SN∕T 5183-2020 牛皮蝇蛆病检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51832020代替 SN/T 11622002牛皮蝇蛆病检疫技术规范Quarantine protocol for Bovine hypodermosis中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.220CCS B 412020-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 51832020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国人民共和国乌鲁木齐海关、中华人民共和国广州海关。本文件主要起草人：吴绍强、邓俊花、吕继洲、王振宝、王彩霞、袁向芬、张永宁、邓艳、李霆、梅琳。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51832020牛皮蝇蛆病检疫技术规范1范围本文件规定了牛皮蝇蛆病检疫时的临床症状检查、剖检检查和病原形态学鉴定以及酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术规范。本文件适用于进出境活牛和牛皮张中牛皮蝇蛆的检疫，也适用于牛养殖场牛皮蝇蛆病的流行病学调查和监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4疫病概述牛皮蝇蛆病（Bovine hypodermosis）是由皮蝇科（Hypodermine） 、皮蝇属（Hypoderma）的牛皮蝇（H.bovis） 、纹皮蝇（H.lineatum）和中华皮蝇（H.sinense）寄生于牦牛或黄牛体内而引起的一种寄生虫病。 本病的危害主要表现为牛皮穿孔，肉、奶产量降低且品质下降，感染强度高的可致动物死亡。牛皮蝇蛆病现已报道的病原分属于 10 属中的 39 种，特异性的宿主为牛属动物的黄牛、牦牛、犏牛和水牛，但有时也可感染马等其他家畜和人，而且能够发育成熟。鉴于本病对畜牧业的严重危害，世界上许多国家在上世纪二三十年代便启动了皮蝇蛆病控制与扑灭行动，并将消灭皮蝇蛆病立法加以强制执行。皮蝇蛆病流行范围广，在北纬 18 60 范围内的 55 个国家都有本病的流行。我国牛皮蝇蛆病的地理分布主要在东北、华北、西北等地区的农牧区，这些农牧区的牛皮蝇蛆病尤为严重。在流行区内，感染率达 80% 以上，严重感染地区高达 98%100%，特别是 13 岁的犊牛易受感染，4 岁以上牛发病率降低。5材料与试剂除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水应达到 GB/T 6682 中一级水的要求。牛皮蝇蛆病抗体检测试剂盒：本标准以商品化试剂盒 Bovine Hypodermosis Antibody Test Kit 为例进行操作，也可采用经过验证、检测效果确实的其他牛皮蝇蛆病 ELISA 检测试剂盒。以正式出版文本为准2SN/T 518320206设备6.1体视显微镜。6.2酶标仪。6.3-20 普通冰箱、4 冰箱。6.4高压灭菌锅。6.5离心管、微量移液器及配套的吸头、玻璃培养皿及解剖针。6.6恒温培养箱。7临床症状检查7.1适用范围适用于进出境隔离检疫期间活牛感染牛皮蝇蛆的检疫。7.2临床症状牛感染皮蝇后，一般不呈现明显的临床症状，但严重感染时，幼畜表现出消瘦、生长缓慢、贫血，母牛产乳量下降，役畜的使役能力降低等症状。当皮蝇幼虫钻入脑部时，可引起神经症状，如作后退运动、突然倒地、麻痹或晕厥等，重者可造成死亡。此外，由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔，细菌感染而引起化脓，形成瘘管，常有脓液和浆液流出，瘘管逐渐愈合，形成斑痕。但上述症状只能作为皮蝇感染的参考指标，不能作为确诊的依据。只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎，且可挤出第三期幼虫时，方能确诊。8剖检及形态学鉴定8.1适用范围适用于死亡牛的病情确诊，也适用于进出境牛皮张的检疫。8.2剖检重点检查食道黏膜、背部皮下、瘤胃浆膜、大网膜、食道浆膜等部位。三期幼虫引起动物皮肤隆起似瘤肿物。动物隆起处有小孔，孔周围常见干涸脓痂，孔内结蹄组织囊中可见幼虫。如发现第三期幼虫，便可确诊。取可疑的牛皮蝇蛆虫体，置于玻璃培养皿内，解剖针辅助翻动虫体，体视显微镜下观察是否具备相关形态学特征。8.3形态学鉴定8.3.1第二期幼虫的形态呈浅黄白色，长 11 mm15 mm，宽 3 mm6 mm。腹面微隆，背面平。外观口钩不明显，仅见两个黄褐色的小圆点，彼此分离。腹面各节前后缘刺分界不明显，气门未形成肾形，似石榴颗粒状，堆积排列。8.3.2第三期幼虫的形态虫体长 19 mm25 mm，宽 8 mm11 mm，长宽比例（2.32.1） ： 1。背面平，腹面隆起。侧面有疣状突，色泽因成熟程度不同而异，由淡黄色至淡褐色、黄褐色以至黑色，体具 11 节（胸部 3 节、以正式出版文本为准3SN/T 51832020腹部 8 节） 。