618 表达量用 TRIzol 试剂盒提取DC 中总 RNA。用焦碳酸二乙酯（diethyl pyro原carbonate，DEPC）溶解 RNA，使用 7500 型全自动荧光定量 PCR 仪测量 260 nm 和 280 nm 下吸光值，测定总 RNA 含量。使用 RT-qPCR SuperMix试剂盒及 PCR 仪扩增测定（上游引物：5-GGGGAAACTCTA-CTTGTCCTT-3，下游引物：5-TCGTATCCAGTGC-GTGTCGT-3）。依据试剂盒说明书完成反应体系与反应条件，miR-618表达水平用 2原驻驻Ct法分析。1.3.4SOCS1 蛋白表达将 DC 培养基弃液，PBS 洗涤 2 次，加入含 1 mmol L-1苯甲基磺酰氟的 RIPA 裂解液，在冰上孵育 5 min。随后 4 益下10 000 r min-1离心 4 min。使用 SDS-PAGE 凝胶电泳在聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上测定蛋白浓度。室温下，在摇床上使用含 5%牛血清蛋白的 Tris 盐缓冲液+TBST 缓冲液封闭1h。弃液，以 GAPDH为内参，加入鼠一抗SOCS1，转膜后 4 益冰箱中放置 12 h。随后用TBST 冲洗，加入山羊抗鼠 IgG 二抗，在 4 益培养箱中孵育约 5 h。PVDF 与化学发光液反应 60 s，曝光后，采用 Image J 软件分析蛋白相对表达量。SOCS1 蛋白质的相对表达量=目标带灰度值/内参照带灰度值。1.3.5DC表面抗原检测 将含DC的培养液与CD4-APC、CD11c-FITC、CD86-PE 分别加入 Falcon管，2 500 rmin-1离心 15 s，标记 DC 后避光孵育15 min，随后添加 100 滋L 生理盐水，2 500 r min-1离心 90 s，将沉淀细胞转移至流式管，在流式细胞仪中检测，记录结果。1.3.6DC 上清液中细胞因子水平4 000 r min-1离心 15 min 后收集 DC 上清液，采用酶联免疫吸附试验法，按照对应的细胞因子试剂盒说明书操作，将其标准品梯度稀释后，制作标准曲线，调董晓微，等.沉默 SOCS1 对肝细胞癌患者树突状细胞表面抗原及其免疫调控的影响775窑窑宁夏医科大学学报4缘卷零，标准品为 X 轴，吸光度为 Y 轴，绘制标准曲线，计算测定 IL-12、IFN-琢 和 TNF-酌 水平。1.4统计学方法采用 SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数依标准差（x依s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用 Dunnett-t 检验。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1光镜下观察 DC经裂解液处理后，DC 呈现聚集状态，多为圆形，失去树突状外观，细胞膜光滑且清晰，少数为星形，周围存在长短不等的突起，仍呈现梭形，见图 1。图 1光镜下观察 DC（40）2.2DC 表面抗原分析采用流式细胞术检测 DC 表面抗原情况。其中含 CD3+的细胞约占 94%，提示分离 DC 表面抗原的 T 细胞纯度较高。进一步分析，CD3+CD4+细胞约占 36%，而 CD3+CD8+细胞约占 52%。CD1a+和 CD83+分别为 DC 特异性和成熟的细胞标记物，CD1a+细胞约占 93%，CD1a+CD83+细胞约占85%。2.3DC 中 miR-618 表达情况比较在 DC 诱导第 0、1、3、5、7 天后进行 miR-618表达水平比较，结果显示，诱导 0、1、3 d 时 miR-618 表达水平无明显变化，但经多种抗原刺激后，在第 5、7 天 miR-618 表达水平均比第 0 天降低（P 均约0.05），见图 2。*时间/d013571.00.80.60.40.20.0与第 0 天相比*P0.05。图 2DC 中 miR-618 表达情况2.4miR-618 靶向沉默 SOCS1 表达双荧光素酶系统表明，miR-618 与 SOCS1 表达存在靶向调控（P约0.05），见图 3A。miR-618 过表达后，SOCS1 蛋白表达低于 mimic NC 组（P约0.05），见图 3B、图 3C。2.5沉默 SOCS1 促进 DC 活化成熟 DC 表面抗原 CD4、CD11c、CD86、HLA-DR 的表达水平的结果表明，与各对照组相比，miR-618 mimic 组和 shRNA-SOCS1 组 CD11c、HLA-DR 和 CD86 的阳性细胞均增多（P 均约0.05），CD4 阳性细胞无明显变化（P跃0.05）。miR-618 mimic+sh-SOCS1 组 CD11c、HLA-DR、CD86的阳性细胞数均增多（P 均约0.05），见图 4。A.miR-618 靶向沉默 SOCS1 相对荧光素酶活性表达；B.miR-618 靶向沉默 SOCS1 蛋白表达；C.miR-618 靶向沉默SOCS1 相对蛋白活性表达；与 mimic NC 组相比*P0.05。图 3miR-618 靶向沉默 SOCS1 表达情况*ABCmimic NC 组miR-618 mimic 组SOCS1GAPDH37 kDa32 kDa1.21.00.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.0776窑窑8期2.6沉默 SOCS1 促进 DC 中细胞因子分泌与各对照组相比，miR-618mimic 组和 shRNA-SOCS1 组 TNF-酌、IL-12 和 IFN-琢 表达水平均上升（P均约0.05），miR-618 mimic+sh-SOCS1 组上述因子均增加（P 均约0.05），见图 5。