采用GFP标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA.pdf

中国兽医杂志():采用 标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒 基因表达的 张志彬 张 健 贺 明 高倍瑶 贾 琪 张立春(吉林省农业科学院 吉林 公主岭 吉林农业大学动物科技学院 吉林 长春 延边大学农学院 吉林 延吉)摘要:为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒()的小干扰()本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与 设计分析筛选出潜在抗多血清型 位点通过体外合成 型、型和 型病毒部分基因序列制备绿色荧光蛋白()基因融合表达载体将化学合成的 与融合表达载体共转染通过 观察、和实时荧光定量反转录()方法检验目标 对融合基因的抑制效率 生物信息分析发现多血清型口蹄疫病毒 基因高度保守并存在潜在 作用靶位 融合表达载体成功构建与化学合成的 共转染 细胞 观察发现 可有效抑制来源于 型、型和 型 基因的 荧光信号且持续时间达 检测证实此结果 检测发现 对 个 融合基因转录水平抑制效率超且作用可维持 本试验利用 作为筛选标记成功筛选出 个作用于 基因的 为开发多血清型口蹄疫抑制剂提供参考依据关键词:小干扰()口蹄疫()绿色荧光蛋白()多血清型 基因中图分类号:文献标志码:文章编号:()():()().().().:()()():收稿日期:基金项目:转基因生物新品种培育重大专项()吉林省自然科学基金()作者简介:张志彬()男助理研究员本科从事生猪遗传育种工作:通信作者:张立春:口蹄疫()是由口蹄疫病毒()引起的一种致偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病是世 界 动 物 卫 生 组 织()疫病名录收录的重要动物传染病之研 究 论 文 卷一同时位列我国农业农村部第 号公告所修定的一、二、三类动物疫病病种名录中一类传染病第 位 对世界畜牧经济具有巨大威胁素有“政治经济病”之称 由于 血清型、亚型众多各血清型/亚型间交叉免疫原性差 同时 作为小 病毒其基因组突变率高病毒流行株更迭迅速致使疫苗免疫预防策略并不能完全抑制 的暴发 干扰()作为新型病毒治疗策略在诸如乙型肝炎病毒()、丙型肝炎病毒()、人类免疫缺陷病毒()、新型冠状病毒()等病毒感染治疗中得到广泛应用研究表明采用 技术抑制 复制和增殖的效果明显 但鉴于 血清型和基因型的复杂性通过设计少数小干扰()即达到抑制全部 分离株目标的技术难度较大 本试验通过对 数据库全部 分离株全基因组序列分析设计合成靶向 型、型和 型 基因保守区的采用绿色荧光蛋白()作为筛选标记成功筛选出 个能够快速且特异地抑制 种血清型 基因表达的为研制出高效、广谱的抗 的生物工程制剂提供科学依据 材料与方法 质粒、细胞和菌株质粒、细胞、大肠杆菌()菌株均由吉林省农业科学院动物生物技术研究所保存克隆载体 购自宝生物工程(大连)有限公司 酶类、试剂及仪器设备 连接酶、限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司、脂 质 体()均 购 自 公司 凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁公司无内毒素质粒提取试剂盒购自 公司 荧光显微镜为 型荧光定量 仪为罗氏 型 多血清型 基因 的设计与合成 从 数据库中下载所有 型、型和 型 分离株的全基因组序列信息采用 软件进行序列同源比对分析遴选出各血清型所有 分离株基因组序列高度保守区域 以此区域作为潜在靶位采用 公司 在 线 设 计 软 件 (:/)设计出 条 命名为 同时设计随机(序列为)作为阴性对照 序列委托上海吉玛制药技术有限公司进行体外合成合成序列 末端添加 寡核苷酸 多血清型 基因的合成与 融合基因表达载体的构建 参照 型、型和 型 基因组保守区序列委托南京金唯智生物科技有限公司人工合成 型分离株/(登录号:)、型分离株/(登录号:)和 型分离株 /(登 录 号:)基因片段长度为 合成片段两侧分别添加 和 酶切位点 双酶切处理 和 基因克隆质粒胶回收纯化后用 连接酶连接并进行转化 阳性克隆经酶切和测序鉴定以确定所构建的 表达载体的正确性 经鉴定正确的质粒采用无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取 保存 和 共转染 细胞 采用脂质体转染法进行简要操作步骤:待 细胞生长至 后 孔板每孔加入质 粒 将 化 学 合 成 的 与 培养基 混合(终浓度为/)与 培养基 混合室温孵育 将上述两混合液混匀室温孵育 后滴加入转染孔转染后 更换培养液为完全培养液 同时设置不添加任何 的 载体作为空白对照组()添加 特异性 作为阳性对照组()添 加 随 机 作 为 阴 性 对 照 组().