柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能及CARDS TX_NLRP3信号通路的影响.pdf

柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能及 信号通路的影响黄 方，许 诣，杨 雪，汪枝繁，王 静，沈文婷，陈 霞湖北文理学院附属医院（襄阳市中心医院）儿科，湖北 襄阳 收稿日期：基金项目：湖北省自然科学基金项目（）作者简介：黄 方（），女，硕士，副主任医师，研究方向为儿科疾病诊疗。：，：通信作者：陈霞（），女，硕士，主治医师，研究方向为儿科疾病诊疗。：，：摘要：目的 探究柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎模型小鼠肺功能以及 信号通路的影响。方法 只小鼠分为对照组，肺炎组，柴葛芩连汤低、高剂量组和阿奇霉素组。鼻腔滴注解脲脲原体菌液进行造模，柴葛芩连汤低、高剂量组灌胃 、柴葛芩连汤；阿奇霉素组灌胃 阿奇霉素溶液 个周期（周期为 ，前 连续灌胃阿奇霉素溶液，后 灌胃等量蒸馏水）；对照组和肺炎组灌胃等量蒸馏水，连续 。采用动物肺功能分析仪检测肺功能，法检测肺泡灌洗液中炎症因子水平，染色观察肺组织病理变化，和 法检测肺组织肺炎支原体外毒素（）、炎症小体（）、凋亡相关斑点样蛋白（）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（）的 和蛋白表达。结果与对照组比较，肺炎组小鼠、降低（），、水平及 、和蛋白表达均升高（），肺泡结构模糊，有炎性细胞浸润；与肺炎组比较，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠、与 升高（），、水平及 、和蛋白表达均降低（），肺组织病理变化有不同程度缓解。结论柴葛芩连汤可以改善解脲脲原体肺炎小鼠受损的肺功能，该作用可能与抑制 信号通路有关。关键词：柴葛芩连汤；肺炎；解脲脲原体；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（），：，；（，）；年 月第 卷 第 期中 成 药 ；（），（），（）（），（），（），（），（），：；解脲脲原体也称溶脲脲原体，是原核微生物，属革兰氏阴性菌，常寄生在成年女性生殖道内，通常不具有致病性，但当妊娠女性分娩时，会感染新生儿呼吸道，造成肺炎、肺衰竭甚至导致肺组织发育异常。儿科临床上一般采用静脉注射大环内酯类药物如阿奇霉素、罗红霉素和克拉霉素等进行治疗，但对于 个月以下的患儿，这类药物的安全性和实际药效尚未明确，可能会导致过敏反应，严重的会产生休克，并且该类药物长期使用会导致菌株耐药性增加，降低疗效。柴葛芩连汤出自中医著作 症因脉治，由柴胡、干葛根、黄芩、川黄连等组成，具有清热、消炎、提高免疫力的功效。本研究建立解脲脲原体感染致肺炎的小鼠模型，研究柴葛芩连汤对该模型小鼠肺功能的影响，并对其作用机制进行初步探究，以期为中医临床治疗小儿解脲脲原体肺炎提供实验参考。材料 实验动物 周龄健康 小鼠 只，雌雄不限，体质量（），购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号（沪），实验动物使用许可证号（鄂）。小鼠于室温下适应性饲养，实验经华中农业大学实验动物伦理委员会批准（编号）。仪器（）型动物肺功能分析系统购自北京贝兰博科技有限公司；型定量 仪购自美国 公司；型多功能酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司；型生物光学显微镜购自苏州阿尔法生物实验器材有限公司；型高速冷冻离心机购自北京时代北利离心机有限公司；型电子天平购自德国赛多利斯公司。试剂与药物 柴胡、干葛根、黄芩、川黄连、金银花购自襄阳市中心医院门诊药房，经襄阳市中心医院夏宁副主任药师鉴定为正品。阿奇霉素（国药准字，批号）购自辉瑞制药有限公司。解脲脲原体标准株（效价 ）由中国科学院皮肤研究所提供。