SN∕T 5384-2021 辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 42 0 2 1辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fC h i l l i v e i n a lm o t t l ev i r u s2 0 2 1 - 0 6 - 1 8发布2 0 2 2 - 0 1 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位: 中华人民共和国福州海关、 福建农林大学、 中国检验检疫科学研究院、 中国农业科学院生物技术研究所、 中华人民共和国厦门海关。本文件主要起草人: 蔡伟、 高芳銮、 邓真、 陈细红、 张永江、 李为民、 李敏、 廖富荣、 林春滢、 杨宏凯。S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了辣椒脉斑驳病毒检测的程序和方法。本文件适用于进出境寄主植物及产品中辣椒脉斑驳病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法S N/T2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 辣椒脉斑驳病毒基本信息中文名: 辣椒脉斑驳病毒学名:C h i l l iV e i n a lM o t t l ev i r u s;C h i VMV。分类地位: 马铃薯Y病毒科(P o t y v i r i d a e) 、 马铃薯Y病毒属(P o t y v i r u s) 成员。辣椒脉斑驳病毒的寄主范围、 病害症状、 分布地区、 传播途径、 粒体形态、 基因组等其他信息参见附录A。5 原理辣椒脉斑驳病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。6 仪器设备、 用具及试剂6.1 仪器设备高速冷冻离心机、 电子天平(1/10 0 0g) 、P C R仪、 电泳仪、 水平电泳槽、-2 0低温冰箱和-8 0超低温冰箱、 凝胶成像分析系统、p H计、 微波炉、 磁力搅拌器、 恒温水浴锅、 高压灭菌锅、 超净工作台、 酶标仪等。6.2 用具各种量程的可调移液器(10 0 0L、2 0 0L、1 0 0L、2 0L、1 0L、2L) 、P C R反应管、 无R N a s e离1S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准心管(1.5m L) 、 研钵、 酶联板等。6.3 试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S - E L I S A) 试剂按照附录B执行、 免疫层析试纸条试剂按照附录C执行、R T - P C R试剂按照附录D执行。除另有规定外, 所有试剂均为分析纯, 实验用水应符合G B/T6 6 8 2中相关规定。7 检测与鉴定7.1 抽样检查按照S N/T2 1 2 2给出的方法进行抽样、 取样, 并检查植株是否有矮化、 畸型, 叶片花叶、 斑驳等疑似病毒危害症状。7.2 样品制备分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样; 无症状植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5g 1.0g待测样品按11 0( 质量: 体积,W/V) 加入抽提缓冲液, 用研钵研磨成浆,4下1 00 0 0g离心1 0m i n, 上清即为样品提取液, 用于D A S - E L I S A、 免疫层析试纸条和R T - P C R检测; 或称取0.1g待测样品提取核酸后用于R T - P C R检测。7.3 D A S - E L I S A具体方法按附录B检测。7.4 免疫层析试纸条具体方法按附录C检测。7.5 R T - P C R具体方法按附录D检测。7.6 序列测定与比对P C R产物纯化后直接测序或者克隆测序, 利用N C B I网站上的B L A S T软件把测序所得到的核苷酸序列与已知C h i VMV序列进行比对。8 结果判定D A S - E L I S A或免疫层析试纸条检测结果为阴性, 且R T - P C R检测结果为阴性, 则判定样品不携带C h i VMV。D A S - E L I S A或免疫层析试纸条检测结果为阴性, 但R T - P C R检测为阳性, 则需进一步序列测定。序列测定结果经比对分析为C h i VMV, 则判定样品携带C h i VMV。D A S - E L I S A或免疫层析试纸条检测结果为阳性, 则采用R T - P C R方法进行验证, 若验证结果为阳性, 则判定样品携带C h i VMV; 若验证结果为阴性, 则判定样品不携带C h i VMV。9 结果记录与样品保存9.1 结果记录记录好各项实验数据, 包括样品来源、 种类、 时间, 实验的时间、 地点、 方法和结果等, 并要有经手人2S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准和实验人员的签字。血清学D A S - E L I S A检测结果保留吸光值的数据报告、 免疫层析试纸条检测保留试纸条检测图片、R T - P C R检测结果保留电泳照片、 序列测定保留测序报告。