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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,生物制药工艺学,1/148,发酵工程制药,第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理,第二节：利用微生物进行药品生产实例,2/148,第一节：微生物工程（发酵工程制药）生产原理,人工培养微生物，经过体内特定酶系，经过复杂生物化学反应过程和代谢作用，最终合成人们所需要药品如抗生素、氨基酸、有机物、维生素。这种方法称为微生物细胞工程。,3/148,一：最惯用工业微生物,二：微生物培养技术,三：细胞浓度测量,四：微生物发酵工艺学原理,五：工业微生物菌种制备和改良,六：发酵生产过程,七：灭菌技术,八：分离纯化技术,九：干燥技术,讲解分章节内容,4/148,一：最惯用工业微生物,1：细菌,2：放线菌,3：霉菌,4：酵母,青霉菌,5/148,1：细菌,（1）醋杆菌属-醋化醋杆菌（,Acetobacter aceti,）能够将酒精转变为醋酸。弱氧化醋杆菌（,Acetobacter suboxydans,）能够将山梨糖醇转变为山梨糖。,（2）乳杆菌属-德氏乳杆菌（,Lactobacillus delbriiekii,）能够将糖转变为乳糖。,（3）链球菌属（,Streptococcus,）-用来生产乳酸。,（4）片球菌属（,Pediococcus,）-用来生产乳酸。,（5）串珠菌属（,Leuconostoc,）-用来生产乳酸。,（6）芽孢杆菌属-枯草杆菌（Bacillus subtilis）能够用来生产,-淀粉酶、肌苷、鸟苷等核苷。,（7）梭菌属-丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylium）用来生产丙酮、丁醇。,（8）大肠杆菌（Escherichia coli）用来作为基因工程克隆菌。,6/148,2：放线菌,有以下分类,红霉素链霉菌（S.enytnreus）,能产生红霉素。,卡那霉素链霉菌（S.kanamycetieus）,能产生卡那霉素,金霉素链霉菌（S.aureofaciens）,能产生金霉素。,委内瑞拉链霉菌（S.veneznelae）,能产生氯霉素,7/148,3：霉菌,（1）曲霉属-米曲霉（Aspergillus oryzae）能产生高峰淀粉酶。,（2）黑霉属（A.niger）-能产生酸性蛋白酶、蛋白酶。,（3）青霉属-点青霉（Penicillium.notatum）、产黄青霉（P.chrysogenum）能产生青霉素。橘青霉（P.citrinum）可产生核酸酶P1。,8/148,4：酵母,酵母属-最惯用是酿酒酵母，用于进行酒精发酵。,9/148,二：微生物培养技术,（一）培养基组成,（二）培养基分类,（三）培养方法,（四）培养条件,10/148,（一）培养基组成,1、碳源,普通为蔗糖、葡萄糖。,工业用碳源为淀粉水解液、,糖蜜、干薯粉、甲醇、乙醇、,石油、醋酸等等材料。,2、氮源,主要有硫酸铵、,尿素、豆饼水解液。,3、无机盐,磷酸二氢钾、,磷酸氢二钾,七水硫酸镁。,4、微量生长因子,生物素,硫铵素,玉米浆最惯用,11/148,（二）培养基分类,1、细菌用培养基,以肉汤+蛋白胨+酵母膏作为其组成物质。,2、酵母、霉菌用培养基-以曲汁和麦芽汁为最惯用,将米曲（或者麦芽汁）添加适量水，在55,下糖化2小时，,经过过滤，滤液稀释至糖度10度，备用。,3、培养霉菌则专用蔡氏霉菌培养剂,蔗糖20-30g、硝酸钠3g、磷酸二氢钾1g、氯化钾0.5g、,七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L。,4、工业用培养基-定量组成培养基配方,12/148,（三）培养方法,按培养基类型分为-固体培养法、液体培养法。,按操作方式分为-分批培养、半连续培养、连续培养。,按氧气供给分为-需氧培养、厌氧培养。,下面分别介绍其中主要5种方法：,13/148,1、浅盘培养,该方法选取于固体培养法、也适合用于液体培养法。,其方法是将固体或者液体培养基盛于不锈钢制浅盘内，接种菌种，在保温室内培养。,14/148,2、厚层通风培养,此方法用于固体培养。,这种方法优点是培养量大，而且节约劳动力。国内酱油厂多采取此法。,所用设备是在水面建造大型水泥槽,水泥槽底部铺上多孔板,板上放置固体培养基,接种之后,将空气由多孔板下部通入培养基内,15/148,3、液体通风深层培养,简称深层培养法，是最先进方法。,在我国，抗生素、柠檬酸生产经常采取此法。,16/148,4、厌氧培养,（1）简单方法是，用普通发酵槽，撤去通风设备。（2）真正方法是必须把氧气抽除，采取真空泵来抽去氧气。,较为先进方法是,加拿大BBL Gas Pak 150厌氧培养器,采取由水发生氢气方法,此氢气与氧气反应，遂形成真空。