常山胡柚果皮精油对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用研究.pdf

2023年第36 卷第9 期油脂工程常山胡柚果皮精油对座疮丙酸杆菌的体外抑制作用研究苏远，刘尧，沈建福（浙江大学生物系统工程与食品学院，浙江杭州310 0 58）摘要：以常山胡柚果皮为原料制备常山胡柚果皮精油（CHEO），分析其成分含量及对痤疮丙酸杆菌的体外抑制作用。结果表明：CHE0含有丰富的D-柠檬烯与松油烯，相对含量分别为30.45%与2 0.38%。CHEO对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌质量浓度（MIC与最小杀菌质量浓度(MBC)分别为（3.8 0 0.2 0）、（11.30 0.50)mg/mL。通过生长曲线发现,1MICCHE0在48 h内能明显抑制痤疮丙酸杆菌生长；通过电镜观察发现，用CHEO处理后痤疮丙酸杆菌菌体多有破损、断裂，表明CHEO对痤疮丙酸杆菌有较强的体外抑菌活性。关键词：常山胡柚；痤疮丙酸杆菌;精油；抑菌活性Study on in vitro inhibitory effect of Citrus aurantium Changshanhuyoupeel essential oil on Propionibacterium acnesSU Yuan,LIU Yao,SHEN Jian-fu(College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,Zhejiang,China)Abstract:The Citrus aurantium Changshanhuyou peel essential oil(CHEO)was prepared using Citrusaurantium“Changshanhuyou peel as material,and the component content and in vitro inhibitory effecton Propionibacterium acnes of CHEO were analyzed.The results showed that CHEO contained abundantD-limonene and terpinene,with relative contents of 30.45%and 20.38%,respectively.The minimuminhibitory mass concentration(MIC)and minimum bactericidal mass concentration(MBC)of CHEOagainst Propionibacterium acnes were(3.80 0.20)and(11.30 0.50)mg/mL,respectively.Thegrowth curves showed that 1 MIC CHEO could significantly inhibit the growth of Propionibacterium ac-nes within 48 h.Electron microscope observation showed that Propionibacterium acnes were damaged andbroken after treatment with CHEO,which indicated that CHEO had strong in vitro antibacterial activityagainst Propionibacterium acnes.Key words:Citrus aurantium“Changshanhuyou;Propionibacterium acnes;essential oil;antibacterialactivity中图分类号：TS225.6常山胡柚属于芸香科柑橘属,是酸橙与柚天然杂交种 ，为浙江省常山县具有中国国家地理标志的特产产品2 。胡柚每年产量有12 万t,有30%被应用于各种深加工3,产生大量柚皮废物。常山胡柚果皮精油（CHEO）中柠檬烯成分含量较高，具有收稿日期：2 0 2 2-0 6-2 0基金项目：浙江省自然科学基金重大项目（LD21C200001）作者简介：苏远（19 9 7 一），男，硕士研究生，研究方向为天然产物与人类健康。通信作者：沈建福（19 6 4一），男，硕士，教授，研究方向为粮油加工、食品安全与标准化、食品工艺。粮食与油脂文献标志码：A文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)0 9-0 0 53-0 4很强的抑菌活性4。痤疮丙酸杆菌（P.acnes）定植于皮脂腺中,会大量分解皮脂中的三酰甘油,产生游离脂肪酸,改变皮肤环境，破坏菌群平衡，同时也会分泌水解酶、透明质酸酶等,进一步破坏皮肤屏障2 。研究5 表5354明,P.acnes通过依赖性途径诱导单核细胞因子产生炎症因子,引发痤疮炎症。因此,抑制皮脂腺定植过程中的P.acnes 生长,对预防与治疗痤疮疾病具有重要意义。研究 6-7 表明,CHEO对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）、大肠杆菌（Escherich-ia coli)具有很好的抑制作用,CHEO可通过破坏生物膜杀死细胞来抑制单核球增多性李斯特菌（Liste-ria monocytogenes）的生长。