β-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的影响.pdf

SILIAO GONGYE2023年第44卷第20期 总第689期摘 要：为探讨-谷甾醇对泌乳动物乳腺乳蛋白和乳脂肪合成的影响，研究首先利用MTT法筛选出对小鼠乳腺上皮细胞生长增殖不受抑制的-谷甾醇剂量；采用qRT-PCR技术检测-谷甾醇处理乳腺上皮细胞后乳蛋白合成相关基因和乳脂肪合成相关基因的mRNA表达水平。结果表明：较高剂量（40120 mol/L）的-谷甾醇明显抑制小鼠乳腺上皮细胞的活力（P0.05），故后续试验添加5、10、20 mol/L的-谷甾醇处理乳腺上皮细胞。-谷甾醇明显提高酪蛋白基因CSN1S1、CSN2、CSN3及乳蛋白合成通路相关基因 JAK2、STAT5、mTOR、S6K1 的 mRNA 表达水平（P0.05）。-谷甾醇显著上调乳脂肪合成关键调控因子SREBF1、PPARG、PPARGC1A和脂肪酸合成相关基因ACC、FAS、SCD的mRNA表达（P0.05）。由此可见，-谷甾醇能通过调节小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因的表达，进而促进乳腺细胞乳蛋白和乳脂肪的合成。关键词：-谷甾醇；乳腺上皮细胞；乳蛋白；乳脂肪；基因表达doi:10.13302/ki.fi.2023.20.012中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）20-0075-05Effect of-sitosterol on Milk Protein Synthesis and Milk Fat Synthesis in Mouse MammaryEpithelial CellsLIU Lili CHEN Min(College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang Harbin 150040,China)Abstract：To explore the effect of-sitosterol on the synthesis of milk protein and milk fat in the mammary gland of lactating animals.Firstly,MTT method was used to screen the -sitosterol dose that were not inhibited the growth and proliferation of mouse mammary epithelial cells.The mRNA expression levels of the genes related to milk protein synthesis and the genes related to milk fat synthesis in mammary epithelial cells after -sitosterol treatment were detected by qRT-PCR.The results showed that the higher dose(40-120 mol/L)-sitosterol significantly inhibited the cell viability of mouse mammary epithelial cells(P0.05).Thus,the mammary epithelial cells were treated with 5,10,20 mol/L-sitosterol in subsequent experiments.-sitosterol significantly increased the mRNA expression level of casein genes CSN1S1,CSN2,CSN3 and the genes related to milk protein synthesis pathway JAK2,STAT5,mTOR,S6K1(P0.05).-sitosterol significantly up-regulated the mRNA expression of the key regulatory factors of milk fat synthesis SREBF1,PPARG,PPARGC1A and the genes related to fatty acid synthesis ACC,FAS and SCD(P0.05).Thus,-sitosterol can promote the synthesis of milk protein and milk fat by regulating the expression of genes related to milk protein synthesis and milk fat synthesis in mouse mammary epithelial cells.Key words：-sitosterol;mammary epithelial cells;milk protein;milk fat;gene expression-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的影响 刘莉莉 陈 敏（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040）作者简介：刘莉莉，博士，教授，研究方向为中药对泌乳的调控。