Toll样受体4在A型流感病毒诱导的小鼠肺部炎症中的作用机制.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1357-1365杂志网址：http:/Toll样受体4在A型流感病毒诱导的小鼠肺部炎症中的作用机制*黄家望1，马心悦1，凡博砚2，刘卓琳1，王康宇2，冯芷莹2，孙贵香2，李玲2（1湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208）摘要 目的：通过研究A型流感病毒（influenza A virus，IAV）诱导的野生型（wild-type，WT）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）敲除型（TLR4del）C57BL/6小鼠肺部炎症差异，探讨TLR4在IAV诱导的肺部炎症中的作用机制。方法：设立WT组和TLR4del组，用IAV滴鼻感染WT小鼠和TLR4del小鼠以构建小鼠肺炎模型，每组各48只。分别在感染0、1、3、5、7和9 d处理动物。常规法检测小鼠体质量，计算肺指数、脾指数和胸腺指数。使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法检测不同时间点各组小鼠肺组织病理变化。ELISA实验检测小鼠支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6和IL-8的含量，探讨不同时间点各组小鼠炎症因子的分泌情况。RT-qPCR、免疫组化和Western blot检测肺组织中TLR4、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）的mRNA和蛋白表达情况，进一步探讨TLR4在IAV感染诱导的小鼠肺炎模型中的作用机理。结果：与WT组小鼠相比，TLR4del组小鼠在感染3 d后的体质量、脾指数和胸腺指数显著上升（P0.05），肺指数显著下降（P0.05）。感染3 d后，与WT组小鼠相比，TLR4del组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8含量显著下降（P0.05）。HE染色结果显示，敲除TLR4能减轻IAV感染的小鼠肺组织病理损伤。RT-qPCR、免疫组化和Western blot结果显示，与WT组相比，感染3 d后，TLR4del组小鼠肺组织MyD88和TRAF6的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P0.05）。结论：IAV感染诱导小鼠肺部炎症的损伤机制可能与TLR4介导的TLR4-MyD88-TRAF6信号通路有关。关键词 A型流感病毒；肺部炎症；Toll样受体4；髓样分化因子88；肿瘤坏死因子受体相关因子6中图分类号 R563.1；R373.1；R363 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.002Role of Toll-like receptor 4 in pulmonary inflammation induced by influenza A virusHUANG Jiawang1，MA Xinyue1，FAN Boyan2，LIU Zhuolin1，WANG Kangyu2，FENG Zhiying2，SUN Guixiang2，LI Ling2（1College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2College of Traditional Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China.E-mail：；）ABSTRACT AIM：To explore the mechanism of Toll-like receptor 4（TLR4）in the pulmonary inflammation induced by influenza A virus（IAV）based on animal experiments of wild-type（WT）and TLR4 deletion type（TLR4del）C57BL/6 mice.METHODS：Two groups of mice，namely WT and TLR4del，were established.The mice in both groups were intranasally infected with IAV to construct pneumonia models，with 48 mice in each group.The animals were treated on days 0，1，3，5，7 and 9 after infection.The body mass，lung index，spleen index and thymus index were measured or 文章编号 1000-4718（2023）08-1357-09 收稿日期 2023-04-03 修回日期 2023-06-03*基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81973670）；湖南省自然科学基金项目（No.2020JJ5418）；湖南中医药大学中西医结合病原生物学湖南省重点实验室开放基金项目（No.2022KFJJ02）；湖南中医药大学研究生创新项目（No.2022CX63）通讯作者 李玲 Tel：[phone]；E-mail：；孙贵香 Tel：[phone]；E-mail：1357calculated by routine methods.The pathological changes of the mouse lung tissues at different time points were observed by hematoxylin-eosin（HE）staining.The levels of tumor necrosis factor-（TNF-），interleukin-1（IL-1），IL-6 and IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid were detected by ELISA，in order to examine the secretion of inflammatory factors