,17/148,5、大规模发酵生产,普通采取几千升、几万升培养罐。采取逐步扩大法生产,将酵母进行,斜面培养,移至500L种子罐,作为工业发酵种醪,移至含5ml曲汁试管之中,30培养24小时。,移至10L曲汁卡瓦罐中,30培养48小时。,移至500ml巴士瓶中,30培养48小时,最终进行,大规模培养,18/148,（四）培养条件,1、培养基浓度,2、温度,3、PH值,4、氧气,5、氮源,6、微量因子,19/148,1、培养基浓度,普通为含葡萄糖10%,最高能够经过流加法到达15%。,20/148,2、温度,普通为30-33,超出,33,时应该进行冷却。,21/148,3、PH值,（1）酵母菌为PH=4.0-6.0,（2）细菌PH=6.0-7.5,（3）霉菌生产PH值则在4.0-9.0之间。,22/148,4、氧气,微生物类别有需氧菌、厌氧菌、兼性菌三种。,各自需要不一样氧气条件。,测定培养剂溶解氧是一个技术关键。,23/148,5、氮源,普通情况下，是以使用尿素为最适合，因为一则尿素能够维持发酵液PH值不变，同时又能够供给氮源需要。,使用硫酸铵时，,因为其残留硫酸根使得发酵液PH值变小,必须用碱性物质中和,24/148,6、微量因子,主要是指维生素，它是微生物生长所不可缺乏营养成份所需。,很多天然碳源与氮源之中,普通均含有众多维生素物质,配制培养基时普通不需另外添加,25/148,三：细胞浓度测量,（一）直接测定法,（二）间接测量法,26/148,（一）直接测定法,特点是直观准确,4,浊度法,3,平板计数法,2,显微计数法,1,细胞干重法,27/148,1、细胞干重法,将一定体积培养液离心，搜集细胞，洗涤、干燥、进行称重。,不足之处是此方法不适合用于统计含有不溶性沉淀物培养液。,28/148,2、显微计数法,利用显微镜和血球计数器、测定单位体积内培养液中细胞个数。,缺点是：（1）不适合用于丝状生物体计数。（2）不能区分活细胞和死细胞。（3）因为细菌太小，不适于进行计数。,29/148,3、平板计数法,将样品用无菌生理盐水进行逐一数量级稀释然后取一定量稀释液涂于琼脂平板培养基上，经过一段时间培养，从平板上长出菌落数量，能够计算出原培养液中微生物浓度。,其优点是,可用于测定活细胞浓度,30/148,4、浊度法,因为培养液浊度和光密度与培养液中细胞浓度成正比关系，所以，能够经过分光光度计法用600-700nm波长进行测定。,其优点是快速、准确。,31/148,（二）间接测量法,1、测定细胞成份-能够经过测定培养液中蛋白质、DNA、RNA含量来确定细胞浓度。,2、培养液中细胞虚体积测定-将一定体积培养液在一定速度下离心，因为不溶性成份密度较大，经过离心后，普通均沉入底部，而活细胞则展现出半悬浮状态，所以，沉降物总量-沉淀物数量=细胞估算量。,3、粘度-培养液粘度与所含细胞数量相关。,4、利用培养过程中产生热量多少来测定细胞数量。,5、利用发酵过程中营养物质消耗量来测定细胞浓度。,6、利用最终产物合成数量，来测定培养液中细胞数量。,7、利用荧光素测定细胞中ATP数量，测定活细胞浓度。,32/148,四：微生物发酵工艺学原理,（一）分批培养,（二）连续培养,（三）其它培养方法,33/148,（一）分批培养,3点,1、分批培养定义,2、分批培养生长过程,3、分批培养过程中影响细胞生长原因,34/148,1、分批培养定义,分批培养是一个间歇式培养方法，在每一批次培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序处理。,为了提升生物反应器在分批培养中效率,通常采取多级分批培养方法。,即在小型生物反应器中接入少许种子,经过分批培养，来取得较大数量细胞作为种子,再转入到大型生物反应器中,分批培养设备要求较少,操作也较简单,工业微生物生产中经常采取,35/148,2、分批培养生长过程,培养中细胞经过4个生长阶段：,（1）延迟期,（2）指数生长久,（3）静止期,（4）衰亡期,36/148,1、延迟期,（1）种龄越长，延迟期越长，（2）接种量越少、延迟期越长,4、衰亡期,营养物质消耗贻尽,培养液中有害物质积累太多,造成培养液中细胞开始死亡，,称为衰亡期。,3、静止期,伴随营养物质被逐步消耗、,细胞生长速率开始下降，,最终细胞浓度不再增加，,称为静止期。,2、指数生长久,细胞倍增时间,指细胞浓度增加一倍所需要时间。,微生物倍增时间普通为0.51小时。,37/148,3、分批培养中影响细胞生长原因,共有以下5种影响原因：,（1）营养物质浓度,（2）温度,（3）PH值,（4）溶解氧浓度,（5）产物,38/148,（1）营养物质浓度,营养物质限制性浓度,-当某一个营养物质浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌生长，此时浓度就称为营养物质限制性浓度。,营养物质最大浓度,-当某一个营养物质浓度超出一定程度之后，也会对细菌生长产生抑制作用。