miR-196通过调控上皮-间充质转化抑制骨肉瘤细胞侵袭.pdf

:4136 张靖勇，等miR-196通过调控上皮-间充质转化抑制骨肉瘤细胞侵袭miR19 6 通过调控上皮间充质转化抑制骨肉瘤细胞侵袭张靖勇，贺明中国医科大学附属盛京医院骨科,辽宁沈阳110 0 0 0【摘要】目的：探究miR-196在骨肉瘤和瘤旁组织中的表达差异,进而研究miR-196在骨肉瘤MG-63细胞中对SMAD4和上皮-间充质转化相关因子的调控作用及其对细胞侵袭能力的影响。方法：RT-qPCR检测2 0 例患者的骨肉瘤和瘤旁组织中miR-196的差异性表达,Targetscan和miRDB数据库寻找miR-196序列与SMAD4序列是否存在结合位点,Spearman相关系数分析miR-196与SMAD4的表达相关性,双荧光素酶报告基因实验验证 miR-196对 SMAD4的调控作用,RT-qPCR 和Western blotting分别检测miR-196与SMAD4对上皮间充质转化相关因子在RNA水平和蛋白质水平表达的调控关系,Tran-swell实验检测miR-196对MG-63细胞侵袭能力的影响。结果：骨肉瘤组织中miR-196表达低于瘤旁组织,miR-196和SMAD4在骨肉瘤中的表达呈负相关（Y=-0.2418*X+1.188）,过表达miR-196可以在RNA水平和蛋白质水平抑制 SMAD4、N-c a d h e r i n 和Vimentin 的表达并促进E-cadherin 的表达，同时还能抑制骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力。结论：miR-196通过下调SMAD4抑制上皮-间充质转化过程,发挥抑制骨肉瘤MG-63 细胞侵袭能力的作用。【关键词】骨肉瘤；microRNAs;上皮间充质转化；侵袭【中图分类号】R738.1【文章编号】16 7 2-49 9 2-(2 0 2 3)2 2-4136-0 6miR-196 inhibits the invasion of osteosarcoma cells by regulating epithelial-mesen-chymal transitionZHANG Jingyong,HE MingDepartment of Orthopaedic Surgery,Shengjing Hospital,China Medical University,Liaoning Shenyang 110000,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o e x p l o r e t h e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f mi R-19 6 i n o s t e o s a r c o ma a n d a d j a c e n t t i s s u e s,and research into the role of miR-196 on SMAD4 and epithelial-mesenchymal transformation related factors in os-teosarcoma MG-63 cells and the effect of miR-196 on the invasion ability of osteosarcoma MG-63 cells.Meth-ods:RT-qPCR was used to detect the dfferential expression of miR-196 in osteosarcoma and adjacent tissues of 20patients.The Targetscan and miRDB database was used to search for the binding site of miR-196 sequence andSMAD4 sequence.Spearman correlation analysis was used to analyze the correlation between miR-196 and SMAD4expression.The regulation of miR-196 and SMAD4 was verified by dual luciferase reporting assay.The expressionrelationships of miR-196 and SMAD4 and epithelial-mesenchymal transformation related factors at RNA level andprotein level were detected by RT-qPCR and Western bloting respectively.Transwell assay was used to detect theeffect of miR-196 on the invasion ability of osteosarcoma MG-63 cells.Results:miR-196 was down-regulated inosteosarcoma tissues compared with adjacent tissues,and the expression of miR-196 and SMAD4 was negatively cor-related in osteosarcoma(Y=-0.241 8*X+1.188).Overexpression of miR-196 can inhibit the expressions ofSMAD4,N-cadherin and Vimentin at both RNA and protein levels,it can also promote the expression of E-cadher-in,and