RPL3可作为低级别胶质瘤的预后标志物且与免疫细胞浸润相关.pdf

生物信学分析联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.7,July28,2023585RPL3可作为低级别胶质瘤的预后标志物且与免疫细胞浸润相关刘洪超，魏志豪，史康克，张雨，李佳琼，王冬梅【摘要】目的研究核糖体大亚基蛋白3(ribosomalproteinL3,RPL3)在低级别胶质瘤（low-gradeglioma，LG G)中的表达、潜在的预后价值及其对免疫细胞浸润的影响。方法提取肿瘤基因组图谱（The CancerGenome Atlas，T C-GA)）、基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx)、基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interac-tiveAnalysis，G EPIA）、人类蛋白质图谱（HumanProteinAtlas，H PA）和肿瘤免疫评估资源（TumorIMmuneEstimationResource,TIMER)数据库中LGG相关数据集，应用多种生物信息学分析，探讨RPL3与LGG预后、临床病理特征、免疫细胞浸润、免疫检查点表达等相关性。结果与正常组织相比,LGG肿瘤组织中RPL3的mRNA水平和蛋白水平升高。单变量和多变量Cox分析发现,RPL3是LGG的独立预后因素，且RPL3低表达与LGG预后不良相关。RPL3表达与CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平显著负相关。RPL3也被证实与免疫检查点CD274、PDCD1、CT LA 4、T IG IT、SIG LEC15、PD CD 1LG 2 及LAG3显著共表达。结论RPL3在LGG中表达增加，且低表达与预后不良相关。RPL3可能通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润影响肿瘤的发展，RPL3可能作为LGG免疫治疗的潜在靶点。【关键词】低级别胶质瘤；核糖体大亚基蛋白3；预后；免疫浸润；肿瘤微环境【中图分类号】R739.41;R364【文献标识码】1Adoi:10.13730/j.issn.2097-2148.2023.07.009RPL3CalReellInfiltLIU Hongchao,WEI Zhihao,SHI Kangke,ZHANG Yu,LI Jiaqiong,WANG Dongmei.Department of Pathology,YiluoHosbitalofL。H e n a n 47 10 2 3.C h in aAbstract Objective To investigate the expression,potential prognostic value and its influence on the infiltrationof immune cells of ribosomal protein L3(RPL3)in low-grade glioma(LGG).Methods The LGG datasets were extrac-ted from The Cancer Genome Atlas(TCGA),Genotype-Tissue Expression(GTEx),Gene Expression Profiling Interac-tive Analysis(GEPIA),Human Protein Atlas(HPA)and Tumor IMmune Estimation Resource(TIMER)databases.Then multiple bioinformatics analyses were applied to investigate the correlations between RPL3 and prognosis,clinico-pathological characteristics,infiltration of immune cells and expression of immune-checkpoints in LGG.Results ThemRNA and protein levels of RPL3 increased in tumor tissues of LGG than those in normal tissues.Univariate and multi-variate Cox analysis showed that RPL3 was an independent prognostic factor of LGG,and low expression of RPL3 wascorrelated to poor prognosis of LGG.The