,39/148,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞生长速率较低，,伴随温度升高，细菌生长速率也随之加紧，,当温度超出一定范围时，因为蛋白质等细胞结构变性，造成细菌生长速率急速下降。,微生物细胞最适生长温度并不等于其代谢产物最正确生产温度。,所以在详细生产过程中，,培养前期经常将温度调控在有利于细胞生长区域，,而在后期则经常将温度转到最正确生产温度，,以取得较多产物,40/148,依据培养温度要求不一样，能够将微生物分成-低温菌，中温菌，高温菌。,采取高温菌生产有许多优点：（1）高温菌所生产出酶，其热稳定性很好。（2）高温菌培养温度较高，细胞生长速率较大。（3）不轻易发生杂菌污染。（4）在大规模生产时能够节约冷却水、同时能够降低动力消耗。,发酵温度调控技术,41/148,（3）PH值,细菌适宜于在中性、弱碱性条件下生长。,酵母菌、霉菌则喜酸性环境。,乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好耐受性。,42/148,（4）溶解氧浓度,不一样培养过程对于溶解氧有着不一样要求,应该依据详细情况来加以控制。,空气过滤片,43/148,（5）代谢产物抑制作用,细胞代谢产物会影响到细胞生长，这种现象称作产物抑制作用。,而代谢产物多数就是生物制物原材料。,所以，在实际生产过程中要设法定时搜集细胞代谢产物,44/148,（二）连续培养,1、连续培养方法优缺点,2、连续培养法分类,45/148,细菌连续培养设备简化示图,46/148,1、连续培养方法优点,（1）细胞生长速率较高。,（2）连续培养可发使得培养液到达一个稳定状态,2、连续培养方法缺点,（1）连续培养延续时间长，发生杂菌污染概率也就增加,（2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、,（3）细菌株生产性能退化现象也就比较突出,47/148,3、连续培养法分类,能够分为以下3类：,（1）单级连续培养,（2）细胞回流式单级连续培养,（3）多级连续培养,48/148,（1）单级连续培养,新鲜培养基加入速率=培养之后物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。,在单级连续培养方法之中，发酵液体积保持恒定，生物反应器中各组分分布均匀。,单级连续培养是一个最简单连续培养方法。,49/148,（2）细胞回流式单级连续培养,将单级连续培养流出液中细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式单级连续培养。,细胞回流式单级连续培养相当于不停地对生物反应器进行接种，有利于提升连续培养效率。,50/148,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个反应器流出液作为第二个反应器流入液，第二个反应器流出液又作为第三个反应器流入液，这种培养方式就称为多级连续培养法。,51/148,（三）其它培养方法,共有5种方法：,1、补料分批培养,2、透析培养,3、萃取培养,4、闪蒸培养,5、离子交换培养,下面着重介绍1、2 二种方法,52/148,1、补料分批培养,补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间一个操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液方法。,（1）方法改良,（2）补料分批培养优点,（3）补料分批培养缺点,因为补料，使得培养液体积逐步扩大，,到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出,53/148,（1）方法改良,连续补料分批培养法-在进行补料分批培养时，假如所取出培养液数量少于补进物料数量，重复进行屡次放料和补料操作，这种方法称为连续补料分批培养。,54/148,（2）补料分批培养优点,（1）经过流加高浓度营养物质，,培养罐内细胞浓度能够到达非常高程度,这对于细胞产物生产十分有利,（3）经过补料，能够解除一些营养物低浓度限制效应,提升产物合成效率。,（2）经过补料和放料连续进行，,能够解除一些基质、产物对细胞抑制作用,55/148,（3）补料分批培养缺点,（1）要考虑到生物反应器供氧能力,（2）要考虑培养过程中大量代谢产物积累后细胞毒性,56/148,2、透析培养,在培养过程中，伴随细胞生长，在培养液中会积累起各种代谢产物，这些物质经常会抑制细胞生长。此时，采取透析膜把一些代谢产物排出反应器之外，这种方法称为-透析培养。,（1）方法改良,（2）透析培养优缺点,57/148,（1）方法改良,假如采取微孔过滤膜把一些代谢产物排出反应器之外，这种方法称为过滤培养。,58/148,（2）透析培养优缺点,透析培养优点-对于消除产物抑制效应十分有效。,透析培养缺点和问题-经常碰到困难是膜易被堵塞。