收稿日期：2023-05-18基金项目：国家自然科学基金项目8200393075试验研究2023年第44卷第20期 总第689期哺乳动物乳汁是最适合新生动物健康生长发育的天然营养物，乳汁含有丰富的蛋白质和脂肪，这些乳营养成分的合成与乳腺上皮细胞一些重要功能基因及信号转导通路的调控密切相关。乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占乳蛋白的80%，故其含量的高低常作为评价乳汁营养价值的重要指标。雷帕霉素靶点（mTOR）信号途径以及酪氨酸激酶 2/信号转导和转录激活因子 5（JAK2/STAT5）信号途径主要调控乳蛋白的合成，而且mTOR信号通路与JAK2/STAT5信号通路可相互影响协同调控乳蛋白的合成1。乳脂的主要成分是三酰甘油，主要由脂肪酸和磷酸甘油在乳腺上皮细胞中合成。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）和固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）是乳脂肪合成与分泌过程中最重要的两个调控因子，在乳脂肪合成基因网络中处于枢纽位置，二者可通过结合靶基因，影响乳腺对脂肪酸的摄取、转运、从头合成和酯化过程2。提高乳质量及泌乳量是目前哺乳动物亟待解决的重要问题，天然药用植物及其提取物具有低毒、无残留、不易产生耐药性等优点，用于增乳有其独特优势。研究发现低剂量葛根素能增强小鼠乳腺乳蛋白和乳脂肪合成相关蛋白表达，提升乳品质3。槲皮素可以改善乳质量，提高小鼠乳蛋白、乳糖和乳脂肪合成相关基因的表达4。-谷甾醇作为一种植物甾醇，是很多药用植物的重要组成成分。临床试验研究证实-谷甾醇具有降胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等多种生物活性。此外，研究发现-谷甾醇还可通过雌激素受体途径调节下游靶基因的表达而发挥植物雌激素样活性的作用5-6。植物雌激素是许多植物中的天然化学成分，结构类似于雌激素17-雌二醇，可以与动物雌激素受体结合，发挥雌激素样活性7。许多增乳药用植物的活性成分中含有植物雌激素，其可通过调节泌乳相关激素的活性，促进乳腺发育，进而影响动物泌乳性能。然而关于-谷甾醇对小鼠乳腺上皮细胞（HC11）乳蛋白、乳脂肪的合成是否有影响尚未见报道。本研究以HC11细胞为模型，采用MTT法检测不同浓度-谷甾醇对HC11细胞增殖能力的影响，qRT-PCR技术检测-谷甾醇作用的HC11细胞中乳蛋白和乳脂肪合成相关基因的表达情况，为探讨-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成的调节机理提供理论基础，为利用天然植物活性成分提高哺乳动物乳品质提供参考。1 材料与方法 1.1 材料小鼠乳腺上皮细胞（HC11）购自北京北纳创联生物技术研究院。-谷甾醇购自成都瑞芬思生物科技有限公司；MTT法细胞活力检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RPMI-1640 干粉、胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；Trizol 购自 Invitrogen 公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自TaKaRa公司。1.2 HC11细胞的培养37、5%CO2培养条件下，利用生长培养基（RPMI-1640+10%FBS）培养 HC11 细胞，每隔 24 h 更换新鲜培养基。1.3-谷甾醇对HC11细胞活力影响的检测试验分为对照组（接种HC11细胞但不加药处理）和不同浓度（5、10、20、40、80、100、120 mol/L）-谷甾醇组。每组5个重复孔。于96孔板中接种对数生长期的HC11细胞（1104个/孔），培养过夜，更换新鲜培养基并添加-谷甾醇，作用24 h后，各孔加入10 L MTT（5 mg/mL）继续培养4 h，吸出培养液，各孔分别加入100 L DMSO，振荡10 min，酶标仪检测490 nm的各孔吸光度（OD）值并进行计算，试验重复3次。1.4-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因表达影响的检测 取对数生长期的HC11细胞接种于6孔板中，待培养板中细胞融合度达到70%80%时，更换新鲜培养基，对照组HC11细胞添加正常细胞培养基，各试验组HC11细胞在添加正常细胞培养基的基础上，同时分别添加不同浓度的-谷甾醇（5、10、20 mol/L），每组设置5个重复孔。-谷甾醇作用细胞48 h，收集细胞，Trizol法提取RNA，根据Prime ScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书进行反转录，利用qRT-PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM）检 测 HC11 细 胞 CSN1S1、CSN2、CSN3、mTOR、STAT5、JAK2、S6K1、4EBP1、SREBF1、PPARG、PPARGC1A、ACC、FAS、SCD 基因的mRNA表达水平。