expression of RPL3 was significantly negatively correlated with the infiltrationlevels of CD8+T cells,B cells,dendritic cells,macrophages and neutrophils.RPL3 was also verified to be significantlyco-expressed with immune-checkpoints,including CD274,PDCD1,CTLA4,TIGIT,SIGLEC15,PDCD1LG2 andLAG3.Conclusion RPL3 expression increases in LGG and low RPL3 expression is related to a poor prognosis.RPL3may influence tumor development by regulating infiltration of immune cells in the tumor microenvironment and RPL3 maybe a potential target for LGG immunotherapy.KeywordsI Low-grade glioma;Ribosomal protein L3;Prognosis;Immune infiltration;Tumor microenvironment胶质瘤是中枢神经系统中一种常见的致命肿瘤，低级别胶质瘤（low-gradeglioma，LG G)生长相对缓【基金项目】洛阳市医学重点培育学科项目（洛卫科教2 0 2 2-5号）【作者单位】1471023河南洛阳，洛阳伊洛医院病理科（刘洪超、魏志豪、史康克、张雨、李佳琼、王冬梅）慢，恶性程度较低，生存结局优于胶质母细胞瘤（glio-blastoma,GBM)1。胶质瘤的分子病理学研究对于提高诊断和治疗的准确性具有重要作用，例如世界卫生组织将异柠檬酸脱氢酶、P53突变状态等分子标志物添加到胶质瘤的诊断指南中 2 。目前，尽管手术切586Mil MedJntLog37,No.7,July28,2023联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期除联合化疗、放疗在一定程度上改善了患者的预后，但超过50%的LGG患者最终发展为高度侵袭性胶质瘤 3。因此，迫切需要筛选LGG相关的预后因素，以预测患者的生存和对个体化治疗的反应。核糖体是细胞中合成蛋白的细胞器，由核糖体蛋白和核糖体RNA组成，其中核糖体大亚基蛋白/3（ribosomal proteinL3,RPL3)是关键且进化保守的核糖体蛋白。除了参与核糖体组成,RPL3对核糖体翻译及响应外界压力也有重要作用。在缺乏活性P53的癌细胞中,RPL3作为应激敏感分子，在5-氟尿嘧啶处理后，RPL3上调并以核糖体游离形式积累，从而介导5-氟尿嘧啶凋亡细胞反应 45。此外，RPL3状态与化疗耐药相关，RPL3的缺失使化疗药物如5-氟尿嘧啶、放线菌素D和奥沙利铂无效 6-7 。RPL3还是细胞凋亡和细胞迁移的调控因子，在癌细胞中的异位表达通过正向调节P21在转录和翻译后水平的表达，诱导细胞周期停滞或凋亡 8 。先前研究表明，RPL3参与了肿瘤的发展和化疗耐药，如结直肠癌和乳腺癌，极大影响了患者的预后 9。近年来，免疫疗法已被应用于胶质瘤患者的治疗,并改变了胶质瘤的治疗模式 10-1。肿瘤浸润免疫细胞会影响免疫系统，以复杂的方式处理异常的生物学行为，并在免疫治疗中发挥重要作用 12 。然而，RPL3是否影响LGG的预后及肿瘤微环境尚未探讨。本研究通过提取肿瘤基因组图谱（The Cancer Ge-nome Atlas，T CG A）、基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，G T Ex）、基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GE-PIA）、人类蛋白质图谱（HumanProteinAtlas，H PA)和肿瘤免疫评估资源（Tumor IMmune EstimationResource，T IM ER）等数据库中LGG相关数据集，应用多种生物信息学分析探讨了RPL3潜在的致癌机制,包括RPL3与LGG患者预后、临床病理特征、免疫细胞浸润、免疫检查点表达等相关性。1资料与方法1.1数据来源与差异表达分析首先从TCGA数据库下载LGG和GBM相关的RNA测序数据、临床特征和生存信息。采用Wilcox-on检验评估LGG肿瘤组织和GTEx数据库中正常组织RPL3mRNA的差异表达 13，阈值为校正后P0.05，“g g p u b r R包用于绘制箱线图。采用GEPIA数据库进一步验证RPL3在LGG肿瘤组织和正常组织中的差异表达，并绘制箱线图和生存曲线 14。