at different time points.The mRNA and protein expression levels of TLR4，myeloid differentiation factor 88（MyD88）and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6（TRAF6）in the mouse lung tissues were detected by RT-qPCR，immunohistochemistry and Western blot，in order to further clarify the mechanism of TLR4 in pulmonary inflammation induced by IAV infection.RESULTS：Compared with WT group，the mice in TLR4del group showed significant increases in the body mass，spleen index and thymus index（P0.05），and a significant decrease in the lung index（P0.05）3 d after IAV infection.At the same time，the levels of TNF-，IL-1，IL-6 and IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased in TLR4del group（P0.05）.The HE staining results indicated that TLR4 deletion could effectively attenuate the pathological damage in the lung tissues of IAV-infected mice.The results of RT-qPCR，immunohistochemistry and Western blot showed that，compared with WT group，the mRNA and protein expression levels of MyD88 and TRAF6 in the lung tissues of the mice in TLR4del group were significantly reduced 3 d after infection（P0.05）.CONCLUSION：The injury mechanism of IAV-induced pulmonary inflammation in mice may be related to the TLR4-MyD88-TRAF6 signaling pathway mediated by TLR4.KEY WORDS influenza A virus；pulmonary inflammation；Toll-like receptor 4；myeloid differentiation factor 88；tumor necrosis factor receptor-associated factor 6A型流感病毒（influenza A virus，IAV）属于RNA病毒家族中的正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是全球主要健康问题病原体，在反复流行和大暴发流行期间造成高发病率和死亡率1-2。流感每年都在不断演变，出现新的抗原变异，导致季节性暴发3。西班牙IAV在1918年期间大流行，感染了全球约1/3的人口，造成超过4 000万人死亡4-5。随着现代医学的发展和卫生习惯的改善，流感大流行爆发的概率大大降低。但目前全球范围内，IAV感染仍是一个重要的发病与致死率成因。随着抗病毒药物的广泛应用，病毒耐药性的迅速出现、耐药病毒的易传播性和中枢神经系统副作用的发生，抗病毒药物的广泛使用受到了限制6-9。尽管正在开发疫苗来预防感染，但了解疾病的分子机制以开发针对感染个体的治疗方法也很重要。因此，了解流感感染期间的宿主细胞调节机制有可能为抗流感治疗提供新的宿主细胞识别靶标。流感病毒感染能激活肥大细胞，释放胰蛋白酶、组胺和-干扰素等炎症介质，进而导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的发生10-12。炎症反应的启动取决于对病原体保守分子的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）13。据报道，Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是主要识别流感病毒的PRR14-15。TLR4是其中典型的 PRR，主要表达于单核细胞和巨噬细胞中，可识别介导肺部炎症反应的内源性和外源性朊病毒炎症因子。研究表明，TLR4介导的信号通路活化是感染流感病毒宿主细胞的重要因素之一，当病毒入侵机体引发氧化应激时，可以通过TLR4下游的先天免疫途径发出信号进而可以激活TLR4-肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）-核因子 B（nuclear factor-B，NF-B）信号通路，导致ALI，同时TLR4-髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路在流感病毒的渗透性和组织嗜性中发挥着重要作用16-18。基于这些研究，我们拟通过对野生型（wild-type，WT）小鼠和 TLR4 敲除型（TLR4 deletion type，TLRdel）小鼠构建 IAV 肺炎模型，探讨 TLR4-MyD88-TRAF6信号通路在流感病毒复制中的作用。材料和方法1实验试剂及设备Trizol Reagent（杭州新景生物试剂开发有限公司）；逆转录试剂盒（上海近岸科技有限公司）；RT-qPCR试剂盒（上海近岸科技有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-，TNF-）ELISA试剂盒（E-EL-M3063）、白细胞介素 1（interleukin-1，IL-1）ELISA试剂盒（E-EL-M0037c）、IL-6 ELISA试剂盒（E-EL-M0044c）和 IL-8 ELISA 试剂盒（E-EL-M6008）均为Elabscience产品；GAPDH兔多克隆抗体（10494-1-AP）、TLR4 兔多克隆抗体（19811-1-AP）、MyD88 兔多克隆抗体（23230-1-AP）、TRAF6 兔多克1358隆抗体（14424-1-AP）和 HRP 标记的羊抗兔抗（SA00001-2）均为Proteintech产品。