9.2 样品保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-2 0或-8 0冰箱中, 并作好登记和标记工作, 以备复核用。3S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A( 资料性)辣椒脉斑驳病毒的背景资料A.1 寄主范围已报道的自然寄主为辣椒(C a p s i c u ma n n u u mL.) 、 烟草(N i c o t i a n at a b a c u mL.) 、 番茄(S o l a n u ml y c o p e r s i c u mL.) 、 茄子(S o l a n u m m e l o n g e n aL.) 等作物。A.2 病害症状该病毒在不同寄主上引起的症状存在一定差异。C h i VMV侵染辣椒后引起的典型症状是叶脉出现暗绿条纹, 叶沿皱缩, 叶片变小, 结果前严重落花。此外, 还可引起辣椒果实出现斑驳、 畸形等症状。见图A.1。( 引自h t t p: / /i p p c .a c f s .g o .t h/p e s t/G 0 0 1/T 0 0 6/V I R U S 0 0 7)图A.1 C h i VMV侵染引起的症状A.3 分布地区马来西亚、 韩国、 泰国、 印度、 中国、 日本、 朝鲜、 巴基斯坦、 菲律宾、 斯里兰卡、 越南、 坦桑尼亚和巴布亚新几内亚等国家。A.4 传播途径主要通过蚜虫以非持久性方式传播, 同时能通过机械接种传播。A.5 粒体形态病毒粒体呈弯曲线状, 长约9 0 0n m, 直径约1 4n m。见图A.2。4S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准( 引自B a n e r j e ee t a l .,2 0 1 4)图A.2 C h i VMV病毒粒体A.6 病毒基因组正义单链R NA病毒, 基因组全长约9.7k b。5S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B( 规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S - E L I S A)B.1 试剂B.1.1 包被抗体特异性的辣椒脉斑驳病毒抗体。B.1.2 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的辣椒脉斑驳病毒抗体。B.1.3 底物对硝基苯磷酸二钠(pN P P) 。B.1.4 1 P B S T缓冲液(p H7.4)氯化钠(N a C l) 8.0g磷酸二氢钾(KH2P O4)0.2g磷酸氢二钠(N a2H P O4)1.1 5g氯化钾(K C l)0.2g吐温- 2 00.5m L溶于9 0 0m L灭菌双蒸水中, 并定容至10 0 0m L,4储存。B.1.5 抽提缓冲液(p H7.4)亚硫酸钠(N a2S O3)1.3g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW2 40 0 04 00 0 0)2 0.0g溶于9 0 0m L的1 P B S T中, 并用1 P B S T定容至10 0 0m L,4储存。B.1.6 包被缓冲液(p H9.6)碳酸钠(N a2C O3)1.5 9g碳酸氢钠(N a HC O3)2.9 3g溶于9 0 0m L灭菌双蒸水中, 并定容至10 0 0m L,4储存。B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(p H7.4)牛血清白蛋白(B S A)2.0g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P,MW2 40 0 04 00 0 0)2 0.0g溶于9 0 0m L1 P B S T中, 并用1 P B S T定容至10 0 0m L,4储存。B.1.8 底物缓冲液(p H9.8)二乙醇胺9 7m L氯化镁(M g C l2)0.1g6S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准溶于8 0 0m L灭菌双蒸水中, 用浓盐酸(HC l) 调p H至9.8, 定容至10 0 0m L,4储存。B.2 程序B.2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释, 加入酶联板的孔中,1 0 0L/孔, 加盖,3 7孵育2h或4冰箱孵育过夜, 倒去酶联板孔中溶液,P B S T洗涤4次6次, 每次1m i n。B.2.2 加样加入制备好的检测样品、 阴性对照、 阳性对照和空白对照, 并且至少一个重复,1 0 0L/孔, 加盖,3 7孵育2h或4冰箱孵育过夜, 倒去酶联板孔中溶液,P B S T洗涤4次6次, 每次1m i n。阴性对照为健康的植物组织( 其种类和材料应尽量与检测样品一致) , 阳性对照为感染C h i VMV的植物组织,空白对照为样品抽提缓冲液。B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度, 并加入到酶联板中,1 0 0L/孔, 加盖,3 7孵育2h, 倒去酶联板孔中溶液,P B S T洗涤4次6次, 每次1m i n。B.2.4 加底物将底物pN P P加入到底物缓冲液中使终浓度为1m g/m L( 现配现用) , 按1 0 0L/孔, 加入到酶联板中, 室温避光孵育。