6004002000mimic NC 组miR-618 mimic组shRNA-NC组shRNA-SOCS1组miR-618 mimic+sh-SOCS1组TNF-酌IL-12IFN-琢*#*#*#*#*#*#与 mimic NC 组相比*P0.05；与 shRNA-NC 组相比#P0.05。图 5沉默 SOCS1 促进 DC 中细胞因子分泌3讨论SOCS1 是 SOCS 家族的原型分子，作为负反馈调节的一部分，通过直接抑制酪氨酸激酶和激活的细胞因子受体的信号级联来下调细胞因子信号，减弱细胞因子启动的信号转导5-6，SOCS1还通过直接和间接机制下调 Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号7，多种人类癌症中检测到肿瘤细胞中SOCS1 的异常表达，这与细胞因子受体和 TLR 信号的失调有关。对肿瘤细胞中SOCS1 功能的研究揭示了其在致癌中的重要作用8。DC 是最有效的抗原呈递细胞，是调节和维持对肿瘤细胞免疫应答的核心9。作为抗原的来源，全蛋白、肿瘤细胞裂解物（TCL）、HLA 限制性肽、RNA 或杂交细胞可以通过 DC 呈递给 T 淋巴细胞10。有研究11-12阐述了 TL 脉冲自体 DC 免疫治疗黑色素瘤、肾细胞癌、儿童实体瘤和卵巢癌。miRNA 参与了 DC 的分化，与肿瘤的免疫调控有关，将 miRNA 作为靶点进而增强 DC 的免疫功能。本研究结果显示，miR-618 在 DC 诱导期间表达下调。细胞因子与细胞表面的特定受体结合，将生物信息传递给靶细胞，与之相关的信号通路控制和调节基本的生物学过程，包括造血、炎症、免疫和肿瘤的发展13-14。SOCS1 可能在调节肿瘤生长和增殖中发挥作用15。对 SOCS1 缺陷小鼠的研究证实了 SOCS1 在调节 CD8+T 细胞稳态中的关键作用16。在胸腺中，SOCS1 可防止阳性选择失败的胸腺细胞存活和扩张，确保阴性选择，并防止其向 CD8 谱系的不当发育倾斜。SOCS1 不仅能控制 T 细胞刺激性细胞因子的产生，还能降低CD8+T 细胞对协同细胞因子刺激和抗原非特异性激活的敏感性。由于 CD8+T 淋巴细胞的细胞因子刺激增加了其对低亲和力 T 细胞受体（T cellreceptor，TCR）的敏感性，SOCS1 可能通过抑制由炎性细胞因子驱动的异常 T 细胞活化来促进外周T 细胞耐受17。Rossato 等18发现，系统性硬化浆细胞样 DC 中 miR-618 的表达较健康对照组低，其可能是对免疫系统稳态进行调节的重要靶点。本研究证实，SOCS1 功能的发挥受靶向 miRNA 的调控，而沉默 SOCS1 在肝细胞癌免疫调节中具有重要价值。SOCS1 还可通过调节 DC 的产生、成熟、抗原呈递、共刺激信号和细胞因子的产生来调节其对 T 细胞的激活作用19。SOCS1 对 T 细胞、T 调节细胞和 DC 的上述调控机制可共同协助免疫耐受并预防自身免疫发生。另外，在 DC或 CD8+T 细胞中沉默 SOCS1 能有效地刺激抗肿瘤免疫。SOCS1 还可通过调节致癌信号转导途径在癌细胞中起抑癌作用20，它可以被细胞信号因子调节，SOCS1的启动子包含 STAT 结合区，STAT结合区域可以被STAT信号因子调节20。促红细胞生成素（EPO）刺激下调 EPO 应答细胞系中GFI1B 的表达，从而激活 SOCS1。SOCS1 也可由其他细胞因子诱导，如 IL-6、IL-4、IL-12、IL-13、TNF-酌、IFN-琢/茁 等。事实上，细胞因子介导的信号丢失可能导致效应器功能受损和耐受诱导。其他几种细胞因子包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17 和 IL-21 也有助于细胞增殖、分化、获得不同的效应器功能、防止衰竭和记忆细胞的产生21。本研究也发现，过表达 miR-618 或沉默 SOCS1 能董晓微，等.沉默 SOCS1 对肝细胞癌患者树突状细胞表面抗原及其免疫调控的影响与 mimic NC 组相比*P0.05；与 shRNA-NC 组相比#P0.05。图 4沉默 SOCS1 促进 DC 表面抗原表达9060300mimic NC 组miR-618 mimic 组shRNA-NC 组shRNA-SOCS1组miR-618 mimic+sh-SOCS1 组CD11cHLA-DRCD86CD4*#*#*#*#*#*#*#*#*#777窑窑宁夏医科大学学报4缘卷够促进 DC 中 TNF-酌、IL-6 和 IFN-琢 等细胞因子的表达。综上所述，沉默 SOCS1 可以促进肝细胞癌患者 DC 活化，提高其免疫调控能力。参考文献：1 Yu ZX，Wu MT，Huang YS，et al.Single-componentlipid nanoparticles for engineering SOCS1 gene-si原lenced dendritic cells to boost tumor immunotherapyJ.Biomater Sci，2023，11（1）：263-277.2Li SS，Yang M，Chen YP，et al.Dendritic cells withincreased expression of suppressor of cytokine signal原ing 1（SOCS1）gene ameliorate lipopolysaccharide/d-galactosamine-induced acute liver failure J.Mol Im原munol，2018，101（1）：10-18.3 宋浩杰，宋琴，施为建，等.