、酶联免疫吸附（）试剂盒（批号、）购自武汉菲恩生物科技有限公司；极速 提取试剂盒（批号）购自哈尔滨新海基因检测有限公司；反转录试剂盒与 （）扩 增 试 剂 盒（批 号）购自北京启衡星生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒（批号）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔抗小鼠 、单克隆抗体，辣根过氧化物酶（）标记山羊抗兔二抗（批号、）购自英国 公司。方法 分组与造模 只小鼠随即分为对照组，肺炎组，柴葛芩连汤低、高剂量组和阿奇霉素组，每组 只，除对照组外，其余组小鼠均建立解脲脲原体肺炎模型。小鼠腹腔注射 戊巴比妥钠进行麻醉，向鼻孔中滴注 解脲脲原体菌液（），停留 待菌液随小鼠呼吸流入气管；对照组小鼠则滴加等体积生理盐水，每天 次，连续 。药物制备称取柴胡 、干葛根 、黄芩 、川黄连 、金银花 ，冷水没过药材浸 年 月第 卷 第 期中 成 药 泡 ，煎煮 次，每次 ，过滤，合并 次滤液，浓缩至 ，即生药量 ，药液于 冰箱中保存备用。给药建模成功后，柴葛芩连汤低、高剂量组小鼠灌胃给予 、柴葛芩连汤药液，阿奇霉素组灌胃给予 阿奇霉素溶液 个周期（周期为 ，前 连续灌胃阿奇霉素溶液，后 灌胃等量蒸馏水）；对照组和肺炎组灌胃等量蒸馏水，连续 。肺功能检测末次给药后 ，将小鼠放置于肺功能分析系统配套的锚箱中，给予异氟烷吸入麻醉，酒精消毒颈部，切开皮肤将气管分离，在气管上做“”字形切口后插管，连接呼吸机，辅助机械通气（呼吸频率 次，呼吸比例 ，潮气量 ），采集用力最大呼气流速（）、用力呼气量（）、呼气为 肺容积时的流速（）。炎症因子水平检测肺功能检测结束后，每组随机选取 只小鼠，处死后剪开胸腔，结扎右侧支气管，左侧气管中注入 生理盐水，轻轻按压左侧肺组织后抽出灌洗液，共灌洗 次，离心后取上清液，按照相应 试剂盒说明书检测肺泡灌洗液中、水平。染色观察肺组织病理学变化取右侧肺组织于 多聚甲醛溶液中固定 ，常规石蜡包埋，制成 厚的石蜡切片，常规苏木精伊红（）染色后中性树脂封片，在光学显微镜下观察肺组织的病理变化。法检测肺组织 、表达每组剩余 只小鼠从锚箱中取出后也立即处死，打开胸腔分离肺组织，将左右两侧肺组织分别分装保存在 超低温冰箱中。取小鼠左侧肺组织，使用极速 提取试剂盒提取总，按照反转录试剂盒与扩增试剂盒说明书操作，进行 反应，以 为内参基因，以 法计算 、相对表达，引物序列见表。法 检 测 肺 组 织 、蛋白表达取小鼠右侧肺脏组织，剪成小块，加入 （含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解液）进行匀浆，离心后取上清液，即得总蛋白，法检测总蛋白浓度，加入 后进行 凝胶电泳，依次进行转膜、洗膜、封闭，加入一抗孵育过 表 引物序列 基因引物序列 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 夜，洗膜后加入二抗孵育 ，滴加 发光液，在凝胶成像仪中曝光目的蛋白条带，分析各条带灰度值，以 为内参，计算目的蛋白的相对表达量。统计学分析 通过 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（）表示，两两间比较采用 检验，组间比较采用单因素方差分析。为差异有统计学意义。结果 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能的影响 与对照组比较，肺炎组小鼠、降低（）；与肺炎组比较，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠、增加（），其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂量（），见表。表 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺功能的影响（，）（，）组别（）（）对照组 肺炎组 柴葛芩连汤低剂量组 柴葛芩连汤高剂量组 阿奇霉素组 注：与对照组比较，；与肺炎组比较，；与柴葛芩连汤低剂量组比较，。柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺泡灌洗液中、水平的影响 与对照组比较，肺炎组小鼠灌洗液中、水平升高（）；与肺炎组比较，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠灌洗液中、水平降低（），其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂 年 月第 卷 第 期中 成 药 量（），见表。表 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺泡灌洗液中、水平的影响（，）（，）组别对照组 肺炎组 柴葛芩连汤低剂量组 柴葛芩连汤高剂量组 阿奇霉素组 注：与对照组比较，；与肺炎组比较，；与柴葛芩连汤低剂量组比较，。柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺组织病理变化的影响 对照组小鼠肺泡组织结构正常，肺泡轮廓清晰，肺泡腔内未见渗出物，无炎性浸润发生；肺炎组小鼠肺泡结构模糊松散，肺泡腔内可见大量炎性渗出物，肺泡壁变厚，肺泡与间质内有炎性细胞浸润；柴葛芩连汤各剂量组小鼠肺组织病理变化有不同程度缓解，尤其是高剂量组小鼠肺泡轮廓清晰，炎性浸润减少，肺泡腔内可见少量炎性浸润；阿奇霉素组小鼠肺组织病理改善明显，仅可见少量炎性浸润，并且肺泡组织结构趋于正常，见图。图 各组小鼠肺泡组织病理变化图（，）（，）柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺组织、表达的影响 与对照组比较，肺炎组小鼠肺组织、表达均升高（）；与肺炎组比较，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠肺组织 、表达均降低（），其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂量（），见表。表 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺组织 、表达的影响（，），（，）组别 对照组 肺炎组 柴葛芩连汤低剂量组 柴葛芩连汤高剂量组 阿奇霉素组 注：与对照组比较，；与肺炎组比较，；与柴葛芩连汤低剂量组比较，。柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺组织、蛋白表达的影响 与对照组比较，肺炎组小鼠肺组织、蛋 白 表 达 均 升 高（）；与肺炎组比较，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠肺组织 、蛋白表达均降低（），其中柴葛芩连汤高剂量作用优于低剂量（），见表、图。讨论新生儿呼吸道黏膜发育不完全，解脲脲原体定植于呼吸道后攻击宿主免疫系统，导致肺部出现损伤。临床表现为呼吸节律失常，听诊伴有痰鸣音，光片显示肺部纹理模糊，有弥散斑块。中医认为，新生儿肺气不足，邪毒自鼻窍进入侵袭肺络，入里生热，导致肺气郁闭、灼津生痰、淤阻肺络、气道阻塞、气滞而血瘀。本研究给予解脲脲原体肺炎模型小鼠柴葛芩连汤治疗，观察药效并探究其作用机制。本研究显示，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠、与 增加，肺泡灌洗液中 与 水平降低，提示柴葛芩连汤可以改善肺炎小鼠肺功能与炎症水平，且高剂量效果更优。柴胡归肺经，解表去热；黄芩味苦，归肺经，清热泻火。研究显示，柴胡和黄芩配伍可降低 与 的表达，从多靶点治疗新型冠状病毒肺 年 月第 卷 第 期中 成 药 表 柴葛芩连汤对解脲脲原体肺炎小鼠肺组织 、蛋白表达的影响（，），（，）组别 对照组 肺炎组 柴葛芩连汤低剂量组 柴葛芩连汤高剂量组 阿奇霉素组 注：与对照组比较，；与肺炎组比较，；与柴葛芩连汤低剂量组比较，。注：为对照组，为肺炎组，为柴葛芩连汤低剂量组，为柴葛芩连汤高剂量组，为阿奇霉素组。图 各组小鼠肺组织 、和 蛋白条带图 ，炎，改善临床症状。葛根味甘，归肺经，生津退热，与黄芩联用可改善新型冠状病毒肺炎临床症状。葛根素可降低动脉粥样硬化大鼠血清中 与 表达。给予 种致病菌感染的大鼠黄连提取物可以有效降低血清中 与 水平。本研究结果显示，柴葛芩连汤各剂量组小鼠肺组织病理变化均有不同程度缓解，说明柴葛芩连汤可以修复受损肺组织，降低炎性浸润。