本试验研究CHEO对P.acnes的抑制效果,探索新的天然产物活性成分，为治疗与预防痤疮提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂常山胡柚,市售;P.acnes,中国工业微生物菌种保藏中心;RCM强化羧基液体培养基，青岛海博生物科技有限公司；平板琼脂培养基，上海创赛科技有限公司;1磷酸缓冲盐溶液（PBS），上海麦克林生化科技有限公司；全反式维A酸（ATRA）,南通飞宇生物科技有限公司；红四氮唑溶液，武汉赛维尔生物科技有限公司；二甲基亚矾，北京索莱宝科技有限公司；二氯甲烷、体积分数2 5%戊二醛溶液，国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器与设备PH50A型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；3.5L密封厌氧培养盒，日本三菱化学株式会社；542 5R高速冷冻离心机，美国艾本德公司；SU-70场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；7 8 9 0 B-5977B气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；UV-1900紫外分光光度计，株式会社岛津制作所。1.3试验方法1.3.1 CHE0 提取参考何君等 8 的方法,并稍作修改。将干燥胡柚皮粉碎，过0.2 5mm筛，称取50 g胡柚皮粉于烧瓶中,加人2 50 mL蒸馏水，水浴蒸馏4h,冷却收集馏分，于分水器中静置2 4h分层，取上层加入无水硫酸镁干燥，用50 mm微孔滤膜过滤，得CHEO。1.3.2菌种活化取0.5gP.acnes冻干粉,加入1mL生理盐水混匀,接种于平板琼脂培养基,置于厌氧培养盒中，以37 培养48 h,挑取菌落接种于RCM强化羧基液体培养基，在37 厌氧环境下培养48 h，菌液备用。1.3.3胡柚皮精油成分分析参考文献 9 的方法,并适当调整。CHEO以二粮食与油脂氯甲烷稀释至2 0 40 mg/mL,过0.2 2 m微孔有机滤膜,待GC-MS分析。1.3.4色谱条件色谱柱为石英毛细色谱柱(30 m0.25mm0.25m）；载气为高纯度氮气（9 9.9 9 9%）；程序升温条件：柱温6 0,维持3min，以1/min升温至80,维持3min,再以5/min升温至2 50;溶剂延迟3min;进样量1L;分流比2 0 0:1。1.3.5质谱条件电离方式EI;电子能量7 0 eV；离子源温度230；四极杆温度150；扫描范围30 450 m/z。1.3.6抑菌活性1.3.6.1最低抑菌质量浓度（MIC）与最小杀菌质量浓度(MBC)参考KSOUDA等 10 的方法，并适当修改。在96孔微孔板的每孔中加人10 0 LRCM强化羧基液体培养基,以其1倍体积稀释CHEO至2 0 mg/mL,并在第一孔中加人10 0 L CHEO溶液,再用2 倍体积RCM强化羧基液体培养基进行连续稀释,而后接种2 0 L Pa c n e s 悬浮液。以ATRA为阳性对照,无菌液培养基为阴性对照，在37 厌氧环境下培养48h后，加入质量分数0.5%红四氮唑溶液孵育24h,观察未有显色反应的CHEO纳米乳精油的质量浓度即为其对 P.acnes 的MIC。选取上述MIC试验中所有未有显色反应的样品组的稀释液10 0 L接种于平板琼脂培养基，以37培养48 h，在平板上未见可见菌落生长的最小质量浓度即为MBC。1.3.6.2P.acnes生长曲线绘制参考HUANG等 I的方法，并适当修改。用0.25 MIC、0.5 M I C、1 M I C 精油处理 P.acnes(510CFU/mL）,以含体积分数0.5%二甲基亚砜的RCM强化羧基液体培养基为阴性对照,在37下厌氧培养48 h，于选定的时间间隔取菌液，通过紫外分光光度计测定菌液的吸光度OD600（以吸光度表示菌密度），以时间为横坐标，以OD600为纵坐标,绘制P.acnes生长曲线。1.3.7形态学观察取对数生长期 P.acnes 菌液为溶剂,以 CHEO为溶质，配制成质量浓度为3.8 mg/mL培养液，培养12、2 4h后分别收集培养液，以40 0 0 r/min离心10min,取沉淀物用PBS洗涤3次，在常温下以4000r/min离心40 s,沉淀细菌用体积分数2%戊2023年第36 卷第9 期2023年第36 卷第9 期二醛固定2 4h，经体积分数30%、50%、7 0%、80%、9 0%、9 5%无水乙醇梯度脱水，于扫描电镜下观察。2结果与分析2.1CHEO成分分析由表1可知：CHEO中共鉴定出2 7 种化合物，其中以D-柠檬烯与松油烯为主，相对含量分别为30.45%与2 0.38%。其中D-柠檬烯对诸多细菌，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等，均表现出极强的抑菌与杀菌能力 12 。此外，-松油烯、异松香烯、-月桂烯、-榄香烯、古巴烯等烯类物质相对含量均大于1%，这些烯物质具有较好的抗菌活性 13。松油烯及其衍生物也具有优异的抑菌能力 14,且在其他柑橘属果皮精油中相对含量较少 4.14-15,因此，含有丰富的松油烯是胡柚属果实的表1CHEO化学成分保留编号时间/min15.48825.70437.20047.30758.027610.151711.220811.807912.7581014.8261115.9221216.9371317.4561418.3221519.2561623.1411724.7251825.6011926.6552027.9242128.2462230.8212331.7042432.9222535.3732636.5642739.599粮食与油脂特点 7.16 。