从HPA数据库获取正常脑组织、LGG和GBM肿瘤组织中RPL3蛋白表达的免疫组织化学图像，用于免疫组织化学的抗体为HPA003365，分析RPL3蛋白水平的表达差异 151.2LGG相关预后因素的筛选采用单变量和多变量Cox回归分析评估RPL3表达和5个主要临床病理特征，包括性别、年龄、种族、分级、放疗情况，以确定LGG相关预后因素。采用“forestplotR包绘制森林图，描绘各变量的风险比(hazard ratio,HR)、95%置信区间（confidence inter-val,CI)和P值，并采用ggalluvialR包构建桑基图。提取TCGA数据库中每个样本的生存信息，探索RPL3表达与LGG患者预后的关系，包括总体生存期(overall survival,OS）、无进展生存期（progressionfree survival,PFS)、无病生存期（disease free surviv-al,DFS)和疾病特异性生存期（disease specific surviv-al,DSS)。采用R包survminer和“survival绘制生存曲线，Log-rank用于检验Kaplan-Meier生存分析组间的生存差异。1.3RPL3与免疫浸润的相关性应用TIMER数据库探讨LGG与肿瘤浸润免疫细胞之间的相关性，TIMER中免疫细胞主要包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞和巨噬细胞 16 。基于RPL3的表达数据，本研究使用TIMER,CIBERSORT和MCP-counter算法分别分析了LGG组织中免疫细胞亚型的浸润情况 17 。使用R包 immunedeconvggplot2和 pheatmap分析RPL3与免疫细胞浸润的相关性。1.4RPL3与免疫检查点的相关性免疫检查点分子表达于免疫细胞上，抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，肿瘤形成免疫逃逸。选择CD274、C T LA 4、T I G I T、SI-GLEC15、H A VCR2、LA G 3、PD CD 1、PD CD 1LG 2 作为免疫检查点相关转录本，提取其表达数据，使用R包“immunedeconv”“ggplot2和 pheatmap评估免疫检查点的表达以及RPL3与免疫检查点的共表达。1.5统计学处理基因表达数据采用Log2变换进行归一化处理。正常组织和肿瘤组织比较采用Wilcoxon检验，Kruskal-Wallis分析用于多组间的比较。生存分析均采用Cox比例风险模型、Kaplan-Meier分析和Log-rank检验。采用Spearman检验分析两个变量之间的相关性。采用R软件（4.1.2 版本）进行统计分析。P0.05表示差异具有统计学意义。联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.7,July 28,20235872结果RPL3在LGG肿瘤组织和正常组织的差异表达为了探索RPL3基因在LGG肿瘤组织和正常组织中的表达水平，首先从TCGA数据库获得了513例LGG样本的mRNA测序数据，但缺乏癌旁组织样本，然后从GTEx数据库下载了正常组织样本。研究发现,与正常组织相比,RPL3基因在LGG肿瘤组织中高表达(P0.001)（图1-1),GEPIA数据库进一步验证了LGG肿瘤组织中RPL3基因的高表达(图1-2)。为了评估RPL3蛋白水平的差异表达，从HPA数据库中获取了免疫组织化学染色结果并进行分析。结果显示，RPL3蛋白在正常大脑皮层染色较弱（图2-1），在LGG肿瘤组织染色较高（图2-2 3），在GBM肿瘤组织有较强的RPL3蛋白染色（图2-45)。121210810TumorNormal684260LGG(num(T)=513;num(N)=2642)LGGTCGA+GTEx(num(T)=518;num(N)=-207)：T CG A 数据库LGG和GTEx数据库正常组织中RPL3基因表达；：GEPIA数据库LGG和正常组织中RPL3基因表达；*P0.05、P 0.0 1图1RPL3基因在LGG肿瘤组织和正常组织中的差异表达Figure 1Differential expression of RPL3 gene in LGG tumor tissues and normal tissues图2免疫组织化学染色检测RPL3蛋白表达Figure 2Expression of RPL3 protein detected by immunohistochemical staining2.2RPL3在LGG中的预后作用RPL3表达与LGG患者临床病理特征之间的关系见表1。与RPL3高表达组相比,RPL3低表达组患者被认为年龄更大，组织学分级更高，生存状态更差。应用单变量和多变量Cox回归模型探索RPL3基因的独立预后能力。