,59/148,五：工业微生物菌种制备和改良,1：菌种及其起源,2：抗生素菌种改良技术,60/148,1：菌种及其起源,菌种，是进行工业发酵、生产产品主要条件。优良菌种能够提升发酵产品产量、提升发酵液利用效率、缩短生产周期。,自然界是生产菌种主要起源，不过，直接从自然界分离得到菌种往往不能马上用于生产,当前，生产上所需要菌种经常是从保留菌种中筛选所取得。,61/148,2：抗生素菌种改良技术,详细有3种方法-,（1）人工诱变法,（2）原生质体融正当,（3）体外DNA重组法,62/148,（1）人工诱变法,抗生素产生菌用紫外线、,射线、X射线、快中子等物理方法，或者用亚硝酸、秋水仙素、氮芥子气、硝基胍等化学诱变剂处理，来提升抗生素产量。,63/148,（2）原生质体融正当,Pesti于1979年提出用原生质体融正当来提升青霉素产量。,我国四川抗生素研究所于1983年经过原生质体融正当生产麦迪霉素，产量提升40%。,64/148,（3）体外DNA重组法,采取体外DNA重组技术来改良抗生素生产菌。,英国D.Flopwood首次在链霉菌之间进行了基因转移。产生出世界首创杂合抗生素-麦迪紫红素。,65/148,六：发酵生产过程,生产用菌种-,原始材料-,培养基-,程序-,生产细则-,以青霉素为例讲解,66/148,（1）青霉素（penicillin）,所用菌种-黄青霉菌,原始材料-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。,发酵方法-加前体物质深层发酵法。,青霉素发觉者弗莱明,67/148,沙土管菌种,转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养5-6天，取得芽孢,芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养,进入移种瓶培养,进种子罐，接种量为5%-10%,进繁殖罐，28培养48-96小时,进入发酵罐，开始生产。,鼓式过滤,第一次萃取器,纯化柱,第二次萃取器,第三次萃取器,真空结晶釜,瓷过滤器,结晶洗涤釜,真空干燥器（结束）,程序,68/148,（1）使用消沫剂，因为发酵过程中产生大量CO2，会产生大量泡沫。可采取植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。,（2）温度控制在24-30、PH值控制在6.8-7.2。,（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。,（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入空气必须是无菌。,（5）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净空气流入。,（6）当前国际上青霉素发酵水平已经到达8万多单位/ml，相当于50g/L。,生产细则,69/148,七：灭菌技术,灭菌操作是为了确保杂菌不进入工业发酵系统。,（一）灭菌项目,（二）灭菌方法,（三）灭菌矛盾之处,（四）详细灭菌技术,70/148,（一）灭菌项目,1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。,2、对通入培养基、通入空气进行先行灭菌。,71/148,（二）灭菌方法,2、化学法,1、加热法,3、辐射法,4、过滤法,72/148,（三）灭菌矛盾之处,对杀灭细菌同时,1、培养基中营养成份也随之遭到分解和破坏。,2、杀死杂菌同时也杀死了工程细菌。,73/148,（四）详细灭菌技术,可分为6种技术：,1、间歇灭菌法,2、加热灭菌法,3、连续灭菌法,4、空气加热灭菌法,5、空气过滤灭菌法,6、营养物质瞬时高温杀菌法,74/148,1：间歇灭菌法,又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到要求灭菌温度。,（1）灭菌方法,（2）注意事项,（3）间歇灭菌法优点,75/148,（1）灭菌方法,间歇灭菌操作过程分为3个过程：,加热-保温维持-冷却。,这些不一样阶段，均能够起到灭菌作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌作用是主要，冷却杀菌作用最小。,76/148,（2）注意事项,应该防止过长加热时间，不然经常会破坏培养基中营养物质。,系统经过灭菌操作之后，必须到达不留1个杂菌，不然，只要经过1昼夜增殖，1个杂菌就会增加到2,72,个杂菌，最终会造成整批发酵液失败。,77/148,（3）间歇灭菌法优点,设备造价低廉。,便于进行手动操作。,78/148,2：加热灭菌法,隧道灭菌箱设备,79/148,3：连续灭菌法,（1）定义,（2）技术分类,（3）连续灭菌法优点,（4）连续灭菌法不足,80/148,（1）定义,连续灭菌法是指灭菌操作加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。