不同氮肥利用效率粳稻品种筛选及基因型鉴定.pdf

江西农业学报 2023，35（09）：2934ActaAgriculturaeJiangxiDOI:10.19386/ki.jxnyxb.2023.09.005不同氮肥利用效率粳稻品种筛选及基因型鉴定何弯弯，王友霜，赵轶鹏，薛 炮，王健康，丁成伟，丁震乾，陈秋丽，胡婷婷*（江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221121）摘 要:以适宜黄淮地区种植的19个常规中熟中粳品种（系）为研究对象，通过设置3个氮肥水平（0、200和300 kg/hm2）研究了不同品种间的氮肥利用效率及农艺性状的变化规律，以此筛选氮高效利用的常规粳稻品种。结果表明：在3种氮肥水平下，19个品种间的氮肥农学利用率及产量相关因素变异显著，其中氮肥农学利用率与株高、穗长、有效穗数、单株谷重呈极显著正相关，株高、结实率、有效穗数、单株谷重随着氮素含量的增加而提高，每穗粒数、氮肥农学利用率随着施氮量的增加而下降。通过不同氮素水平下的产量相关性状分析，筛选出徐63826和南粳5718等2个氮高效利用品种。利用氮高效利用基因NRT1.1B的分子标记对19份常规中熟中粳品种（系）进行检测，结果表明：徐稻3号、徐稻9号及徐香粳16号等18个品种携带nrt1.1b基因型，仅徐63826携带氮高效利用基因NRT1.1B基因型。结合3种氮素水平下的农艺性状与基因型分析，最终筛选出2个氮高效利用品种，其中徐63826携带NRT1.1B基因，南粳5718携带nrt1.1b基因。关键词:水稻；氮肥利用效率；氮高效利用基因 中图分类号：S511.22 文献标志码：A 文章编号：1001-8581（2023）09-0029-06Screening and Genotype Identification of Japonica Rice Varieties with Different Nitrogen Use Efficiency HEWan-wan,WANGYou-shuang,ZHAOYi-peng,XUEPao,WANGJian-kang,DINGCheng-wei,DINGZhen-qian,CHENQiu-li,HUTing-ting*(XuzhouInstituteofAgriculturalSciencesinJiangsuXuhuaiArea,Xuzhou221121,China)Abstract:Inordertoscreenoutinbredjaponicaricevarietieswithhighnitrogenuseefficiency,19inbredmiddle-ripejaponicaricevarieties(lines)suitableforHuanghuaiRegionwereselectedastheexperimentalmaterials,andthechangesofnitrogenuseefficiencyandagronomictraitsamongdifferentvarietieswerestudiedunderthetreatmentofthreenitrogenlevels(0,200and300kg/hm2).Theresultsshowedthatthenitrogenagronomicefficiencyandyield-relatedfactorsvariedsignificantlyamong19varietiesunderthreenitrogenlevels,andthenitrogenagronomicefficiencywaspositivelycorrelatedwithplantheight,paniclelength,effectivepaniclenumberandgrainsweightperplant.Plantheight,seedsettingrate,effectivepaniclenumberandgrainweightperplantincreasedwiththeincreaseofnitrogenapplication.Thegrainnumberperpanicleandthenitrogenagronomicefficiencydecreasedwiththeincreaseofnitrogenapplication.Throughtheanalysisofyield-relatedcharactersunderdifferentnitrogenlevels,Xu63826andNanjing5718werescreenedoutastwovarietieswithhighnitrogenutilizationefficiency.ThemolecularmarkersofhighnitrogenuseefficiencygeneNRT1.1Bwereusedtodetect19inbredmid-ripejaponicaricevarieties(lines).Theresultsshowedthat18varietiesincludingXudao3,Xudao9andXuxiangjing16carriednrt1.1bgene,butonlyXu63826carriedhighnitrogenuseefficiencygeneNRT1.1B.Combiningtheagronomiccharactersandgenotypesunderthreenitrogenlevels,twovarietieswithhighnitrogenutilizationefficiencywerefinallyscreenedout,ofwhichXu63826carriedNRT1.1BgeneandNanjing5718carriednrt1.1bgene.Key words:Rice;Nitrogenuseefficiency;Highnitrogenefficiencygene0 引言我国既是世界上水稻产量和消费量最大的国家，也是化肥消费量最大的国家，2021年我国化肥总用量为5191.26万t，其中氮肥施用量为1745.32万t，单位面积施氮量超过了世界平均施氮水平的3倍，但利用率却远低于世界平均水平。过度施用氮收稿日期：2023-06-27基金项目：江苏省重点研发计划项目（BE2021359）；徐州市青年科技人才项目（KC21035）；徐州市重点研发项目（KC22073）。作者简介：何弯弯（1989），女，河南商丘人，助理研究员，博士，研究方向为水稻遗传育种。*通信作者：胡婷婷。江 西 农 业 学 报35 卷30肥导致氮素利用效率降低，不仅会增加农业生产成本、污染环境、破坏生态，而且还会降低水稻产量和稻米品质以及加重病虫害的发生1-3。因此，提高氮素的利用率，减少氮肥的施用量，发展绿色、高效可持续农业已经成为当下农业领域的研究热点。黄淮稻区年产水稻达100亿kg，是我国主要优质粳稻的生产基地，但近年来产量和品种并未显著提高，可能原因是一方面由于当地耕作模式，偏施氮肥，导致氮肥过剩，这不仅未能提高水稻的产量，还导致了水稻品质降低，氮肥利用效率也显著降低；另一方面，近年来水稻品种呈现出井喷式增长，农民对品种的选择、施肥用量及施用时期并不明晰，因此，需要不断筛选氮高效品种并指导农户进行适时适量施肥。水稻氮肥利用效率在品种的基因型间存在显著的差异，筛选和培育水稻氮高效利用品种是提高氮肥利用效率的有效途径。刘秋员等4对长江中下游地区105份常规中熟粳稻品种（系）进行氮素吸收利用效率筛选，获得了19个高产氮高效利用品种（系）；张玉屏等5对12个早稻品种进行氮利用效率筛选，获得3个氮高效型品种。随着分子生物学的发展，OsNRT2.36、OsPTR67、OsNAR2.18和NRT1.1B9等参与氮素吸收调控的基因被克隆，其中NRT1.1B是氮高效利用的一个关键基因，将籼稻NRT1.1B基因导入粳稻中，氮肥利用效率可提高10%30%。为了筛选出携带了氮高效利用基因NRT1.1B的材料，李军等10利用NRT1.1B基因在籼稻和粳稻中存在的插入/缺失位点，设计出InDel分子标记；方琳等11开发了NRT1.1B的等位基因特异PCR功能标记；牛付安等12根据NRT1.1B基因中的SNP位点，开发了一个高通量鉴定的KASP标记。综上，NRT1.1B分子标记的开发及利用为氮高效利用分子标记辅助育种提供了科学依据。本研究以适合黄淮地区种植的19个粳稻品种为研究对象，设置3种施氮处理，统计分析了不同施氮量条件下各个粳稻品种的氮肥农学利用率、产量、产量构成因素的特点与差异。同时利用方琳等11开发的NRT1.1B功能标记对19个品种进行了基因检测，通过表型与基因型相结合，为粳稻氮高效分子育种及培育氮高效品种提供了科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料供试水稻品种（系）来自江苏、山东、河南、天津、浙江等省（市）的19份中熟中粳品种（表1）。所选品种均适宜在徐州种植。