inhibit the invasion ability of osteosarcoma MG-63 cells.Conclusion:miR-196 can inhibit the progressionof epithelial-mesenchymal transformation by down-regulating SMAD4,thus inhibiting the invasion ability of osteo-sarcoma MG-63 cells.Key words osteosarcoma,microRNAs,epithelial-mesenchymal transition,invasion【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.22.007Modern Oncology 2023,31(22):4136-4141【收稿日期 2022 08-29【修回日期】2023 07 06【基金项目】辽宁省自然科学基金（编号：2 0 2 0 MS-177）；盛京医院345人才计划（40 B）【作者简介】张靖勇（19 9 8 一），男，云南曲靖人，硕士，研究方向：骨肉瘤、骨关节炎。E-mail：z h a n g j y d o c t o r 16 3.c o m【通信作者】贺明（19 7 8），男，辽宁沈阳人，博士，副主任医师，研究方向：骨肉瘤、骨关节炎。E-mail;现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，多见于儿童青少年,患者中位年龄约为16 岁 ，有较高的局部侵袭和早期转移倾向。据统计,局限性骨肉瘤患者存活5年以上者约6 8%,而转移或复发的骨肉瘤患者存活5年以上者只有19%30%2。尽管肿瘤治疗在过去的几十年里取得了长足进步，但转移性和复发性骨肉瘤患者的预后情况仍不理想3-4。鉴于传统治疗方案的不足，迫切需要建立新的治疗策略来提高骨肉瘤患者的总体生存率。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)是细胞失去上皮特性而获得间充质特性的细胞过程，它与肿瘤起始、恶性进展、迁移和治疗耐药等多方面有关5-7 。SMADs家族是一类可以向细胞核传递细胞外信号的蛋白质,TCF-信号通路可以介导SMAD2/3/4复合物转位到细胞核,以SMAD4依赖的方式诱导上皮-间充质转化的发生8-9。microRNAs（m i RNA s）是一类长度约为2 12 3个核苷酸的内源性非编码RNA,它们通过与同源mRNA 的特定种子序列识别并结合,在转录后水平调控基因的表达10 ,并参与协调细胞的增殖、分化和凋亡等过程l-21。mi R-19 6 是miRNAs中的重要一员，其序列为5-CGGCAACAAGAAACUGCCUGAG-3。近年研究证实 miR19 6 参与结直肠癌、肝癌等多种肿瘤的进展13-14,但其能否通过调控骨肉瘤的EMT过程从而影响其侵袭能力目前尚未见报道。因此，我们研究了骨肉瘤中miR19 6 能否通过靶向SMAD4调控EMT过程,进一步明确了 miR-196 对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响,为骨肉瘤的临床诊治和预后寻找新的有效策略。1材料和方法1.1 细胞与试剂1.1.1 实验细胞人骨肉瘤MG-63细胞购于中国科学院上海生物科学院细胞源中心。1.1.2试剂高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、青-链霉素双抗和胎牛血清购自美国 Gibco 公司,miR-196 mimic、m iR-19 6 m im icNC、m i R-19 6 i n h i b i t o r、m i R-19 6 i n h i b i t o r NC、SM A D 4、N-cadherin、E-c a d h e r i n、Vi m e n t i n、U 6 和 GAPDH PCR 引物的设计及双荧光载体均购自广州锐博生物技术有限公司,Lipo-fectamine3000转染试剂、Trizol试剂、PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，Transwell小室购自美国Corning公司，SMAD4、N-c a d h e r i n、E-c a d h e r i n、V i m e n t i n 和 GAPDH 等抗体购自英国Abcam公司。1.2方法1.2.1骨肉瘤及瘤旁组织标本收集我们收集了2 0 2 0 年0 7 月至2 0 2 1年0 7 月在我院和我省肿瘤医院住院患者手术切除的2 0 例骨肉瘤组织标本,并取废弃的瘤旁正常组织作为对照。所取肿瘤组织及瘤旁正常组织均分为两部分，送于病理科制作切片或冻存于液氮罐中待行下一步实验。纳入研究的骨肉瘤患者在手术前均未进行过新辅助化疗,其中男11例、女9 例,年龄范围11 2 8 岁，平均年龄17.6 岁。按照美国癌症联合委员会（AJCC）骨肿瘤TNM分期，I期患者9 例,期患者5例,期患者6 例，未纳人IV期的骨肉瘤患者。其中10 例患者的肿瘤位于股骨远端,4例位于胫骨近端,6 例位于肱骨近端。所有涉及患者MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.22组织标本的实验都取得了患者的知情同意，且经过了中国医科大学伦理委员会的审批，项目伦理编号：2 0 2 0 PS103K。1.2.2miR-196与 SMAD4结合位点生信预测使用Targetscan（w w w.t a r g e t s c a n.o r g）和miRDB（w w w.mirdb.org）数据库预测能够调控SMAD4的潜在miRNA序列及其结合位点。1.2.3细胞培养及转染使用高糖DMEM、10%FBS和1%青链霉素混合液配制骨肉瘤MG-63细胞完全培养基。