各基因的引物序列见表1，-actin为内参基因。采用2-Ct相对定量的方法计算各基因的mRNA表达丰度。1.5 数据处理试验数据均以“平均数标准差”表示；采用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析，P0.05），而-谷甾醇添加量达到40 mol/L后，细胞活力随-谷甾醇添加浓度的升高而显著下降（P0.05）。后续试验采用对 HC11 细胞活力无抑制效果的 5、10、20 mol/L-谷甾醇处理细胞，以探究其对HC11细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因表达的影响。表1 实时荧光定量 PCR引物序列基因 CSN1S1CSN2CSN3STAT5JAK2mTOR4EBP1S6K1ACCFASSCDSREBF1PPARGPPARGC1A-actin引物序列（53）F:TGCAGCATCTGAGGAACAAGR:TTCCAGGGTGCACTGGTTGF:TCACTCCAGCATCCAGTCACAR:GGCCCAAGAGATGGCACCAF:TTCAAACTGCCGTGGTGAGAR:GGCTAGCAGTAGCAGGCAAAF:TTTGTGATTGCTCGGTGTGR:AAGGGATGGTGGGAACGF:CGAGCGAAGATCCAAGACR:GCAGGGTTTCCAGGTTTATF:TCATCGAGGTGGATGACGAGR:CGCTGATCCGGACCACATAF:AAGCAGGAGAAGCCAAAGR:GAAGAACCACAGAACCCACF:CATGGCAGGAGTGTTTGAR:TCATATGGTCCAACTCCCF:GAGAGGGGTCAAGTCCTTCCR:ACATCCACTTCCACACACGAF:ATCAGAAATTCAGCCCGTTGR:AAGTTGCATCCACCCAAATCF:CTAGGCTTGCCTTTGTCCAGR:GGTAGGGAGGATCTGGAAGCF:CTTCTGGAGACATCGCAAACR:GGTAGACAACAGCCGCATCF:GGAAGACCACTCGCATTCCTTR:GTAATCAGCAACCATTGGGTCAF:CCATACACAACCGCAGTCGCR:GTGGGAGGAGTTAGGCCTGCF:ACCGTGAAAAGATGACCCAGR:AGCCTGGATGGCTACGTACA细胞活力(%)5102010001201008060402004080aaaabcd-谷甾醇浓度（mol/L）注：柱顶字母不含有相同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。图1-谷甾醇对HC11细胞活力的影响2.2-谷甾醇对HC11细胞酪蛋白及乳蛋白合成相关基因表达的影响不同浓度-谷甾醇对 HC11 细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响如图2所示，与对照组相比，5、10、20 mol/L 的-谷甾醇均能显著提高 HC11 细胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA表达水平（P0.05），其中5 mol/L-谷甾醇组细胞CSN1S1、CSN2、CSN3基因mRNA表达水平相对更高。基因相对表达量CSN1S186420CSN2CSN3ddaaaababbcc0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lc酪蛋白基因图2-谷甾醇对HC11细胞酪蛋白基因mRNA表达的影响不同浓度-谷甾醇作用下HC11细胞中乳蛋白合 成 信 号 通 路（JAK2/STAT5 和 mTOR）相 关 基 因 mRNA表达水平的变化如图3所示，与对照组相比，5、10、20 mol/L的-谷甾醇组HC11细胞STAT5、JAK2、mTOR 和 S6K1 基因 mRNA 表达水平均显著升高（P0.05），而20 mol/L的-谷甾醇能显著提高HC11细胞4EBP1基因的mRNA表达（P0.05）。基因相对表达量STAT586420JAK2mTORdaabababbcd0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/LS6K14EBP1cccabbb ba乳蛋白合成信号通路相关基因图3-谷甾醇对HC11细胞乳蛋白合成信号通路相关基因mRNA表达的影响2.3-谷甾醇对HC11细胞乳脂肪合成相关基因表达的影响77试验研究2023年第44卷第20期 总第689期不同浓度-谷甾醇对HC11细胞脂肪酸合成相关基因mRNA水平影响的检测结果如图4所示，与对照组相比，5、10、20 mol/L 的-谷甾醇均能明显上调HC11细胞ACC基因和SCD基因的mRNA表达水平（P0.05）；而20 mol/L的-谷甾醇能显著提高FAS基因mRNA的表达（P0.05）。