伪头部具一对头感器，彼此分离。口钩退化成黑色圆点。腹面最后二节无刺，后气门凹陷深，呈漏斗状，气门板（孔）的表面有很多粗壮的突棘（参见附录 A） 。9酶联免疫吸附试验（ELISA）9.1适用范围适用于进出境活牛是否感染牛皮蝇蛆的检测。9.2血清样品的采集和处理颈静脉采集动物血液，分离血清， 4 冷藏保存。9.3操作步骤9.3.1试剂制备见附录 B。9.3.2包被采用 Bovine Hypodermosis Antibody Test Kit 中“皮蝇抗原反应板” ，其中，包被抗原为纯化的纹皮蝇期幼虫提取物。9.3.3加样按照表 1 加样。加入试剂盒中 2 号血清稀释液，每孔 190 L。加入待检血清、标准阳性血清及标准阴性血清，每孔 10 L。表 1ELISA 反应板使用样式表123456789101112APositive controlS7S15S23S31S39S45S53S61S69S77NegativecontrolBS1S8S16S24S32S40S46S54S62S70S78S85CS2S9S17S25S33S41S47S55S63S71S79S86DS3S10S18S26S34Positive controlS48S56S64S72S80S87ES4S11S19S27S35NegativecontrolS49S57S65S73S81S88FS5S12S20S28S36S42S50S58S66S74S82S89GS6S13S21S29S37S43S51S59S67S75S83S90HNegativecontrolS14S22S30S38S44S52S60S68S76S84Positive control 注：S:Sample以正式出版文本为准4SN/T 518320209.3.4孵育轻轻混匀后，加盖，37 孵育 1 h。9.3.5洗涤弃孔中液体，加入洗液洗涤，每孔 300 L，重复洗涤 3 次。9.3.6酶标抗体反应加入辣根过氧化物酶 HRP 标记的抗反刍动物 IgG，每孔 100 L，加盖，37 孵育 30 min。9.3.7二次洗涤弃孔中液体，加入洗液洗涤，每孔 300 L，重复洗涤 3 次。9.3.8显色加入底物溶液 TMB 每孔 100 L，加盖，在 18 26 条件下 , 避光孵育 20 min。9.3.9终止反应加入终止液每孔 100 L，轻轻混匀，终止反应。9.3.10测定用酶标仪测定 OD450值。9.4结果计算9.4.1对照阳性对照平均值（PCx） 、阴性对照平均值（NCx）, 计算见式（1） 、式（2） 。 PCx= （PC1A450 + PC2A450+ PC3A450） 3 （1） NCx= （NC1A450 + NC2A450+ NC3A450） 3 （2）9.4.2样本 S = （SA450 - NCx） P （PCx - NCx） （3）9.5结果判定9.5.1试验成立判定 PCx 3.50 NCx9.5.2结果判定在阴阳性对照检测结果有效时进行样品结果判定，判定标准如下：阴性：S/P 45% ；可疑：45% S/P 55% ；以正式出版文本为准5SN/T 51832020阳性：S/P 55%。应对可疑的样品进行第二次检测，若重复检测的结果仍为可疑，需重新采集样品进行检测，结果仍为可疑的样品则最终判定为阳性。10结果综合判定发现虫体的，根据形态学观察进行确诊。血清学检测为阳性的，判为样品牛皮蝇蛆感染阳性；血清学检测为阴性的，判为样品牛皮蝇蛆感染阴性。以正式出版文本为准6SN/T 51832020附 录 A（资料性）两种皮蝇第三期幼虫形态A.1牛皮蝇蛆第三期幼虫牛皮蝇蛆第三期幼虫见图 A.1。a）背面b）腹面c）头部d）尾部图 A.1牛皮蝇蛆第三期幼虫A.2纹皮蝇蛆第三期幼虫虫体肥大，色泽因成熟程度不同而异，由淡黄色至淡褐色、黄褐色以至黑色。背面平，腹面隆起，生有 11 结节。口钩退化成黑色圆点。腹面最后一节无刺，后气门凹陷浅，较平坦（见图 A.2） 。 图 A.2纹皮蝇蛆第三期幼虫（Colwell DD. 1989.）以正式出版文本为准SN/T 51832020附录B（规范性）试剂制备B.1洗液稀释浓缩洗液（20）在冷藏保存时可能析出盐，用前应恢复至室温并摇匀使析出的盐溶解，然后采用蒸馏水进行 120 稀释为工作液。工作液需在 2 8 保存，3 d 内可稳定使用。B.2酶标抗体稀释酶标抗体浓缩液（100）在使用前应用随试剂盒提供的 1 号稀释缓冲液进行 1100 稀释。 18 26 条件下，稀释好的酶标抗体可在 8 h 内使用。注：浓缩洗液（20） 、酶标抗体浓缩液（100） 、1 号稀释缓冲液均为试剂盒 Bovine Hypodermosis Antibody Test Kit 中的试剂。以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 18 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：15517532 定价 16.00 元牛皮蝇蛆病检疫技术规范行 业 标 准SN/T 51832020*SN/T 51832020北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址