单变量Cox分析结果表明，RPL3基因(HR=0.3959,P0.0001),年龄(HR=1.0584，P 0.0 0 0 1)，分级（HR=3.3695，P0.0001)和放射治疗（HR=2.0393,P=0.0108)影响LGG的预后（图3-1）。在随后的多变量Cox回归分析中,RPL3基因（HR=0.2574,P0.0001），年龄(HR=1.0454,P=0.0003),分级(HR=3.9218,P=0.0002)仍然是LGG患者OS的预测因子（图3-2）。这些结果表明,RPL3基因是LGG的一个独立预后因素。基于年龄、分级、放疗、RPL3基因表达的桑基图如图3-3所示。应用OS、D SS、D FS、PFS等生存相关性分析进一步验证LGG中RPL3基因表达与预后的相关性。Kaplan-Meier曲线结果显示,RPL3低表达组LGG患者的OS较短（HR=0.403,P=9.1510-7)（图4-1)，RPL3低表达组LGG患者PFS较差（HR=MilMedJntLog37,No.7,July28,2023联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期588表1RPL3表达与LGG临床病理特征的关系（n)Table 1Relationship between RPL3 expression andclinicopathological features of LGG(n)临床病理特征RPL3高表达 RPL3低表达X/P值生存状态存活2071816.740/0.013死亡5075年龄60岁1942性别女性1071211.647/0.232男性150135种族亚洲人44黑种人7141.764/0.296白种人240233印第安人01分级G21381125.079/0.027G3119144放疗未放疗73489.923/0.002接受放疗58840.506,P=3.9210-6）（图4-2）。DSS分析表明，RPL3低表达组与LGG患者不良结果存在显著相关性(HR=0.418,P=7.4110-6)（图4-4)。此外，在GEPIA数据库进行OS和DFS曲线的绘制，RPL3低表达组LGG患者 OS(P=7.8010-）和DFS(P=5.8010-5)均较差(图4-5 6)。2.3RPL3表达与免疫细胞浸润首先应用TIMER数据库揭示RPL3与6 种免疫细胞亚型浸润水平的相关性。如图5-1所示,LGG患者的累积生存与B细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润水平显著相关(P均 0.0 5。此外，TIMER数据库分析发现，RPL3表达水平与LGG中B细胞(Cor=-0.232,P=3.0610-7)、C D 8+T细胞（Cor=-0.357,P=7.8210-16）、巨噬细胞(Cor=-0.241,P=1.1710-7)、中性粒细胞(Cor=-0.255,P=1.6410-8）和树突状细胞（Cor=-0.186,P=4.5310-5)的浸润水平显著负相关（图5-2）。然后采用CIBERSORT和MCPcounter算法进Uni_CoxP-valueHazard Ratio(95%CI)RPL30.00010.3959(0.29830.5255)年龄0.00011.0584(1.04341.0735)性别0.66621.0814(0.75791.5429)种族0.92561.0313(0.54011.9691)分级0.00013.3695(2.27814.9836)放射治疗0.01082.0393(1.17883.5279)0.51 1.5 2 2.5.33.54 4.55Hazard RatioMulti_CoxP-valueHazard Ratio(95%CI)2RPL360AgeGradeRadiationRPL3Status：单变量和多变量Cox回归分析筛选LGG预后因子；桑基图展示RPL3基因表达与LGG临床特征、生存状态的分布趋势图3RPL3基因在LGG中的预后价值Figure 3Prognostic value of RPL3 gene in LGG联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.7,July 28,2023589一步研究RPL3表达与免疫细胞亚型浸润的相关性，结果表明,RPL3表达与CD8+T细胞、自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK）、单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞M1、巨噬细胞M2等浸润水平显著相关(图5-3 4)。2.4RPL3表达与免疫检查点相关性免疫检查点CTLA4、CD 2 7 4、T I G I T、H A VCR2、SIGLEC15、LA G 3、PD C D 1 和 PDCD1LG2 2在胶质瘤中的表达被进一步研究。