当细胞密度长至50%7 0%时，按照说明书使用Lipofectamine3000将miR-196mimic、m iR-19 6 m im ic NC 和 miR-196 inhibitor、m iR-19 6inhibitor NC转染于骨肉瘤 MG-63细胞中。以下为具体序列(5-3):miR-196 mimic:sense:UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG,antisense:CAACAACAUGAAACUACCUAUU。m i R-196 mimic 阴性对照:sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT。m i R-19 6 i n h i b i-tor:CCCAACAACAUGAAACUACCUA,miR-196 inhibitor 阴性对照：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA。1.2.4双荧光素酶报告基因实验取状态良好的MG-63细胞培养于2 4孔板中,细胞融合度50%7 0%时,将构建好的SMAD4的野生型（SMAD4-WT)和突变了二者结合位点的突变型(SMAD4-MUT)双荧光素酶报告载体分别与miR-196mimic和miR-196阴性对照共转染至MG-63细胞中,培养48 h后，裂解细胞取上清液，按说明书加人荧光素酶底物并进行检测，海肾荧光素酶活性作为参照,计算萤火虫荧光素酶的相对活性。1.2.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR）检测RNA表达水平收集留存的组织（研磨匀浆）和转染的细胞,加入1mLTrizol吹打裂解细胞，常规方法提取总RNA。PC R检测方法使用SYBRGreen法,PCR扩增条件如下:9 4预变性3min，而后9 430 s、6 0 30 s、7 2 2 m in，一共进行40 个循环。检测引物如表1,miR19 6 的表达以 U6为内参,目的基因的表达以 GAPDH为内参。检测miR-196、SM A D 4 以及 EMT相关因子的表达,并采用 Spearman 相关系数对 miR-196 和SMAD4进行相关性分析。表 1RT-qPCR检测引物序列Tab.1Primer sequence of RT-qPCRPrimermiR-196 FmiR-196 RSMAD4 FSMAD4 RE-cadherin FE-cadherin RN-cadherin FN-cadherin RVimentin FVimentin RU6FU6 RGAPDH FGAPDH R.4137:Sequence(5-3)CCGACGTAGGTAGTTTCATGTTGTGCAGGGTCCGAGGTATTCCCTGCTGGAATTGGTGTTGATGAGGTGTTTCTTTGATGCTCTGTCTTTAGCCTCCCTGTACCTCCCTTGAAATGTGCTGGCCGTTGAGGCTCTACTCCTGGGAAGGTAGCTAAAAGGCAGCCCCACGCAGGAGGCAGAAGAATGGTCTTGGAGGCAAGGTTAGGGGCTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGTGCACCGTCAAGGCTGAGAACTGGTGAAGACGCCAGTGGA.41381.2.6Western blotting检测蛋白表达收集培养的细胞，加人细胞裂解液于冰盒上充分裂解，然后提取各组总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,封闭1h后分别加人Ec a d h e r in、Nc a d h e r in、V im e n t in、SMAD4 和 GAPDH一抗,4 水平摇床孵育过夜。一抗、二抗依次孵育，系统发光成像，检测各蛋白表达情况。1.2.7Transwell实验检测侵袭能力将附带基质胶的Transwell小室置于2 4孔板中,加入300L高糖DMEM培养基至上室中,静置15 2 0 min后吸去多余培养液。向小室的下室中加人50 0 L含10%FBS的高糖DMEM培养基,上室中加人10 0 L细胞悬液,培养2 4h后用棉签擦去上室剩余细胞，将小室置于4%的多聚甲醇中固定2 0 30 min，染色后PBS洗涤3次，显微镜下随机取10个视野观察并进行细胞计数。1.3统计学处理图表中的数据资料采用均数标准差表示,采用单因素或多因素方差分析对各组数据之间差异是否显著进行评估。P0.05时可视作差异具有统计学意义,所有实验数据均使用GraphPad8.1或SPSS22.0进行数据统计和分析处理。2结果2.1 RT-qPCR 检测骨肉瘤与瘤旁正常组织中 miR-196Position2110-2116ofSMAD43UTRhsa-miR-196a-3pPosition2898-2904ofSMAD43UTRhsa-miR-196a-3pPosition4217-4223ofSMAD43UTRhsa-miR-196a-3p2.3Spearman相关系数分析骨肉瘤中 SMAD4与miR-196表达的相关性对 SMAD4和miR19 6 在骨肉瘤中的表达情况使用Spearman相关系数进行分析，分析结果显示，骨肉瘤中SMAD4与miR-196的表达呈负相关（Y=-0.2418*X+1.188,图3）,差异具有统计学意义（P0.05）,验证了miR-196高表达与SMAD4低表达相关联。37Correlationanalysis10+0.0图3miR-196和 SMAD4表达的相关性分析Fig.3 The correlation analysis between the expression of miR-196 andSMAD4张靖勇，等和SMAD4的表达水平与瘤旁正常组织相比,骨肉瘤中 miR-196 表达水平降低,SMAD4的表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P0.05,图1）,说明miR-196在骨肉瘤组织中呈低表达,而SMAD4呈高表达。