基因相对表达量ACC6420FASSCDcdabbaaabcb0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lb脂肪酸合成相关基因图4-谷甾醇对HC11细胞脂肪酸合成相关基因mRNA表达的影响不同浓度-谷甾醇作用下HC11细胞中乳脂肪合成关键调控因子基因（SREBF1 和 PPARG）及其辅助因子PPARGC1A基因mRNA表达水平的变化如图5所示，与对照组 HC11细胞相比，5、10、20 mol/L 的-谷甾醇均能显著提高 HC11 细胞 SREBF1、PPARG和 PPARGC1A 基因 mRNA 表达水平（P0.05）。其中5 mol/L-谷甾醇组细胞PPARG基因和PPARGC1A基因mRNA表达水平相对最高，10 mol/L-谷甾醇组细胞SREBF1基因mRNA表达水平相对最高。基因相对表达量SREBF16420PPARGPPARGC1Accaabaacbbd0 mol/L10 mol/L5 mol/L20 mol/Lb乳脂肪合成信号通路相关基因图5-谷甾醇对HC11细胞乳脂肪合成信号通路相关基因mRNA表达的影响3 讨论乳腺上皮细胞是乳蛋白、乳脂肪等营养物质合成的主要场所。哺乳动物的泌乳功能与乳腺上皮细胞的数目以及其分泌与合成乳成分的能力密切相关。郭惠中8研究表明低剂量-谷甾醇对瘢痕疙瘩成纤维细胞活性无显著影响，而高剂量-谷甾醇表现出明显抑制作用。王凯等9研究发现随着-谷甾醇添加剂量的升高，肝癌细胞Hep3B和HepG2的细胞活力逐渐降低。与前人的研究结果一致，本研究发现低浓度的-谷甾醇对HC11细胞活力无明显影响，而高浓度-谷甾醇对HC11细胞活力具有显著抑制作用，因此后续试验选择对HC11细胞活力无抑制作用的-谷甾醇剂量来研究其对HC11细胞泌乳功能的影响。乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成10。乳中含量最高的蛋白质是酪蛋白，约占总乳蛋白的80%，主要分为4种：s1-酪蛋白（CSN1S1）、s2-酪蛋白（CSN1S2）、-酪蛋白（CSN2）以及-酪蛋白（CSN1S3）11。乳蛋白合成主要由2条信号通路调控，分别是在催乳素或其他泌乳相关细胞因子作用下从基因转录水平调节乳蛋白合成的JAK2/STAT5信号通路和从蛋白质翻译水平调节乳蛋白合成的mTOR信号通路。当催乳素等配体与乳腺细胞表面的受体结合后激活JAK2，活化的 JAK2磷酸化转录因子 STAT5，激活的 STAT5蛋白形成二聚体，进入细胞核调控下游乳蛋白相关基因的表达，促进泌乳以及乳蛋白的合成12。激活的mTOR磷酸化其下游效应因子真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1（4EBP1）和核糖体蛋白S6激酶1（S6K1），被激活的S6K1能增强含嘧啶基因mRNA的翻译效率，调节乳蛋白的合成13。而真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）与未磷酸化的4EBP1结合，对蛋白质的翻译产生抑制作用，4EBP1经 mTOR磷酸化后会与 eIF4E脱离，减弱4EBP1和eIF4E结合对蛋白质翻译的抑制作用，促进乳蛋白的合成14。研究发现具有植物雌激素作用的芦丁能显著提高奶牛乳腺上皮细胞CSN1S1基因和CSN2基因的mRNA表达，对乳蛋白合成具有促进作用15。作为黄酮类植物激素的槲皮素能显著上调产后缺乳小鼠CSN2基因的表达量4。植物雌激素葛根素可能通过催乳素受体激活JAK2/STAT5a信号通路提高-酪蛋白的表达，实现对小鼠乳腺泌乳过程的调控3。和雌激素、催乳素作用相似的王不留行能提高磷酸化 STAT5、mTOR及 S6K1的表达，进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的合成16。与以往的研究结果类似，本试验结果表明，添加低剂量-谷甾醇能显著提高CSN1S1、CSN2和CSN3的mRNA水平，同时显著上调 JAK2、STAT5、mTOR 和 S6K1 的 mRNA 表达，但低剂量-谷甾醇对 4EBP1的 mRNA表达无显78SILIAO GONGYE2023年第44卷第20期 总第689期著影响。这些结果提示低剂量的-谷甾醇可能发挥植物雌激素的作用，激活HC11细胞JAK2/STAT5通路和mTOR通路，进而促进乳蛋白的合成。但相比较而言，高剂量的-谷甾醇可能会减弱乳腺上皮细胞合成分泌乳蛋白。SREBF1是调节乳脂肪合成的关键转录因子，参与调控乳脂肪合成过程中多种转运蛋白和关键酶的表达，影响乳腺三酰甘油的合成和分泌17。Ma等18研究发现 SREBF1基因的低表达会抑制脂肪酸从头合成相关基因ACC、FAS、SCD和脂肪酸结合蛋白FABP3的表达。PPARG属于核激素受体家族中的配体激活受体，可通过调节乳腺中与脂肪酸摄取、活化、运输、从头合成、去饱和、三酰甘油合成相关的生脂基因表达及 SREBP1的表达而在乳脂肪合成中发挥关键作用19。PPARGC1A是PPARG基因的共激活因子，它通过与转录因子PPARG的互作而结合在靶基因的启动子区，协助调节基因表达20。Kadegowda 等21使用PPARG激动剂罗格列酮处理奶牛乳腺上皮细胞，发现脂肪酸从头合成基因（ACC、FAS、SCD）及转录调控基因（SREBF1）的表达量均上调。