PCR 仪（Biometra）；多功能酶标仪（BioTek）；SDS-PAGE 电泳及转膜设备（Bio-Rad）；微量移液器（Thermo）；微量冷冻离心机、DK-S23电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备公司）。2实验动物从南京大学模型动物研究中心购买68周龄的SPF级 WT和 TLR4del C57BL/6小鼠，雌雄各半，共 88只，体质量 1618 g，适应性饲喂 12 d，饲养于湖南中 医 药 大 学 动 物 实 验 中 心（编 号：SLBH-202205310006），动物质量证书为 SYXK（湘）2013-0005。动物实验方案均通过湖南中医药大学动物伦理委员中心批准（编号：LLBH-202205310006）。3主要方法3.1病毒制备和定量IAV（A/PR/8/34）由湖南师范大学病毒研究实验室惠赠，储存在80 冰柜中备用。经10日龄鸡胚尿囊腔接种、培养、传代，血凝效价1 640以上者供实验用。将灭菌盐水尿囊液中的病 毒 稀 释 至 50 LD50/0.1 mL（MOI=2.0），备 用 于冰中19。3.2实验分组及干预方式实验分为 WT 组和TLR4del组，每组各 48 只。参考课题组前期造模方法19，每只小鼠鼻内感染0.1 mL的50 LD50病毒量，每天观测小鼠活动状况和体重等情况并在感染当天、第1天、第3天、第5天、第7天和第9天分别处理动物，收集小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和肺组织进行检测。3.3对 WT 和 TLR4del C57BL/6 小鼠进行基因型鉴定随机选择WT和TLR4del C57BL/6小鼠，取其尾部组织（0.30.5 cm）切成小块，使用碱裂解法提取组织 DNA。加入 A 溶液（25 mmol/L NaOH 和 2 mmol/L EDTA）100 L，在95 加热23 h，然后加入B溶液（40 mmol/L Tris HCl，pH 7.6）100 L，混合均匀，14 000g离心5 min，取上清液即为提取的DNA。使用1 g总DNA作模板进行PCR，最终反应体积为20 L。反应条件：95 4 min；95 30 s，60 30 s，72 30 s；然后72 10 min至反应结束。扩增后，在1.7%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。3.4ELISA实验检测小鼠BALF中炎症因子表达情况收集小鼠 BALF，根据 ELISA试剂盒说明书，检测小鼠BALF中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8的水平。3.5苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察小鼠肺组织病理变化HE染色在石蜡包埋的小鼠肺切组织片上进行。肺组织切片依次在 100%和95%乙醇中再水化，然后进行二甲苯脱蜡。用蒸馏水冲洗后，用苏木精染色，随后在伊红中复染，然后用95%和100%乙醇连续脱水，封片至盖玻片上并于显微镜下观察。3.6RT-qPCR 检测小鼠肺组织 TLR4、MyD88 和TRAF6的mRNA表达情况使用Trizol提取组织总RNA，分光光度计检测 RNA 浓度，按照逆转录试剂盒将1 g RNA逆转录成cDNA，PCR扩增使用1 L cDNA完成，反应条件同前。3.7免疫组化检测小鼠肺组织中 TLR4、MyD88和TRAF6蛋白表达情况小鼠肺组织用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡切片，脱蜡，抗原修复，分别加入TLR4、MyD88和TRAF6 抗孵育，PBS洗涤3次，滴加相应抗，DAB溶液显色，苏木精复染，脱水，透明，密封，在显微镜下观察肺组织，染色呈棕黄色为阳性，Image-Pro Plus 6.0用于分析图像的信号并计算每个视场的平均吸光度值。3.8 Western blot 法 检 测 小 鼠 肺 组 织 内 TLR4、MyD88和TRAF6蛋白表达情况使用RIPA提取肺组织总蛋白，用 BCA法测定蛋白含量。将 50 g蛋白样本进行SDS-PAGE，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭，抗4 孵育过夜，抗37 孵育2 h后使用ECL显影液在化学发光成像仪上成像。使用ImageJ软件分析图像灰度值。4统计学处理采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。计量资料使用均数标准差（meanSD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量数据使用重复测量方差分析。非正态分布资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两组间比较采用 Mann-Whitney U 检表1RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCRNameTLR4-FTLR4-RMyD88-FMyD88-RTRAF6-FTRAF6-RGAPDH-FGAPDH-RSequence（5-3）GGAACAGACCAACTATCGGCGAGACAACCACTACCATCCGGGAACAGACCAACTATCGGCGAGACAACCACTACCATCCGGCAGTGAAAGATGACAGCGTGATCCCGTAAAGCCATCAAGCAAGCTCGCTGTGAGCTGCTGACTGTACACATGTATTCACGTCTGF：forward；R：reverse.1359验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1WT和TLR4del C57BL/6小鼠的鉴定如图1所示，WT和TLR4del小鼠均表达GAPDH，同时WT小鼠表达靶基因TLR4，但TLR4del小鼠靶基因 TLR4 未表达。鉴定结果表明，购买的 WT 和TLR4del C57BL/6小鼠是可靠的，可以进一步用于后续实验。