,所以，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。,81/148,（2）技术分类,连续灭菌法能够分为2种：,（1）加热、冷却迟缓交替进行方法。,（2）快速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于确保营养物质极为有利。,82/148,（3）连续灭菌法优点,（1）可降低培养剂中营养物质损失、提升产物收率。,（2）因为操作条件恒定，能够取得稳定灭菌质量。,（3）轻易实现自控操作。,（4）能够防止系统重复加热和冷却，可提升热利用率。是当前很多制药厂经常采取方法。,83/148,（4）连续灭菌法不足,（1）投资较大，,（2）需要同时设置加热、冷却装置。,84/148,4：空气加热灭菌法,利用空气压缩时产生高温，使得微生物体内蛋白质变性，而到达杀菌目标，这种方法称为空气加热灭菌法。,不一样温度下空气细菌存活时间：200,/15,.1s，250,/5,.1s，300,/2,.1s，350,/1,.05s。,干热杀菌流程通常是：先采取废热，将空气预热到60-70,，然后进入压缩机压缩，并在200以上温度维持一段时间。方便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。,85/148,5：空气过滤灭菌法,是指让空气经过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，取得无菌空气目标。空气过滤分为2种：,（1）绝对过滤,（2）深层过滤,陶瓷过滤机,86/148,（1）绝对过滤,如超滤膜过滤就属于绝对过滤,是指所用滤膜孔径小于空气中固体颗粒。从而把颗粒截留。,87/148,（2）深层过滤,是凭借滤层内波折通道，而将颗粒截留方法。它不要求滤膜孔径小于空气中固体颗粒。这是当前发酵工业惯用过滤除菌方法。,深层过滤所用过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本发酵工业中广泛应用）。,88/148,6：营养物质瞬时高温杀菌法,普通来说，当温度升高时，微生物死亡速率增加,营养物质遭到破坏速率。,所以，对于瞬时高温，细菌经常被杀死，而营养物质则破坏得不多。,依据这一原理，能够采取营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。,89/148,八：分离纯化技术,微生物发酵产物是一个混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化基质和底物、残余原料、大量水、微生物细胞、各种杂质。所以，必须对发酵产物进行分离和纯化。,分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：,（一）固体物质去除，（二）初步分离，（三）产品提纯，（四）产品最终分离。,90/148,（一）固体物质去除,1、目标,2、惯用方法有,3、惯用设备4、固体物质前期预处理技术,91/148,1、目标,（1）分离出完整细胞。,（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内生物产品。,（3）除去细胞有残留碎片。,（4）除去没有转化不溶性基质。,（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。,92/148,2、惯用方法,（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜表面进行流动，这么能够不停地移去在滤膜表面积累细胞物质，从而取得近似于恒定过滤速率。,（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。,（3）沉降法-与普通自由沉降不一样，工业生产过程沉降都属于干扰式沉降。,93/148,3、惯用设备,（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机,（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。,（3）沉降设备-管式离心沉降机。,94/148,不锈钢板框压滤机,95/148,澄清型管式分离机,SSC600-NG三足式沉降离心机,96/148,19XKZ全自动压滤机,97/148,4、固体物质前期预处理技术,因为生物反应液粘度很大，直接分离往往比较困难，所以，经常对其进行预先前期处理，来提升分离效果。,常见预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。,98/148,（二）初步分离,深入把已经分离溶液浓缩，提升目标产物浓度方法，称为初步分离。