结果表明,RPL3与CD274、PDCD1、SI G LEC 15、T I G I T、C T LA 4 和 PDCD1LG2表达显著负相关，与LAG3表达显著正相关（图6-1)，提示RPL3可能作为潜在的免疫治疗靶点。此外，随着组织学分级的增加，SIGLEC15、CT LA 4、CD 2 7 4、HAVCR2、LA G 3、PD CD 1和PDCD1LG2表达均显著上调(图6-2 3)。1.0 0Log-rank P=9.15e-07Groups1.00Log-rank P=3.92e-06GroupsHR(High groups)=0.4033+High groupsHR(iHligh groups)-0.506 High groups5%CI(0.28,0.579)-+Low groups95%CI(0.379,0.676)+Low groups0.750.750.50SHd0.500.25-0.25一0.00Median tine:7.9 and 4.50.00Mediantime:5and2.6High groups 2564413High groups 25626Low groups25621Low.groups2561005101520051015时间（年)时间（年)GroupsLog-rank P=7.4le-06Groups1.00Log-rank P=0.1861.00HRCHigh.groups)-0.546+HighgroupsHR(High groups)=0.418+High groups.95%Ci(0.223,1.338)Lowgroups95%CI(0.285,0.612)-+Low groups0.750.750.50SSA0.500.250.25-10.000.00Median time:79 and 6.1sdnoIDHigh groups66High groups十2524112Low groups67Low groupsS2522105101505101520时间(年)时间（年)1.0LoWRPL3TPM1.0LoWRPL3TPMHighRPL3TPMHighRPL3TPMLogrankp=7.8e-09Logrankp-5.8e-05HR(high)-0.350.80.8HRChigh-0.53P(HR)F3.1e-08P(HR6e-OSn(high)=257n(high)-257n(low)-257n(low)-2570.60.60.40.40.20.20.00.0050100150200050100150时间（月)时间（月)图4RPL3基因表达与LGG预后的相关性Figure 4 Correlation between RPL3 gene expression and prognosis of LGGMilMed JntLogVol.37,No.7,July28,2023联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期590B细胞CD8T细胞CD4T细胞巨噬细胞中性粒细胞树突状细胞RPL31.00Log-rank P-oLog-rank P-0.01Log-rank P-oLog-rank P-oLog-rank P-oLog-rank.P=0.001Log-rank P-00.75LevelLow(Bottom50%)0.50High(Top50%)0.2505010015020005010015020005010015020005010015020005010015020005010015022000501001502002随访时间（月）肿瘤纯度B细胞CD8T细胞CD4T细胞巨噬细胞中性粒细胞树突状细胞corpartial.cor0.232partial.cor=0.357partial.cor=-0.052partial.corpartial.cor=-0.255partial.cor-0.186P3.06e07P=7.82e-16P=2.62e-01P=1.17e-07p=1.64e-0812P=4.53e-05118100.250.500.751.000.00.10.20.30.10.20.30.40.50.60.10.20.30.40.50.00.10.20.30.40.10.20.30.30.60.9漫润水平3*p0.05*p0.05*p0.01*p0.01*p0.001*p0.001CorrelationCorrelation0.10.30.20.00.10.0-0.1-0.10.20.21Trudo.nnNBCIBERSORTMCPCOUNTER：免疫细胞浸润水平与LGG累积生存的相关性；：基于TIMER,CIBERSORT,MCPcounter算法评估LGG中RPL3表达与免疫细胞浸润的关系图5RPL3表达与免疫细胞浸润的相关性Figure 5Correlation between RPL3 expression