沉默 SOCS1 基因对人树突状细胞生物学特征和功能的影响 J.热带医学杂志，2021，21（2）：152-155.4 Yang ZT，Zhu H，Zhang L，et al.DNA methylation ofSOCS1/2/3 predicts hepatocellular carcinoma recur 原rence after liver transplantation J.Mol Biol Rep，2020，47（3）：1773-1782.5 Lin L，Chen SY，Wang H，et al.SPTBN1 inhibits in原flammatory responses and hepatocarcinogenesis via thestabilization of SOCS1 and downregulation of p65 inhepatocellular carcinoma J.Theranostics，2021，11（9）：4232-4250.6 Zhu H，Zhao HZ，Xu SB，et al.Sennoside A alleviatesinflammatory responses by inhibiting the hypermethy原lation of SOCS1 in CCl4-induced liver fibrosisJ.Pharmacol Res，2021，174（1）：105926.7 Wang Y，Lu C，Huang H，et al.A lipid-soluble extractof Pinellia pedatisecta Schott orchestrates intratumoraldendritic cell-driven immune activation through SOCS1signaling in cervical cancer J.J Ethnopharmacol，2021，267（1）：112837.8 Wahid B.Role of SOCS1 gene in chronic hepatitis Cvirus patients：A mini-review J.J Interf Cytokine Res，2020，40（9）：454-459.9 Hu ZW，Wen YH，Ma RQ，et al.Ferroptosis driver SOCS1and Suppressor FTH1 independently correlate with M1and M2 macrophage infiltration in head and neck squa原mous cell carcinoma J.Frontiers in Cell and Devel原opmental Biology，2021，9（1）：727762.10 樊国华，李悦，袁泽婷，等.树突状细胞在肿瘤中的研究进展 J.临床肿瘤学杂志，2020，25（1）：86-90.11 Ying J，Qiu XY，Lu Y，et al.SOCS1 and its potentialclinical role in tumor J.Pathol Oncol Res，2019，25（4）：1295-1301.12 Liao SX，Chen 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Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region，Yinchuan750002，China）Abstract：ObjectiveTo analyze the effect of silencing suppressor of cytokine signaling 1（SOCS1）on dendriticcell surface antigen and its immune regulation in patients with liver cancer.MethodsThe peripheral blood of60 patients with liver cancer in People s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region from October 2020 toOctober 2021 were collected.Peripheral blood mononuclear cells were obtained by lymphocyte separationsolution centrifugation，and the levels of related cell surface markers，SOCS1 protein expression，dendritic cellsurface antigen detection，and cytokine levels in dendritic cell supernatant were detected.ResultsFlowcytometry detected about 94%of CD3+cells，36%of CD3+CD4+cells，while about 52%of CD3+CD8+cells.CD1a and CD83 were dendritic cell-specific and mature cell