,初步分离详细方法能够分为：,1、蒸发,2、萃取,3、沉淀,4、膜分离,99/148,1、蒸发,蒸发是经过加热，使溶液中水经过汽化除去要提升溶质浓度、为溶质析出创造条件一个操作方法。,各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都能够进行蒸发操作。,因为生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼防止局部液体过热。,100/148,LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图,蒸发设备（1）连续流动膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。,101/148,2、萃取,萃取是经过物质在2种溶液之间不一样溶解度，来实现分离操作方法。,萃取分类,（1）有机溶剂萃取,（2）双水相萃取,102/148,（1）有机溶剂萃取,许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、所以，经过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。,因为抗生素在有机溶剂之中极不稳定，所以，在确保萃取效率前提条件下，必须尽可能缩短操作时间。,有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。,103/148,SFT-150超临界萃取反应仪,利用萃取法来提取抗生素，含有质量好、收率高、速度快优点。,双水相萃取法，当前用于进行酶、和蛋白质提取工艺。,104/148,（2）双水相萃取,使用2种互不相溶高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目标产物在双水相中不一样分配系数而实现分离方法，称为双水相萃取。,萃取之后目标产物能够经过超滤法进行提纯。,双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。,105/148,3、沉淀,蛋白质在溶液中含有“等电点”特征，而且其等电点与溶液PH值相关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。,蛋白质在PI时溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是因为同性电荷相斥缘故，当PH=pI时，因为蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀,。,106/148,NSG-630浓缩分离机,ZHN系列真空浓缩罐,107/148,沉淀和盐折结合,因为沉淀经常造成蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能防止蛋白质变性，这种方法就称为-盐析法。,在不一样盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不一样。按以下次序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐,-3,、酒石酸盐,-2,、SO4,-2,、F,-,、IO3,-,、H2PO4,-,、醋酸盐,-,、B2O3,-,、Cl,-,、ClO3,-,、Br,-,、NO3,-,、ClO4,-,、CNS,-,。（2）阳离子-Th,+4,、Al,+3,、H,+,、Ba,+2,、Sr,+2,、Ca,+2,、Mg,+2,、Rb,+,、NH4,+,、K,+,、Na,+,、Li,+,。,从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强盐类，不过因为它在水中溶解度极大，对盐析十分有利，所以硫酸铵是当前最惯用盐析剂。,108/148,4、膜分离,膜分离技术是基于一个半透性薄膜，它能够使得溶液中一些组分经过，而阻止和截留其它组分分离方法。,膜分离优点（1）因为膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特征来进行分离，它无须象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也无须象蒸发那样进行加热。所以，产物生物学特征能够得到完好保留，（2）产物损失量极少，有利于提升得率。,膜分离分类,（1）反渗透法,（2）超滤法,109/148,（1）反渗透法,依据物理化学原理，当含有溶质A溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开时候，因为系统渗透压作用，渗透液C 便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透压力就自然称为渗透压（,）,假如在溶液B一方施加压力（,P），发觉渗透液C进入溶液B速率就会减小。