and immune cell infiltration*p0.05*p0.01CorrelationRPL3*0.10.0-0.10.20.3CD274CTLA4LAG3PDCDITIGITHAVCR2PDCDILG2SIGLECI5Group4Group3CD274*5.29e-28GBM2HAVCR2*1.21e26一PDCD1LG2*6.15e-440-1TIGIT8.72e-0123SIGLEC15*9.89e22LAG3*7.69e-14CTLA4*2.70e-15PDCD1*4.69e-30*7.5-Group5.0申LGGG2申LGGG3申GBM2.5-0.0-CD274CTLA4HAVCR2LAG3PDCDITIGITPDCDILG2SIGLECI5：LG G 中RPL3与免疫检查点表达的相关性；：LG G 与GBM免疫检查点的差异表达图6胶质瘤中免疫检查点的表达Figure 6Expression of immune checkpoint in glioma3讨论LGG是一种常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤。尽管手术切除联合化疗和放疗可以改善临床预后，但随着时间的推移，超过50%的LGG患者演变为耐药的高侵袭性胶质瘤。因此，迫切需要确定新的LGG预后相关因素。临床免疫疗法，包括免疫检查点抑制剂、主动或被动免疫疗法等，已用于胶质瘤，进一步证实了免疫疗法对LGG治疗至关重要 18-2 0 1。为了对患者的生存和个体化治疗反应提供高度准确的预测，有必要确定更多潜在的免疫相关预后标志物。RPL3是进化保守的核糖体蛋白，参与核糖体组成、响应外界压力、调控细胞凋亡和迁移等生物学过程。研究发现,RPL3参与了多种肿瘤的发展和耐药，极大影响了患者的预后 9.2 1。然而,RPL3 在LGG中的作用以及RPL3是否具有免疫相关的生物学功能尚未见报道。本研究发现,与正常组织相比,LGG肿瘤组织中RPL3表达水平升高。RPL3基因被证实是LGG的独立预后因素,进一步探索发现RPL3低表达与LGG患者生存率差相关。前期研究发现，在缺乏活性P53的肺癌细胞中,RPL3可作为癌细胞对核糖体应激反应所必需的应联勤军事医学2 0 2 3年7 月2 8 日第37 卷第7 期Mil Med Jnt Log,Vol.37,No.7,July 28,2023591激传感分子。RPL3蛋白的恢复可能通过调节肺癌细胞中活性氧水平,使耐药细胞对药物重新敏感 4。癌细胞的增强生长需要蛋白质合成的增加，这与核糖体活性的增加有关。另外,RPL3被鉴定为与替莫唑胺抗性相关的关键候选蛋白之一，在替莫唑胺处理的U87细胞中显著下调,其低表达表明GBM 患者的预后较差 2 2 。本研究结果进一步加强了核糖体缺陷与胶质瘤进展之间的联系,RPL3可能在胶质瘤的发生中发挥重要作用，可作为LGG预后的生物标志物。肿瘤微环境特征已被证实可作为生物标志物评估肿瘤细胞对免疫治疗的反应并影响预后结果 2 3。本研究结果表明,RPL3在LGG免疫微环境中发挥重要作用。首先TIMER数据库结果显示，RPL3与B细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平呈负相关。此外，与免疫细胞低浸润患者相比，免疫细胞高浸润LGG患者的累积生存期较差。这些结果表明，RPL3低表达可能通过上调B细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平而导致生存不良。此外，RPL3与不同免疫细胞亚型，如巨噬细胞M1、巨噬细胞M2、单核细胞等具有不同的相关性。先前一项研究表明,RPL3作为核心基因参与了结直肠癌循环肿瘤细胞的核糖体相关途径 2 4。此外，RPL3与免疫检查点，包括CD274、CT LA 4、LA G 3、PD CD 1、PD CD 1LG 2、T I G I T和SIGLEC15共表达。与LGGG2患者相比，LGGG3患者免疫检查点的表达水平更高，对免疫检查点阻断治疗的反应更好。这些结果表明，低表达RPL3的LGG患者在免疫检查点阻断治疗后可能具有更好的预后,RPL3可能是免疫治疗的潜在靶点。总之，本研究表明RPL3在LGG肿瘤组织中表达增加,且RPL3低表达与不良预后相关。RPL3可能通过调节肿瘤浸润免疫细胞影响肿瘤的发展过程，可能作为免疫治疗的潜在靶点。参考文献1Gittleman H,Sloan AE,Barnholtz-Sloan JS.An independentlyvalidated survival nomogram for lower-grade glioma JJ.NeuroOncol,2020,22(5):665-6742Louis DN,Perry A,Wesseling P,et al.The 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