markers，respectively，with about 93%of CD1a+cells and 85%of CD1a+CD83+cells.There was no significant change in miR-618 expression levels at induction0，1 and 3 d.The miR-618 expression levels were significantly lower on days 5 and 7 compared to the previousdays（P all0.05）.The dual luciferase system demonstrated a targeting regulatory relationship between miR-618and SOCS1 expression（P0.05）.miR-618 overexpression resulted in significantly lower SOCS1 proteinexpression than mimic NC（P0.05）.Compared with each control group，CD11c，HLA-DR and CD86 positive cellswere significantly increased in miR-618 mimic group and SOCS1 shRNA group（P all0.05）.The numbers of CD11c，HLA-DR，CD86 positive cells weresignificantly increased in miR-618 mimic+sh-SOCS1 group（P all0.05）.The expression levels of TNF-，IL-12 and IFN-were significantly increased in the miR-618 overexpression group and SOCS1 silencinggroup compared with the control of each group（P all0.05），and the increase of the above factors were moresignificant in the miR-618 mimic+sh-SOCS1（P all0.05）.ConclusionSilencing SOCS1 could promote theactivation of dendritic cells in patients with liver cancer and improve their immune regulation ability.Key words：liver cancer；suppressor of cytokine signaling 1；dendritic cell；antigen；immune（上接第 778 页）intensity of Cy3 in targeted nanoparticles combined with ultrasound-microbubble group was 3.98 times higherthan that in siRNA group（P0.001），1.71 times higher than that in non-targeted NPs group（P0.001），and1.39 times higher than that in targeted NPs group（P0.001）.Measured by CCK-8 method，the cell survival rate ofHDPsiRNA NPs group was still higher than that of DPsiRNA NPs group when the concentration of siRNAwas 100 nmol L-1and 150 nmol L-1（P0.05）.After regular administration,there were no signifi-cant difference in body weight and basic indexes of heart，kidney and liver function in mice（P all0.05），and noabnormal damage was found in main organs by serum biochemical test.ConclusionThe successfully preparednano-particle nucleic acid delivery vector（HDPsiRNA NPs）modified by hyaluronic acid had high biologicalsafety，and its transfection efficiency was further improved by ultrasound-microbubble mediation，which had thepotential to be used as a new type of nucleic acid delivery carrier.Key words：nanoparticle nucleic acid delivery carrier；siRNA；hyaluronic acid；ultrasound-microbubble陶宏宇，等.透明质酸修饰纳米粒在超声-微泡介导下的体外靶向性与安全性评价791窑窑