乳脂肪合成的过程也受到mTOR信号通路的调节，激活的mTOR信号通路可以通过eIF4E、4EBP1和S6K等下游信号分子，上调SREBF1和PPARG等转录调控因子的表达以促进乳脂肪合成22-23。研究发现类激素物质大豆异黄酮能明显促进奶牛乳腺上皮细胞-酪蛋白和三酰甘油的合成和分泌24。槲皮素可以提高产后缺乳小鼠乳腺脂肪酸合成相关基因FAS和SCD的表达4。王不留行黄酮苷能上调mTOR和SREBF1c的表达，促进奶牛乳腺上皮细胞-酪蛋白和三酰甘油合成25。与以前的研究结果相似，本研究发现-谷甾醇上调乳脂肪合成转录因子 SREBF1、PPARG 及辅助因子 PPARGC1A基因表达的同时，也促进了ACC、FAS、SCD基因的表达，提示-谷甾醇可能通过激活mTOR信号通路调控以SREBF1与PPARG为核心的乳脂肪合成基因网络，上调脂肪酸合成关键酶相关基因的表达，进而促进乳腺三酰甘油的合成与分泌。4 结论-谷甾醇可通过JAK2/STAT5和mTOR信号通路调节酪蛋白基因CSN1S1、CSN2和CSN3的表达；也可上调PPARG与SREBF1乳脂肪合成关键转录因子的表达进而调控脂肪酸合成相关基因ACC、FAS和SCD的表达。当-谷甾醇添加浓度为510 mol/L时，对小鼠乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成相关基因表达的促进效果较好。参考文献1 SHU X,FANG Z Y,GUAN Y,et al.High levels of fatty acids inhibit-casein synthesis through suppression of the JAK2/STAT5 and mTOR signaling pathways in mammary epithelial cells of cows with clinical ketosisJ.Journal of Dairy Research,2020,87(2):212-219.2 陈美庆,张养东,郑楠,等.短链脂肪酸调控奶牛乳腺乳脂合成作用机制的研究进展J.动物营养学报,2022,34(3):1426-1433.3 杨亚洁.葛根素对产后小鼠泌乳作用的影响及机制研究D.硕士学位论文,北京:北京中医药大学,2021.4 林曼.槲皮素对产后缺乳模型小鼠的治疗作用及其机制研究D.硕士学位论文,广州:广东药科大学,2018.5 陈跃平,谢婷,张昊,等.-谷甾醇的生理功能及其在动物生产中的应用研究进展J.动物营养学报,2022,34(5):2721-2731.6 陶仕英,牛建昭,赵丕文,等.-谷甾醇对T47D细胞雌激素受体表达及其下游基因 PS2 的影响J.中国中医基础医学杂志,2015,21(2):165-167,174.7 李从文,魏云林.植物雌激素的特性及其应用研究进展J.基因组学与应用生物学,2020,39(3):1264-1269.8 郭惠中.中草药独角莲根茎提取物-谷甾醇(-sitosterol)对瘢痕疙瘩成纤维细胞作用的实验研究D.硕士学位论文,大连:大连医科大学,2015.9 王凯,李卫,李志芳,等.-谷甾醇靶向CDC25B抑制肝癌细胞增殖J.中山大学学报:医学科学版,2022,43(4):675-684.10 赵笑,白沙沙,孔凡华,等.乳蛋白功能特性及其分析检测技术研究进展J.中国乳品工业,2022,50(1):37-42.11 苏芮,刘阳,闫素梅,等.维生素A对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响J.动物营养学报,2018,30(8):3151-3158.12 李文清,王加启,南雪梅,等.奶牛乳糖合成及泌乳相关基因和细胞信号通路的研究进展J.中国畜牧兽医,2012,39(11):104-111.13 LI F,HU G Q,LONG X Y,et al.Stearic acid activates the PI3K-mTOR-4EBP1/S6K and mTOR-SREBP-1signaling axes through FATP4-CDK1 to promote milk synthesis in primary bovine mammary epithelial cellsJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2022,70(13):4007-4018.14 YUAN X H,ZHANG L,CUI Y J,et al.NCOA5 is a master regulator of amino acid-induced mTOR activation and-casein synthesis in bovine mammary epithelial cellsJ.Biochemical and Biophysical Research Communications,2020,529(3):569-574.15 唐宇杰,卢浩诚,韩兆玉,等.芦丁对热应激奶牛生产性能的影响J.南京农业大学学报,2021,44(6):1144-1153.16 孟海洋,孙晓旭,王立娜,等.王不留行对奶牛乳蛋白合成信号转导通路的影响J.中国畜牧兽医,2013,40(4):121-124.17 辛慧杰,刘建新,石恒波.关键转录因子调节反刍动物乳腺脂肪酸代谢的研究进展J.