2WT小鼠和TLR4del小鼠的一般情况如图2所示，WT小鼠和TLR4del小鼠感染IAV后体质量、脾脏指数和胸腺指数呈下降趋势，肺指数呈升高趋势。此外，在第3、5、7天，与WT组同一天相比，TLR4del组小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数显著升高，肺指数显著降低（P0.05或P0.01）。3WT小鼠和TLR4del小鼠BALF中炎症因子含量如图3所示，WT小鼠和TLR4del小鼠在感染IAV后，BALF 中 TNF-、IL-1、IL-6 和 IL-8 等炎症因子含量均呈增加趋势。此外，在第3、5、7天，与WT组同一天相比，TLR4del组小鼠 BALF 中 TNF-、IL-1、IL-6和IL-8含量显著降低（P0.05或P0.01）。Figure 1.The TLR4 gene expression in WT mice and TLR4del mice detected by PCR.图1PCR检测WT小鼠和TLR4del小鼠中TLR4基因的表达Figure 2.General condition of WT mice and TLR4del mice infected with influenza A virus.Comparison of the body weight，spleen index，thymus index and lung index in mice.MeanSD.n=8.*P0.05，*P0.01 vs WT group at the same time.图2WT小鼠和TLR4del小鼠感染IAV后的一般情况13604WT小鼠和TLR4del小鼠肺组织的病理变化如图4所示，WT组和TLR4del组小鼠在感染流感A型病毒后均出现支气管上皮部分脱离，肺泡壁扩张充血，出现淋巴细胞和浆细胞等炎症细胞浸润；随着感染时间的延长，肺泡壁毛细血管扩张、充血和单核细胞浸润逐渐增加。此外，同一天内，TLR4del组的肺损伤程度低于WT组。5WT小鼠和TLR4del小鼠肺组织中TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表达如图5所示，WT组和TLR4del组小鼠在感染IAV后，肺组织中MyD88和TRAF6的mRNA表达呈增加趋势。此外，在第 3、5、7 天，与 WT 组同一天相比，TLR4del组MyD88和TRAF6的mRNA表达水平均显著低于WT组（P0.05或P0.01）。6WT小鼠和TLR4del小鼠肺组织中TLR4、MyD88和TRAF6蛋白表达如图6和图7所示，WT组和TLR4del组小鼠在感染IAV后，肺组织中MyD88和TRAF6的蛋白表达呈增加趋势。此外，在第3、5、7天，与WT组同一天相比，TLR4del组MyD88和TRAF6的蛋白表达水平均显著低于WT组（P0.05或P0.01）。讨论流感仍然是全世界主要的流行病之一，过度促进宿主免疫细胞反应和继发性细菌侵袭性疾病引起肺组织损伤后导致其高死亡率发生20-21。有研究报道，严重的流感与宿主先天免疫反应的激活有关，然而，长时间的激活会导致“细胞因子风暴”，进而促进炎症趋化因子的释放和炎症细胞的趋化性，导致过度的肺部炎症和器官功能障碍，甚至死亡22-23，这与我们之前的研究相一致19，IAV感染后会促进小鼠炎症因子分泌，肺组织出现严重的病理损伤，目前，对流感的研究虽然较多，但临床上病毒耐药性的出现、耐药病毒的易传播性和中枢神经系统副作用的发生，导致流感的治疗受到很大限制。在本研究中，我们通过对TLR4敲除型小鼠和野生型小鼠使用IAV构建小鼠流感病毒肺炎模型，旨在评价经典模式识别受体TLR4在流感病毒感染诱导的肺炎中的作用机制，为该基因在未来临床中流感病毒所诱导肺炎的防治提供实验依据。Figure 3.The levels of TNF-，IL-1，IL-6 and IL-8 in BALF of WT mice and TLR4del mice infected with IAV.MeanSD.n=3.*P0.05，*P0.01 vs WT group at the same time.图3感染IAV后WT小鼠和TLR4del小鼠BALF中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8含量1361研究表明，流感能诱导细胞因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、CCL2、IP-10 等的产生24。IL-6 是严重禽流感病毒H7N9感染的炎症标志物之一25。因此，炎症因子的表达可作为确定流感严重程度和药物治疗效果的重要指标。分别对TLR4del型小鼠和WT型小鼠进行 IAV感染造模后，TLR4del组小鼠肺泡灌洗液Figure 5.Relative mRNA expression of TLR4，MyD88 and TRAF6 in lung tissues of WT mice and TLR4del mice infected with IAV.MeanSD.n=4.*P0.05，*P0.01 vs WT group at the same time.图5感染IAV后WT小鼠和TLR4del小鼠肺组织中TLR4、MyD88和TRAF6的mRNA表达Figure 4.HE staining to observe lung tissue morphology in WT mice and TLR4del mice infected with IAV（scale bar=50 m）.At 0 d，normal lung tissue structure of the mice was observed in both groups before infection.At 1 d of infection，only a small amount of pathological damage appeared in the lung tissues of the mice in WT group and TLR4del group.At 3 d of infection，the lung tissues of the mice in WT group and TLR4del group showed partial detachment of bronchial epithelium，and the alveolar wall dilated and congested，which was more serious than