当压力（,P）=渗透压（,）时，渗透现象就会停顿。,当压力（,P）,渗透压（,）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。,依据溶液所含有反渗透特征，能够实现溶液浓缩。,110/148,（2）超滤法,是指在反渗透基础之上，将隔离膜由原来半透膜，改成带有较大孔径薄膜。这么一来，在反渗透操作过程中，不不过溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子杂质也连带一起进入到渗透液之中。,与反渗透法相比，超滤法显著含有其优点-反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩同时，还含有纯化作用。,111/148,反渗透法+超滤法实际应用,（1）主要用于蛋白质溶液浓缩、脱盐等步骤，（2）在疫苗、血浆等生产中也常被使用。膜分离装置分类（1）中空纤维束，（2）板-框膜分离装置，（3）螺旋状膜分离装置,反渗透装置,112/148,（三）产品提纯,层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊载体物质，称为固定相。含有待分离产物溶液则称为流动相。当流动相流过固定相时候，因为流动相中不一样物质与固定相之间产生了不一样强度结协力，所以各种物质在层析柱内停留时间也各不相同，结果，它们将依次序先后流出层析柱。,层析法分类,1、吸附层析法2、离子交换层析法3、凝胶层析法（分子筛）4、亲层析法,113/148,1、吸附层析法,吸附层析法是利用各种物质与固定相之间因为吸附力差异、而产生不一样结协力原理，所进行层析操作。,固定相对溶质产生结协力，这种结协力是以离子键、氢键、范德华力所产生。,而流动相洗脱作用又对溶质和固定相之间产生脱离作用。,这么，吸附脱离再吸附再脱离，造成溶质沿着洗脱液方向移动。,其移动速率取决于固定相对溶质吸附能力，吸附力弱，移动就快，吸附力强，移动就慢。,114/148,2、离子交换层析法,（1）基本原理,（2）离子交换过程,（3）惯用离子交换树脂,（4）离子交换层析法应用,115/148,（1）基本原理,采取离子交换树脂作为固定相，离子交换树脂本身含有正离子基团和负离子基团，,酸性电离基团能够交换阳离子，称为阳离子交换树脂。碱性电离基团能够交换阴离子，称为阴离子交换树脂。,离子交换树脂同时具备极性基团和非极性基团。极性基团不停地与溶液中离子进行交换，而非极性基团则组成树脂分子骨架，起支撑作用。,116/148,（2）离子交换过程,是一个同时包含吸附+吸收+穿透+扩散+离子交换+离子亲和，等等物理化学过程综合作用结果。,溶液中溶质离子扩散到树脂表面,溶质离子,穿透树脂表面,扩散到树脂颗粒内部,溶质离子与树脂离子发生交换,树脂离子穿透树脂表面,树脂离子,扩散到溶液之中,117/148,（3）惯用离子交换树脂,（1）羧甲基纤维素阳离子交换树脂（CM-纤维素）-当阳离子蛋白质流经交换树脂时，因为静电吸引作用，蛋白质将与树脂结合，然后用缓冲液进行冲洗交换柱，结协力最弱蛋白质首先被洗脱下来。不一样缓冲液将各处洗脱“捡到”其中某一蛋白质组分。,（2）二乙氨乙基纤维素阴离子交换树脂（DEAE-纤维素）-原理与CM-纤维素交换原理相同。,118/148,（4）离子交换层析法应用,离子交换层析法含有收率高、质量好、周期短、成本低、设备简单、适合工业化生产等优点。,当前已经普遍应用于生物化学制药行业。,离子交换柱,119/148,3、凝胶层析法,（1）基本原理,（2）惯用凝胶层析材料,（3）凝胶层析应用价值,120/148,（1）基本原理,凝胶层析也称为凝胶过滤、分子筛层析、排阴层析、凝胶渗透层析等等。,凝胶是一个含有多孔、网状结构分子筛。每一个颗粒就相当于一个筛子。,当样品经过凝胶层析柱时，分子量较大物质因为直径大于凝胶网孔，它们沿着凝胶颗料间隙流动，所以速度较快而首先流出层析柱。相反，分子量较小物质能够自由地进出凝胶网孔，它们不停地在凝胶颗粒之中往返流动，从而造成进出速度下降。,121/148,（2）惯用凝胶层析材料,（1）葡聚糖凝胶，,（2）聚丙烯酰胺凝胶。,AM90-1 型凝胶层析仪,122/148,（3）凝胶层析应用价值,（1）可用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物质。能彻底分离分子量相差只有25%二种蛋白质。,（2）凝胶层析含有设备简单、分离快速、不影响产物分子生物学特征等优点。,123/148,4、亲和层析法,是利用生物分子之间所含有专一亲和力而设计出一个层析方法。,（1）亲和层析原理,（2）亲和层析例子,124/148,（1）亲和层析原理,（1）载体活化-将载体在碱性条件下用溴化氢（CNBr）进行活化。