表1 供试品种（系）名称及来源品种（系）来源品种（系）来源徐稻3号江苏天隆粳6号天津徐稻9号江苏矮丰80山东徐香粳16号江苏圣香66山东徐63646江苏徐92126江苏宁香粳9号江苏武运粳27江苏济软粳1802山东徐63826江苏泗稻301江苏新科稻37河南连粳198江苏南粳5718江苏武育粳3号江苏苏秀867浙江南粳55江苏1.2 农艺性状的考察及统计试验于2022年在徐州市农科院大庙试验基地（117 24 E，34 17 N）进行。试验土壤为砂质土，前茬作物为小麦，耕作层的有机质、有效磷和速效钾含量分别为23.9g/kg、36.1mg/kg和236mg/kg。试验采用双因素裂区设计，以不施氮肥N0、正常氮肥N200（纯氮200kg/hm2）和过量氮肥N300（纯氮300kg/hm2）为主区，品种为副区，主区内各品种随机排列，每裂区2次重复。将氮肥折合成纯氮，按基肥分蘖肥穗肥=424的比例施用。磷肥（P2O512%）和钾肥（K2O60%）按照360、240kg/hm2的施用量于移栽前3d一次性施入。参照水稻种质资源描述规范的要求，每个小区内选取5株代表性的植株，记录株高、穗长、每穗粒数、穗实粒数、有效穗数、千粒重、单株谷重等性状。1.3 数据分析方法利用Excel2017和SPSS27.0软件对试验数据进行处理和分析。氮肥农学利用率的计算公式为：氮肥农学利用率（kg/kg）=（施氮区籽粒产量无氮区籽粒产量）/施氮量1.4 氮高效利用基因NRT1.1B的检测参考前人报道，合成能够扩增NRT1.1B基因引物序列（表2），以日本晴和9311为对照，引物1nrt（NRT-F和1nrt-R）能扩增出日本晴的nrt1.1b基因，而引物1NRT（NRT-F和1NRT-R）能扩增出9311的NRT1.1B基因。采用CTAB法提取水稻叶片基因组DNA。20 LPCR扩增反应体系为：DNA模板1 L（100200ng），引物1.0L（1.0mol/L），dNTPs0.5L（10mmol/L），PCRbuffer2L（10），TaqDNA聚合酶9 期何弯弯等：不同氮肥利用效率粳稻品种筛选及基因型鉴定310.2 L（5U/L）和灭菌双蒸水15.3L。聚合酶链式反应（PCR）扩增的程序：95预变性5min；95变性40s，52退火40s，72延伸30s，共32个循环；最后72延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，在凝胶成像仪上拍照记录13。表2 氮高效利用基因及抗稻瘟病基因的分子标记引物基因名称引物名称引物序列目标片段长度/bp退火温度/nrt1.1BNRT-FATTCATCCATTTCTGCCTTTG476551nrt-RCCTCCACTTGCTCGCCGNRT1.1BNRT-FATTCATCCATTTCTGCCTTTG476551NRT-RCCTCCACTTGCTCGCCA2 结果和分析2.1 不同氮肥处理对粳稻农艺性状的影响由表3可知，N200和N300处理的株高平均值大于N0水平的株高平均值，在0300kg/hm2施氮范围内，增加氮肥用量能够提高水稻的株高；穗长平均值、千粒重的平均值在3种氮素条件下的变化不明显；结实率平均值在3种氮素水平下差异明显，N200和N300处理的结实率平均值比N0高8.09%和10.41%，由此可知，施氮肥能够提高水稻的结实率；每穗粒数平均值在N0条件下最高，减氮能提高每穗粒数；有效穗数随着施氮量的增加而增加，施用氮肥会提高有效穗数，对水稻的产量因素产生正向影响；单株产量平均值在3种氮水平下存在差异，在0300kg/hm2施氮范围内，单株产量的平均值会随着施氮量的增加而增加，其中在N200处理的最大值与最小值差异最大，变异系数达23.92%，说明氮肥对水稻产量影响较大，且品种间存在明显的基因型差异；氮肥农学利用率在N200和N300水平下变异系数分别为77.47%和55.28%，这说明不同品种间的氮肥农学利用率存在较大差异。