B.2.5 读数在不同的时间如3 0 m i n、6 0 m i n或更长时间, 阳性对照孔明显显色后, 酶标仪在4 0 5n m处读O D值。B.3 结果判定在满足阴性对照孔的O D4 0 5值51 0、 同一样品的重复性基本一致( 数值差别2, 判为阳性; 样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值在阈值附近, 判为可疑样品, 需重新做一次, 或用其他方法加以验证; 样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值2, 判为阴性。7S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准附 录 C( 规范性)免疫层析试纸条检测C.1 试剂样品抽提缓冲液配制方法按照B.1.5执行。C.2 试纸条保存试纸条应在28冰箱内密封干燥保存。C.3 检测步骤C.3.1 样品准备待测样品按7.2步骤制备, 取3 0 0L样品液至1.5m L的离心管中。C.3.2 样品检测取出试纸条恢复至室温。将试纸条T线一端垂直插入到样品液中, 样品液高度不要超过试纸条上的MA X线。测试观察的时间以3m i n 6m i n为宜。注:对于病毒浓度低的样品, 测试观察时间可适当延长至1 0m i n。C.4 结果判定质控C线显红色, 测试T线显红色, 检测结果为阳性。质控C线显红色, 测试T线未显色, 检测结果为阴性。C.5 试纸条是否有效的判断方法用阳性对照进行测试, 测试T线显红色, 质控C线显红色, 说明整个系统工作正常。用阳性对照进行测试, 测试T线显红色, 质控C线未显色, 说明羊抗兔失效。用阳性对照进行测试, 测试T线未显色, 质控C线显红色, 说明测试T线的特异性抗体失效。用阳性对照进行测试, 若测试T线未显色, 质控C线也未显色, 说明整个测试纸条失效。8S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准附 录 D( 规范性)R T - P C R检测方法D.1 试剂D.1.1 T r i z o L裂解液D.1.2 5T B E缓冲液T r i s碱 5 4.0g硼酸(H3B O3)2 7.5g0.5m o l/LE D T A(p H 8.0)2 0.0m L补充蒸馏水至10 0 0m L。用时加蒸馏水稀释至0.5T B E。D.1.3 6加样缓冲液0.2 5%溴酚蓝。4 0%(W/V) 蔗糖水溶液。D.1.4 引物序列根据已报道的C h i VMV基因组C P基因保守区域设计1对用于特异性扩增的引物, 目的条带大小为3 3 7b p。正向引物C h i VMV - C P 1:5- A C A C C T T C T T GAT T AT G C T C C - 3反向引物C h i VMV - C P 2:5- AT AAG G C T T C T C AGAAT T G C G - 3D.2 R T - P C R检测D.2.1 总R N A提取取0.1g样品组织置于研钵中, 加入液氮充分研磨至粉末状后迅速移入1.5m L离心管, 再加入1m LT r i z o L试剂( 或取样品提取液1 0 0L置于1.5m L离心管中, 再加入1m LT r i z o L试剂) , 剧烈振荡摇匀3m i n;4下1 20 0 0g离心1 0m i n, 取上清; 加入三氯甲烷3 0 0L, 剧烈振荡1 5s, 室温静置5m i n,4下1 20 0 0g离心1 5m i n, 取上层水相; 加入等体积的异丙醇, 颠倒混匀后室温下静置1 5m i n,4下1 20 0 0g离心1 0m i n, 弃上清; 加入1m L7 5 %的乙醇洗涤沉淀2次, 每次4下75 0 0g离心3m i n, 弃上清;R NA沉淀干燥后, 用2 0L4 0L经D E P C( 焦碳酸二乙酯) 处理过的d d H2O溶解,-8 0保存备用。注:总R NA的提取也可以采用商品化试剂盒。D.2.2 c D N A合成在P C R管中加入3L总R NA,1L随机引物(1 0 0m o l/L) 或1L反向引物C h i VMV - C P 2,d d H2O7L,7 0 水浴1 0 m i n, 迅速冰浴5 m i n, 再加入下列试剂:5R T缓冲液5L、d NT P s(1 0mm o l/L)2L、M - ML VR T(2 0 0U/L)1L、R N a s i n(4 0U/L)1L。4 2水浴6 0m i n,7 0水浴1 0m i n, 自然冷却至室温,-2 0保存备用。注:c D NA合成也可以采用商品化试剂盒。9S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准D.2.3 P C R扩增P C R反应体系见表D.1, 每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照, 以不含病毒的健康植物组织作阴性对照, 同时以水代替模板作为空白对照。P C R反应条件:9 4预变性3m i n,然后9 4变性3 0s、5 3退火4 5s、7 2延伸1m i n,3 5个循环, 最后一个循环结束后7 2继续延伸1 0m i n。预期扩增条带大小为3 3 7b p。