（2）经过偶联反应制成亲吸附剂-将某一个能够与生物分子进行可逆性结合物质（称作配基）经过偶联反应联结到载体上，（3）含有生物分子样品经过层析柱。（4）生物分子与配基结合而被吸附，（5）未能进行特异性结合其它杂蛋白，经过洗涤而流出层析柱。,125/148,（2）亲和层析例子,层析目标-分离DNA解聚酶,层析方法-以珠状琼脂糖、或者聚丙烯酰胺作为载体，以DNA解聚酶抑制物作为配基,层析结果-（1）DNA解聚酶被特异性地结合在层析柱上，（2）其它物质全部流出（3）最终用适当洗脱液经过层析柱，可取得纯度极高DNA解聚酶,126/148,九：干燥技术,干燥操作往往是生物产品生产最终一步，干燥目标就在于除去物料中水分，便于保藏和运输。,干燥注意事项-因为生物产品多数为热敏性物质，所以干燥过程必须注意使用那些干燥时间不太长、干燥温度不过高设备。,干燥技术和设备-,（一）喷雾干燥,（二）气流干燥,（三）沸腾干燥,（四）鼓式干燥,（五）冷冻干燥,127/148,（一）喷雾干燥,喷雾干燥是利用不一样喷雾装置，如喷嘴、或者转盘，将浓缩液或者悬浮液喷成雾状，使它们形成含有极大表面积分散液滴，在干燥室内缓缓沉降，并与热空气流发生强烈热交换，在几秒到几十秒之内得到快速干燥方法。,喷雾干燥因为干燥时间极短、防止了生物产品活性破坏，适合用于抗生素、酶制剂、热不稳定性蛋白质干燥。,高速离心喷雾干燥机,128/148,（二）气流干燥,是利用颗粒在气流中能够自由流动特征，使物料与气流一起流经一段长管道，颗粒物料在与气流一起流动过程中，水分得到快速汽化，所以，等到抵达干燥管道出口处时，颗粒物料已经被干燥。,PG系列气流干燥机,129/148,（三）沸腾干燥,是利用流态化技术，被干燥物料由最上层逐层往下移动，而热空气则自下而上，与物料展现逆向流动，在每层面上，使物料展现出“沸腾状态。”称为沸腾干燥法。,沸腾干燥缺点-（1）干燥时间过短，则干燥不透。（2）干燥时间过长，则生物产品活性遭到破坏。,GFG型高效沸腾干燥机,130/148,（四）鼓式干燥,这种干燥器有二个相向转动鼓，鼓内通入热空气，当溶液被加入到鼓面上流动时，就得到了汽化。最终，干燥物料由刮刀刮下。,鼓式干燥应用范围-只能对那些热稳定性良好药品进行干燥。,HZG型直接加热式回转滚筒干燥机,131/148,（五）冷冻干燥,1、基本原理,2、冷冻干燥程序,3、冷冻干燥应用,4、冷冻干燥设备,132/148,1、基本原理,又称升华干燥。将湿物料在-50,到-10之间冻结成固态，然后在高真空（1-0,.001mmHg、1mmHg=133.332Pa,）条件下，将其中水分直接升华成气态，从而到达脱水、干燥目标。,133/148,2、冷冻干燥程序,（1）冻结-普通生物制品共晶点在-20，所以，通常将制品冻结在-35到40之间。再维持12小时，以确保冻结完全彻底。,（2）升华-在低温,-30,到-10之间，利用高真空度（13,.,330Pa）时，将溶剂变成气体直接用真空泵抽走。经过升华过程，可驱除制品中90%水分。,（3）再干燥-将游离冰晶升华完成之后，继续对制品进行加热，以驱除残余水分。,134/148,3、冷冻干燥应用,冷冻干燥法因为处理温度较低，对于热敏性物质处理尤其有利。,适宜于抗生素、维生素干燥。,SZG系列双锥回转真空干燥机,135/148,4、冷冻干燥设备,（1）大规模生产设备由低温干燥箱+冷冻机+真空泵所组成。,（2）小批量试制时能够在玻璃质冷冻干燥器中进行。将样品置于培养皿中，厚度不超出1cm，在冰箱中冻成硬块，再放入装有P2O5或者硅胶吸水剂真空干燥器中，连续抽真空，来到达浓缩、干燥目标。,136/148,第二节：利用微生物进行药品生产实例,一：抗生素类,二：氨基酸类,三：维生素类,四：其它有机物与医药中间体,137/148,一：抗生素类,（一）、抗生素分类,（二）发酵法能够生产种类,（三）生产和制造实例,抗生素瓶洗烘灌塞生产联动线,138/148,（一）、抗生素分类,按进行生产微生物母体分,（1）由细菌生产抗生素-短杆菌肽，短杆菌肽S、杆菌肽、多粘菌素B。,（2）由霉菌生产抗生素-青霉素、灰黄霉素、甾酸菌素。,（3）由放线菌生产抗生素-链霉素、氯霉素、金霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、利福霉素、卡那霉素、交沙霉素、麦迪加霉素。,按化学结构分,（1）,-内酰胺类抗生素-青霉素类、头孢菌素类。,（2）氨基糖苷类-链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素。,（3）大环内酯类-红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉素、制霉菌素。,（4）四环素类-土霉素、金霉素、四环素。,（5）多肽类-杆菌肽、多粘菌素B,139/14
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