that at 1 d of infection，but the difference between the 2 groups was not obvious.At 5 d of infection，the dilation，hyperemia and inflammatory infiltration of the alveolar wall of mouse lung tissues in WT group and TLR4del group were more obvious，which was more severe than that at 1 and 3 d of infection，and the damage in WT group was more serious than that in TLR4del group.At 7 d of infection，the dilation，hyperemia and inflammatory infiltration of the alveolar wall of the mouse lung tissues in WT group and TLR4del group were slower than those at 5 d.At 9 d of infection，the dilation，hyperemia，congestion and inflammatory infiltration of the mouse lung tissues in WT group and TLR4del group were more relieved than those at 7 d.图4HE染色观察感染IAV后WT小鼠和TLR4del小鼠的肺组织形态1362中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8等炎症因子分泌较同一天WT组小鼠分泌显著减少，且同一天WT组小鼠肺组织病理损伤较TLR4del组小鼠损伤更为严重。流感病毒的发病机制极其复杂，可能通过多种方式引起急性肺损伤，最近的研究发现，TLR4基因广泛参与病毒性传染病的发展和病毒的逃逸26-28。Jeisy-Scott等29报道机体能够通过TLR4-MyD88的途径识别流感病毒的基因组RNA，并产生大量的炎症因子。研究结果显示，流感病毒也可引起 TLR4 基因敲除的C57小鼠肺部炎症，但与WT型C57小鼠相比，在感染时间肺部炎症明显缓解，同时与WT型小鼠相比，TLR4 的敲除可以降低病毒感染小鼠肺组织中MyD88和TRAF6的mRNA和蛋白表达水平，表明当流感病毒感染时，可以诱导TLR4介导的信号通路激活，然后将信号转导到细胞中，其过程可能为病毒感染进入机体后，诱导TLR4激活，TLR4的细胞内TIR结构与MyD88的羧基末端结合，启动MyD88依赖性信号通路，激活TRAF6进而引起TNF-、IL-1、IL-6等促炎因子介导机体抗病毒免疫应答，这些炎症细胞因子在达到一定浓度时会引起肺损伤。综上所述，敲除TLR4的表达在一定程度上有利于缓解流感病毒诱导的小鼠肺部炎症反应，表明TLR4介导的信号通路在流感病毒感染引起的小鼠肺部炎症中发挥着重要作用，其作用机制可能与通Figure 6.Immunohistochemical detection of protein expression of TLR4，MyD88 and TRAF6 in lung tissues of WT mice and TLR4del mice infected with IAV（scale bar=50 m）.MeanSD.n=3.*P0.01 vs WT group at the same time.图6免疫组化检测感染IAV后WT小鼠和TLR4del小鼠肺组织中TLR4、MyD88和TRAF6的蛋白表达1363过抑制 TLR4-MyD88-TRAF6信号通路，从而抑制相关炎症因子分泌有关。参考文献1Gaitonde DY，Moore FC，Morgan MK.Influenza：diagnosis and treatmentJ.Am Fam Physician，2019，100（12）：751-758.2Opatowski L，Baguelin M，Eggo RM.Influenza interaction with cocirculating pathogens and its impact on surveillance，pathogenesis，and epidemic profile：a key role for mathematical modelling J.PLoS Pathog，2018，14（2）：e1006770.3马心悦，朱梦晨，卢芳国，等.流感病毒诱导的小鼠肺上皮细胞损伤及外泌体 miRNA 差异表达谱研究 J.中国病理生理杂志，2022，38（1）：40-49.Ma XY，Zhu MC，Lu FG，et al.Influenza virus-induced lung epithelial cell injury and differential expression profile of miRNAs in exosomesJ.Chin J Pathophysiol，2022，38（1）：40-49.4Shirey KA，Lai W，Patel MC，et al.Novel strategies for targeting innate immune responses to influenza J.Mucosal Immunol，2016，9（5）：1173-1182.5Loo YM，Gale M Jr.Influenza：fatal immunity and the 1918 virus J.Nature，2007，445（7125）：267-268.6Thanh TT，van Doorn HR，de Jong MD.Human H5N1 influenza：current insight into pathogenesisJ.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（12）：2671-2674.7Wang D，Zhu W，Yang L，et al.The epidemiology，virology，and pathogenicity of human infections with avian influenza 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