表D.1 P C R反应体系c D NA2.0LC h i VMV - C P 1(1 0m o l/L)1.0LC h i VMV - C P 2(1 0m o l/L)1.0L2T a qP C Rm i x1 2.5Ld d H2O8.5L总体积2 5.0L 注:P C R扩增也可以采用商品化试剂盒。D.2.4 琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶, 对P C R产物进行电泳, 电压3 - 5V/c m, 缓冲液0.5 T B E。电泳结束后, 在溴化乙锭(E B, 浓度为0.5g/m L) 溶液染色1 0m i n后, 再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性D NA电泳带, 拍照并做记录。注:染色也可以采用其他染料。D.2.5 结果判断如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、 阳性对照扩增出大小约3 3 7b p的目的条带, 待测样品扩增出与阳性对照一致的目的条带, 则判定为阳性。如果阴性对照和空白对照无特异性扩增、 阳性对照扩增出大小约3 3 7b p的目的条带, 待测样品未扩增出与阳性对照一致的目的条带, 则判定为阴性。01S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准参 考 文 献 1 B a n e r j e eA,D u t t aR,R o yS,e ta l . F i r s tr e p o r to fC h i l l iv e i n a lm o t t l ev i r u si nN a g ac h i l l i(C a p s i c u mc h i n e n s e)i nM e g h a l a y a,I n d i a . V i r u s d i s e a s e,2 0 1 4,2 5(1) :4 2 - 1 4 3.2 D i n g M,Y a n gC,Z h a n gL,e ta l . O c c u r r e n c eo fC h i l l iv e i n a lm o t t l ev i r u si n N i c o t i a n at a b a c u mi nY u n n a n,C h i n a .P l a n tD i s e a s e,2 0 1 1,9 5(3) :3 5 7.3 R a v iKS,J o s e p hJ,N a g a r a j uN,e ta l . C h a r a c t e r i z a t i o no fap e p p e rv e i nb a n d i n gv i r u sf r o mc h i l l i p e p p e r i nI n d i a .P l a n tD i s e a s e,1 9 9 7,8 1(6) :6 7 3 - 6 7 7.4 S i r i w o n gP,K i t t i p a k o r nK,I k e g a m iM.C h a r a c t e r i z a t i o no fC h i l l i v e i n - b a n d i n gm o t t l ev i r u s i -s o l a t e df r o mp e p p e r i nT h a i l a n d .P l a n tP a t h o l o g y,1 9 9 5,4 4(4) :7 1 8 - 7 2 7.5 T s a iWS,H u a n gYC,Z h a n gD Y,e ta l . M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no ft h eC Pg e n ea n d3 UT Ro fC h i l l iv e i n a lm o t t l ev i r u sf r o m S o u t ha n dS o u t h e a s tA s i a . P l a n tP a t h o l o g y,2 0 0 8,5 7(3) :4 0 8 - 4 1 6.6 刘健, 张德咏, 张松柏, 等.湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒的检测及系统发育分析.江苏农业科学,2 0 1 6,4 4(5) :8 4 - 1 8 5.7 王少立, 谭玮萍, 杨园园, 等.山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定.中国农业科学,2 0 1 7,5 0(1 4) :2 7 2 8 - 2 7 3 8.S N/T5 3 8 42 0 2 1以正式出版文本为准12024835T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法S N/T5 3 8 42 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 1网址ww w.c u s t o m s k b .c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 7千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 7 2 定价1 6.0 0元