表3 不同施氮处理对粳稻农艺性状的影响项目施氮处理最小值最大值平均值标准差变异系数/%株高/cmN068.3985.4974.403.975.33N20070.9789.0379.245.637.11N30074.0693.1080.635.636.98穗长/cmN014.2617.4015.680.976.19N20012.6619.3715.281.439.34N30013.1416.3115.290.905.90结实率/%N058.3095.4378.8910.5913.42N20070.3195.4185.276.587.71N30069.4197.9687.107.428.52千粒重/gN023.8431.4826.932.147.96N20023.3330.7326.932.308.54N30024.4131.7927.012.127.83每穗粒数/粒N094.87206.24125.9626.3220.89N20080.85143.72117.3018.0715.41N30081.98152.40119.4317.6314.76有效穗数/个N04.337.605.460.8816.08N2004.8312.627.771.8623.92N3006.6714.118.581.6819.60单株谷重/gN010.2921.3115.342.8718.74N20010.6323.3417.103.7021.67N30014.9628.4219.753.0215.30氮肥农学利用率/(kg/kg)N2001.8032.1210.127.8477.47N3002.3722.949.615.3155.28江 西 农 业 学 报35 卷322.2 农艺性状与氮肥农学利用率的相关性分析由表4可知，穗长与株高、每穗粒数、氮肥农学利用率呈极显著正相关，与单株谷重呈显著正相关；结实率与株高、单株谷重呈显著正相关；每穗粒数与株高、穗长呈极显著正相关，与有效穗数呈显著正相关；有效穗数与株高、单株谷重、氮肥农学利用率呈极显著正相关，与每穗粒数呈显著负相关，这意味着增加有效穗数虽然可以提高产量，但也会伴随着每穗粒数的下降；单株谷重与株高、有效穗数、氮肥农学利用率呈极显著正相关，与穗长、结实率呈显著正相关，这表明提高有效穗数和结实率的同时，单株谷重也会增加；氮肥农学利用率与株高、穗长、有效穗数、单株谷重呈极显著正相关，这说明通过增加氮肥用量，能够提高植株的有效穗数、单株谷重、穗长，从而促进产量的形成及氮肥农学利用率的提高，但株高增高易产生倒伏。氮肥农学利用率受多个产量构成因素的影响，但各农艺性状间存在一定的关联性，因此，要提高水稻产量及氮肥农学利用率，需要综合考虑各项指标。表4 农艺性状与氮肥农学利用率的相关性分析项目株高穗长结实率千粒重每穗粒数有效穗数单株谷重氮肥农学利用率株高1穗长0.440*1结实率0.291*-0.0701千粒重0.050-0.0900.0701每穗粒数0.367*0.639*0.010-0.2501有效穗数0.499*-0.0500.2200.190-0.290*1单株谷重0.640*0.262*0.298*0.1000.2200.649*1氮肥农学利用率0.654*0.543*0.1800.1800.2700.737*0.565*1注：*、*分别表示在0.05、0.01水平下相关显著、极显著。2.3 K-均值聚类分析利用SPSS27.0软件对19份材料在2种氮素处理下的产量相关性状进行聚类分析，聚类结果最终分成了3组（表5）。在N200处理条件下，每组包含的品种数分别为5、9、5，其中第1组品种的徐稻3号和徐63826的氮肥农学利用率分别为16.29和32.12；在N300处理条件下，每组包含的品种数分别为4、5、10，其中第2组品种中的南粳5718和苏秀867的氮肥农学利用率分别为17.24和14.21。在N200和N300处理下，徐63826和南粳5718的氮肥农学利用率均处于较高水平，说明这2个品种具有耐肥性，且在各种氮肥条件下，产量均能够显著提高。表5 不同施氮条件下供试材料各农艺性状聚类分析项目N200处理N300处理1组2组3组平均值1组2组3组平均值品种数/个595/4510/平均株高/cm82.2080.0274.8879.2475.0184.4280.9980.63平均穗长/cm15.6115.8413.9515.2814.0415.8015.5315.29平均结实率/%89.0685.7480.6385.2792.7490.1683.3187.10平均千粒重/g28.5926.0326.8826.9328.0226.5726.8327.01每穗粒数/粒110.71132.7896.02117.3096.93141.97117.16119.43有效穗数/个9.127.317.237.778.638.108.808.58单株谷重/g18.6018.0813.8117.1017.3221.2020.0119.75氮肥农学利用率/(kg/kg)16.5810.013.8610.126.1411.999.819.612.4 NRT1.1B基因的分子标记检测利用NRT1.1B基因的功能标记1nrt/1NRT对19份材料进行检测。