观察 对 基因表达的抑制效果 转染后、和 随机选取转染细胞视野采用 荧光倒置显微镜观察 荧光强度并进行拍照记录判定 对 种血清型 基因的表达抑制效果 检测 对 基因表达的抑制效果荧光显微镜观察各组细胞后去除细胞培养上清液用无菌 缓冲液清洗细胞 次收集转染细胞采用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白经 电泳后湿转法将蛋白转移 期张志彬等:采用 标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒 基因表达的 至 膜上 膜经 脱脂奶粉封闭鼠源 单克隆抗体 孵育过夜 标记的羊抗鼠抗体()室温反应 最后用 法显色检测 的表达情况 以人 蛋白作为内参对照 法验证 对 基因表达的抑制效果于转染后 收集各组转染细胞 法提取细胞总 并合成 实时荧 光 定 量 反 转 录 ()采 用 染料法检测 融合基因表达其中上游检测引物位于 基因为公共引物序列:下游检测引物位于 基因其中 型检测引物:型 检 测 引 物:型检测引物:内参基因为人类 上 游 引 物:下游引物:的检测程序为两步法扩增具体条件:预变性 共计 个循环其中在 收集荧光信号 数据处理采用 自带软件采用 法计算各组 融合基因的相对表达量 结果 多血清型 基因 的设计与合成 将 中具有全基因组序列信息的不同血清型 分离株全基因序列用 软件进行序列分析结果显示不同血清型 分离株全基因组序列同源性在 以上其中 基因保守性较高局部区域同源性在 以上符合试验设计要求 以 基因保守区为作用靶点设计序列为 命名为 靶位及 种血清型 基因保守区序列比对结果见图 图 型、型和 型 分离株 基因部分序列比对及 靶位.多血清型 基因的合成与 融合 基 因 表 达 载 体 的 构 建 人 工 合 成 型()、型()和 型()口蹄疫病毒 基因部分片段(合成片段及序列见图)将合成片段插入 载体中构建 融合表达载体 载体构建酶切鉴定结果见图 同时阳性质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序结果表明融合表达载 体 构 建 成 功 分 别 命 名 为、观察和 检测 对 基因表达的抑制效果脂质体转染法将 真核表达载体与 共转染 细胞转染后、和 进行荧光观察通过 发光强度判断 对融合蛋白表达的抑制效率 结果显示空白对照组、阳性对照组和阴性对照组结果完全符合预期与空白对照组比图 不同血清型口蹄疫病毒 基因 融合表达载体酶切鉴定 :较 对 种血清型 融合蛋白均有较高的抑制效率(图)说明 对研 究 论 文 卷 种血清型 基因具有较高的抑制效率 检测结果同样显示在添加 的试验组中均不能检测出 融合蛋白的表达(图)进一步证明 具有较高的抑制效率 检测结果与 观察结果相似该蛋白抑制效果均可持续 说明 对 种血清型 分离株 基因表达抑制的高效性图 对不同血清型口蹄疫病毒 融合蛋白荧光信号的抑制效果.图 检验 对不同血清型口蹄疫病毒 融合蛋白表达抑制效果.法验证 对 融合基因转录抑制作用提取细胞总 采用 方法验证 对不同血清型 融合基因转录的抑制效果 检测结果显示 对 种血清型 融合基因的表达抑制效率均在以上(图)个别时间点抑制效率可达 以上说明 对 种血清型 融合基因 具有极强的抑制效果图 检验 对不同血清型口蹄疫病毒 融合基因转录抑制效果.期张志彬等:采用 标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒 基因表达的 讨论我国幅员辽阔口蹄疫地理分布和血清型流行状况极为复杂表现为猪、牛、羊等所有偶蹄目均具有易感性以及多种 型、型和 型 流行株并存的特点 疫苗接种可有效抑制病毒大规模暴发但很难从根本上清除口蹄疫流行 研究表明 技术在治疗包括口蹄疫在内的病毒性疾病方面具有广阔的应用前景 因此本试验针对我国 型、型和 型 流行株并存的现状设计 种血清型 保守基因靶向 并以 作为筛选标记通过体外筛选方法成功获得可有效抑制多血清型 增殖的 为开发长效、广谱口蹄疫抑制剂提供科学依据鉴于 流行株众多、基因突变率高等特点 靶位一般选择在病毒基因高度保守区以提高抗病毒的广谱性 目前针对 保守基因如、等基因所设计的 均取得了较好的病毒抑制效果本试验通过比对 数据库中所有 全基因组序列信息发现不同血清型 分离株全基因组序列同源性在 以上其中 基因部分区域同源性甚至高达 以上因此筛选作用于多血清型 基因保守区的 具有可能性 根据 的设计标准本试验预测发现仅有极少数 基因保守区符合 靶点的标准故 靶位并未完全定位于基因保守区(图)其中与 型 候选株()序列完全相 同 但 与 型()和 型()候选株序列第 位存在 突变 无论从 荧光强度还是 融合基因转录均证明该突变并未对 的抑制效果造成明显的干扰说明某些靶点核酸多态性对 的病毒抑制功能影响并不显著本试验采用构建 与 基因融合表达的方式研究 对不同 基因的抑制作用可有效避免 体外培养所带来的生物安全问题 尽管从理论上讲 融合基因在基因转录和翻译水平与真实病毒基因转录和翻译并无差别但体外 抑制病毒基因表达的试验结果尚不能直接表明该 对病毒体内复制和增殖具有抑制作用还需要进一步试验证明参考文献:殷震刘景华.动物病毒学.北京:科学出版社:.冯雪领.对西欧发达国家暴发和蔓延口蹄疫的几点思考.河北畜牧兽医():.口蹄疫病毒适应性生存:变异与维稳的统一.中国预防兽医学报():.赵荣荣韩秋菊张建.技术靶向 相关宿主因子治疗慢性乙肝的研究进展.生物化学与生物物理进展():.():.():.():.():.胡亚.口蹄疫的流行病学、流行情况及疫苗的作用.兽医导刊():.邓光明.口蹄疫流行态势及国家防控策略.兽医导刊():.:.():.():.:.():.