朱晓琳等研究发现，大鼠尾静脉注射黄芩素可以有效修复肺组织损伤，提示柴葛芩连汤中黄芩素是修护受损肺组织的主要成分。本研究显示，柴葛芩连汤各剂量组和阿奇霉素组小鼠肺组织 、的 与蛋白表达均降低，说明柴葛芩连汤可以抑 制 信 号 通 路 的 表 达。是一种解脲脲原体感染后表达的毒力蛋白，与肺炎的严重程度呈正相关。炎症小体属于 家族，由、与 组成，宿主感染解脲脲原体后，炎症小体与 相结合，激活下游的 发生剪切并活化，而 可以激活 形成具有活性的，从而激活炎症因子如 的合成，促进炎症的发生。柴胡中可以分离出活性物质柴胡皂苷，研究发现其可下调 细胞中、和 的 表 达。王 晓等研究发现，给予糖尿病心肌缺血再灌注大鼠黄连总生物碱可以下调 和 的表达。结合本研究结果，提示柴葛芩连汤可以抑制 信号通路的表达，阻止炎症的发生，达到治疗解脲脲原体感染性肺炎的目的。综上所述，柴葛芩连汤可以改善解脲脲原体肺炎小鼠受损的肺功能，该作用可能与抑制 信号通路有关。参考文献：，：，（）：，（）：，（）：，：，：彭 莎，霍晓乾，霍梦琪，等 基于系统中药学的金银花清热解毒功效标志物研究 中国中药杂志，（）：，（）：王子，王雪峰，张秀英，等 清肺透邪汤对肺炎支原体感染小鼠 炎性小体相关因子表达的影响 中 华 中 医 药 学 刊，（）：；陈先睿，钟美珍，吴夏萍 早产儿解脲脲原体感染的临床特点分析 中国妇幼保健，（）：魏红玲，邢燕，周颖，等 胎龄小于 周早产儿解脲脲原体肺炎的临床特征分析 中华预防医学杂志，（）：年 月第 卷 第 期中 成 药 宫文浩，王志威，陈莎莎，等 小儿支原体肺炎中医证候病机学研究 辽宁中医杂志，（）：束 沛，郑 忻，席 瑞，等 柴胡黄芩药对防治新型冠状病毒肺炎网络药理学分子机制研究 辽宁中医药大学学报，（）：方欢乐，别蓓蓓，穆颖，等 基于整合药理学的柴胡黄芩药对改善 临床症状的作用机制研究 海南医学院学报，（）：夏 婷，袁立霞，田元新，等 葛根芩连汤改善新型冠状病毒肺炎临床症状的网络药理学研究 中成药，（）：胡彦武，杨温欣，包小雪，等 葛根素改善动脉粥样硬化大鼠血脂异常及炎症反应的作用机制 医药导报，（）：张 如，杨正腾，马家宝，等 黄连提取物对五种致病菌腹腔感染小鼠血清 和 含量的影响 湖北农业科学，（）：；朱晓琳，赵海燕，杨吉林 黄芩素对重症急性胰腺炎大鼠肺组织损伤的影响 郑州大学学报（医学版），（）：，：，：，（）：周蒙恩，张 娜，阙任烨，等 柴胡皂苷 对 诱导的 细胞 产生及 炎症体的影响 中国免疫学杂志，（）：；王 晓，刘 博，张译心，等 黄连总生物碱与三七皂苷组合物对大鼠糖尿病心肌缺血再灌注损伤的影响 中南药学，（）：紫草素对强直性脊柱炎大鼠 淋巴细胞亚群平衡及破骨细胞分化的影响周子朋，范 围，孟庆良，崔家康，谷慧敏，王慧莲（河南省中医院风湿病科，河南 郑州）收稿日期：基金项目：年国家中医临床研究基地科研专项课题（）作者简介：周子朋（），男，硕士，副主任医师，从事中医药治疗风湿及骨病类疾病研究。：，：摘要：目的 探讨紫草素对强直性脊柱炎（）大鼠 淋巴细胞亚群平衡及破骨细胞分化的影响。方法大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组（柳氮磺吡啶）和紫草素低、中、高剂量组（、），每组 只，造模同时进行给药。后，检测 淋巴细胞亚群、细胞比例及 比值，检测血清、水平，、染色观察组织形态和破骨细胞数量，免疫组化法检测、表达，法检测关节组织、蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组骶髂关节组织炎症浸润严重，破骨细胞数目，细胞比例、比值，血清、水平，关节组织、蛋白表达升高（），细胞比例、血清 水平、关节组织 蛋白表达降低（）。与模型组比较，阳性药组和紫草素各剂量组骶髂关节组织炎症浸润减轻，破骨细胞数目，细胞比例、比值，血清、水平，关节组织、蛋白表达降低（），细胞比例、血清 水平、关节组织 蛋白表达升高（），其中高剂量紫草素的效果与阳性药相近。结论 紫草素可调控 表达，改善 大鼠 淋巴细胞亚群平衡，降低血清炎症水平，抑制破骨细胞分化。关键词：紫草素；强直性脊柱炎；淋巴细胞；破骨细胞分化中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：年 月第 卷 第 期中 成 药