以9311和日本晴为对照，1nrt引物能扩增出日本晴中nrt1.1b目标条带，且不能扩增出NRT1.1B目标条带，1NRT引物能扩增出9311中的NRT1.1B目标条带，但不能扩增出nrt1.1b目标条带。由图1可知，利用1nrt引物进行检测时（图1A），除了9311和徐63826未扩增出目的条带，其他19个品种均扩增出nrt1.1b目标条带；以1NRT为引物进行检测时（图1B），19个品种均9 期何弯弯等：不同氮肥利用效率粳稻品种筛选及基因型鉴定33未扩增出目标条带，而9311和徐63826能扩增出NRT1.1B目标条带。结果表明：徐稻3号、徐稻9号及徐香粳16号等19个品种携带nrt1.1b基因，而徐63826携带氮高效利用基因NRT1.1B。AInrtBINRTM123456789101112131415161718192021M：DL2000DNAMarker；121分别为9311、日本晴、徐稻3号、徐稻9号、徐香粳16号、徐63646、宁香粳9号、济软粳1802、泗稻301、连粳198、武育粳3号、南粳55、天隆粳6号、矮丰80、圣香66、徐92126、武运粳27、徐63826、新科稻37、南粳5718、苏秀867。图1 1nrt和1NRT对19份水稻品种（系）的分子检测3 讨论随着人口的增多及土地耕种面积的减少，我国一直将高产和超高产作为水稻育种的主要目标。近年来，为了保障高产及粮食安全，越来越多的高产耐肥水稻品种得到推广应用，氮素施用量越来越大，过度氮肥施用也带来了氮素利用率低、病虫害重、生产成本高、污染环境等问题14。越来越多的研究表明，筛选氮高效利用资源及选育氮高效利用新品种，不仅可以保障粮食安全，还能提高水稻氮肥利用效率，从而减少氮肥的施用量，达到保护生态环境，促进农业稳定可持续发展的目的。前人关于产量构成因素对产量作用大小的研究不尽相同，杨惠杰等15-17认为有效穗数对产量影响较大，而刘秋员等17-18认为千粒重对产量的影响相对较小，本研究结果表明，有效穗数与单株谷重呈极显著正相关，千粒重与单株谷重、有效穗数、结实率等产量构成因素的相关性不显著，这与前人研究结果一致。施氮量会对水稻氮肥利用效率产生较大影响，在一定施氮量下，随着氮肥的施用量的增加，产量也会随之增加，超过一定值后，产量则出现下降，氮肥利用率也随之下降19。张亚丽等20-21研究表明，在3种不同氮水平下，不同基因型粳稻品种的产量会随着施氮量的增加而增加；何佳芳等22研究表明，随着施氮量增加，氮肥农学利用率呈下降的趋势；白建江23研究表明在3种氮水平条件下，不同氮效率类型品种间的每穗粒数、结实率均存在显著性差异；冯洋24研究认为氮高效粳稻品种在低氮条件下的有效穗数、穗粒数、千粒重均高于氮低效粳稻品种。本研究结果表明，随着施氮量的增加，结实率、有效穗数、单株产量呈上升趋势，但氮肥农学利用效率呈下降趋势，这与前人的研究结论一致。从20世纪90年代开始，国际水稻研究所、南京农业大学等多个科研单位进行氮高效型品种筛选、选育等研究。孙志广等1对黄淮地区18份材料进行氮高效利用筛选，获得了3个氮高效品种；张旭宏25对34个江苏主推粳稻品种进行氮高效利用筛选，获得了11个氮高效利用品种。本研究通过对适宜黄淮地区种植的19份中熟中粳品种（系）进行氮高效利用鉴定，筛选得到了2个氮高效利用品种徐60235和南粳5718。这2个氮高效利用品种随着施氮量的增加，有效穗数、单株产量呈上升趋势，氮肥农学利用率呈下降趋势。近年来，在对水稻氮高效利用资源筛选鉴定的基础上，克隆了一些氮高效利用基因。Hu等9从籼稻IR24中克隆了NRT1.1B基因，该基因能够提高籼稻对氮肥的利用效率；李军等10利用NRT1.1B基因在籼稻和粳稻中存在的插入/缺失位点，设计出InDel分子标记；方琳等11通过分析109份材料序列，发现氮高效利用基因型NRT1.1B主要分布在籼稻中，而粳稻中均为等位基因nrt1.1b。前人根据NRT1.1B基因在籼、粳稻间碱基的差异，开发了一系列的分子标记，为开展分子标记辅助育种，选育氮高效品种奠定了基础。本研究利用方琳等11开发的NRT1.1B基因功能标记对19份材料进行分子检测，仅徐63826携带氮高效利用基因NRT1.1B。综合比较分析3种氮素水平下的农艺性状及氮肥农学利用效率，确定徐60235和南粳5718为氮高效利用品种，且徐63826携带了NRT1.1B氮高效利用基因。参考文献：1 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