由此可见,CHEO中各主要成分均有一定的抑菌及杀菌效用。2.2CHEO对P.acnes的体外抑菌活性由表2 可知:CHEO对P.acnes的MIC为(3.8 0 0.20）m g/m L,M BC为(11.30 0.50）mg/mL,远高于ATRA的MIC和MBC。表2 CHEO对 P.acnes 的MIC 和 MBC质量浓度CHEOMIC3.80 0.20MBC11.30 0.50由图1可知：CHEO对P.acnes的生长有明显的抑制效果,且随着CHEO质量浓度的增加,CHEO对P.acnes生长抑制效果越明显。其中在1MICCHEO影响下,P.acnes在48 h内未见明显生长；0.5MIC与0.2 5MICCHEO也显示出一定的抑化合物名称分子式相对含量/%-水芹烯CioHi63-首烯CioHi6-松油烯CioHi61-亚甲基4-CioHi6(1-甲乙烯）-环已烷-派烯D-柠檬烯3-首烯-松油烯松油烯异松香烯芳樟醇烯CioHi6香茅醛CioHis04-粘品醇CioHisO癸醛Cio H2o 0乙酸辛酯CioH2o 0反式香芹醇CioHi60香茅醇Cio H2o 0香芹酮CioHi40-月桂烯CioHi6紫苏醛Cio Hi4 04-首烯C1oHi6古巴烯Ci6H245-甲基-2-(1-甲基乙烯C12 H20 02基)4-己基-乙酸酯-榄香烯-榄香烯（+）-古芸烯55/(mg/mL)ATRA0.10 0.021.20 0.10制生长作用,与ATRA抑菌具有相似的趋势,0.50.09MICCHEO抑菌效果明显优于ATRA。表明CHEO0.49对P.acnes具有较好的体外抑菌活性。0.051.0+CHEO 1xMIC0.29+CHEO0.5xMICC H E O 0.2 5M I C0.8ATRA1xMICCioHi60.80CioHi630.45CioHi60.06CioHi61.15CioHi620.38CioHi65.32CioHis O0.240.290.530.760.540.541.792.151.0711.238.300.0393.2553.013Cis H240.509Cis H242.117Cis H240.029对照0.60.40.20图1CHEO干预下的P.acnes生长曲线2.3CHEO处理前后P.acnes的形态学变化由图2 可知：在CHEO作用下,P.acnes菌体多见扭曲与断裂，且菌体表面多有粗糙与破损，而未经处理的菌体完整饱满，菌体表面光滑，表明CHEO(a)1xMICCHEO处理后的P.acnes图2 CHEO处理前后的P.acnes菌体形态口口口816培养时间/h(b）未经处理的P.acnes2432404856可以有效破坏菌体,以此达到抑制P.acnes生长的目的。表明CHEO对P.acnes有较强的体外抑菌活性。3结论以常山胡柚果皮为原料制备CHEO,分析其成分含量及对P.acnes的体外抑制作用。结果表明：CHEO含有丰富的D-柠檬烯与松油烯，相对含量分别为30.45%与2 0.38%。CHE0对P.acnes的MIC与MBC分别为（3.8 0 0.2 0）、（11.30 0.50)mg/mL。通过生长曲线发现,1 MIC CHE0在48 h内能明显抑制P.acnes生长;通过电镜观察细菌形态发现,用CHEO处理后P.acnes菌体多有破损、断裂,表明CHEO对P.acnes有较强的体外抑菌活性。本研究为 CHEO 在痤疮临床治疗的综合开发和利用提供了数据支持与理论依据。参考文献1】俞日梁，陈新建，叶杏元，等常山胡柚品种起源及栽培研究进展 J浙江林业科技，2 0 0 6(3)：8 3-8 6.2 CREYDANUS D E,AZMEH R,CABRAL M D,et al.Ac-ne in the first three decades of life:An update of a disorderwith profound implications for all decades of life J.Dis-ease-a-Month,2021,67(4):101103.【3杨波，戴翔，汪丽霞，等常山胡柚品牌管理和建设概述 J浙江柑橘，2 0 2 1,38(1)：8-11.4 GUO J J,GAO Z P,XIA J L,et al.Comparative analysisof chemical composition,antimicrobial and antioxidant ac-tivity of citrus essential oils from the main cultivated varie-ties in China J.LWT-Food Science and Technology,2018,97:825839.5 DESSINIOTI C,KATSAMBAS A D.The role of Propi-onibacterium acnes in acne pathogenesis:Facts and contro-versies J.Clinics in Dermatology,2010,28(1):2-7.【6】赵雪梅，叶兴乾，朱大元，等胡柚皮挥发油的化学成分和抗菌活性初步研究 J中国中药杂志，2 0 0 3(11):94-96.粮食与油脂 7 GUO J J,GAO Z P,LI G Y,et 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