农业生物技术学报,2020,28(5):918-924.18 MA L,CORL B A.Transcriptional regulation of lipid synthesis in bovine mammary epithelial cells by sterol regulatory element binding protein-1J.Journal of Dairy Science,2012,95(7):3743-3755.79试验研究2023年第44卷第20期 总第689期19 LIU L L,LIN Y,LIU L X,et al.Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma on milk fat synthesis in dairy cow mammary epithelial cellsJ.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal,2016,52(10):1044-1059.20 LIN J,HANDSCHIN C,SPIEGELMAN B M.Metabolic control through the PGC-1 family of transcription coactivatorsJ.Cell Metabolism,2005,1(6):361-370.21 KADEGOWDA A K,BIONAZ M,PIPEROVA L S,et al.Peroxisome 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要：试验以大米蛋白为原料，利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解的方法，结合超声处理技术，制备大米蛋白肽，并通过傅里叶变换红外光谱仪和氨基酸分析仪对产物性质进行分析。试验结果表明，大米蛋白经过复合酶解后，溶解度和溶液中短肽含量都有显著提高，产物的红外出峰位置与蛋白肽基本一致，具备多肽基本结构，并且产物具有8种必需氨基酸，氨基酸组成丰富，具有较高营养价值。关键词：大米蛋白；中性蛋白酶；碱性蛋白酶；傅里叶变换红外光谱；氨基酸组成doi:10.13302/ki.fi.2023.20.013中图分类号：S816 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）20-0080-06Study on The Preparation of Rice Peptides by Double Enzymatic MethodGU Jierui LIU Keyi DING Feng LIU Wuruo WEN Yingyue LI Piwu*(State Key Laboratory of Biobased Materisls and Green Papermaking,Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences),Shandong Ji nan 250353,China)Abstract：Rice protein peptides were prepared by using alkaline protease and neutral protease complex enzymatic solutions,combined with ultrasonic treatment technology,and the properties of the products were analyzed by Fourier infrared spectrometer and amino acid analyzer.The experimental results show that after the rice protein is compounded,the solubility and the content of short peptides in the solution are significantly improved,the infrared peak position of the product is basically consistent with the protein peptide,has the basic structure of the polypeptide,and the product has eight kinds of amino acids necessary for the human body,and the amino acid composition is abundant and has high nutritional value.Key words：rice protein;neutral proteases;alkaline proteases;Fourier transform infrared spectroscopy;amino acid composition作者简介：顾杰瑞，硕士，研究方向为生物工程。*通讯作者：李丕武，博士，教授，硕士生导师。收稿日期：2023-08-15基金项目：国家重点研发计划2019YFC1905902；山东省重大科技创新工程2020CXGC01060380