2.512.0-1.5-1.00.50.0图1miR-196和SMAD4在骨肉瘤和瘤旁组织中的表达差异Fig.1IDifferential expression of miR-196 and SMAD4 in osteosarcomaand adjacent tissues2.2Targetscan 和miRDB数据库预测miR-196与SMAD4的结合位点通过Targetscan数据库和miRDB数据库预测发现SMAD4序列与miR-196序列存在结合位点，说明SMAD4可能是miR-196潜在的靶基因之一（图2)。Predicted consequential pairing oftarget region(top)andmiRNA(bottom)5.UAUGGAGUCUUGCUGUGUUGCCC.3GAGUCCGUCAAAGAACAACGGC5.GGGAAUCCUUCAUGGUGUUGCCU.3GAGUCCGUCAAAGAACAACGGC5.AAACAGACAGGACUGUGUUGCCU.3”GAGUCCGUCAAAGAACAACGGC图2 miR-196与SMAD4存在结合位点Fig.2 Binding sites of miR-196 and SMAD4 are shown0.51.01.52.02.5miR-196miR-196通过调控上皮-间充质转化抑制骨肉瘤细胞侵袭AdjacentOsteosarcomamiR-1962.4双荧光素酶报告基因实验验证miR-196与SMAD4的调控关系经miRDB数据库预测发现SMAD4可能是miR-196潜在的靶基因,因此采用双荧光素酶报告基因实验对其靶向调控作用进行验证(图4）。SMAD4-WT+miR-196 mimic 组的相对荧光素酶活性低于 SMAD4-WT+阴性对照组(P0.05）。结果说明,在骨肉瘤 MG-63细胞中miR-196可通过直接与SMAD4靶向结合而对其表达进行调控。2.5RT=qPCR和Western blotting检测骨肉瘤细胞中miR-196对 SMAD4和 EMT相关因子表达的影响我们采用RT-qPCR和Westernblotting检测各组细胞中SMAD4和EMT相关因子在RNA和蛋白水平的表达情况,以 U6 和 GAPDH为内参。结果显示,与阴性对照组相比,miR-196 mimic 组中 SMAD4、N-c a d h e r in 和 Vimentin 的表达水平显著下降,而Ec a d h e r i n 的表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05,图5A、C),而 miR-196 inhibitor 组中2.572.0-1.5-1.00.50.0AdjacentOsteosarcomaSMAD4现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期SMAD4、Nc a d h e r in 和 Vimentin 的表达水平升高,Ec a d-herin的表达水平下降,差异具有统计学意义（P0.05,图5B、D）。说明当miR-196高表达时,可以抑制SMAD4的表达,从而抑制EMT的进展,而当miR-196低表达时,其促进SMAD4的表达和EMT的进展。2.6Transwell实验检测miR-196对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示,转染miR-196mimic的骨肉瘤MG-63细胞的穿膜细胞数明显少于阴性对照组,差异具有统计学意义（P0.05,图6 A）,而 miR-196 inhibitor 组中的穿膜细胞数多于其阴性对照组，差异具有统计学意义（P0.05,图6 B)。证明miR-196可以抑制骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力。A2.01.5-1.0-0.5-0.0Fig.5 The regulation of miR-196 on SMAD4 and EMT-related factors were detected by RT-qPCR and Western blottingABMODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.22图4双荧光素酶报告基因实验验证miR-196 和 SMAD4 的调控关系Fig.4 The interaction between miR-196 and the SMAD4 was examinedby luciferase reporter assaysBMG-63Control一miR-196SMAD4Vimentin-cadherinN-cadherin图5RT-qPCR 和Western blotting 检测 miR-196对 SMAD4和 EMT 相关因子表达的调控A,C:miR-196 mimic group.B,D:miR-196 inhibitor group.Control 4139.1.5ControlmiR-1961.0-0.5-0.0CMG-63ControlmiR-1962.0-ControlmiR-196inhibitor1.5-工1.0-0.5-0.0-196SMAD4N-cadherinmiR-196SMAD4-WTSMAD4N-cadherinVimentinE-cadherin工GAPDHVimentin10018060402001507100-SMAD4-MUTDControlinhibitorSMAD4N-cadherinVimentinE-cadherinGAPDHMG-63ControlmiR-196MG-63miR-196500ControlmiR-196inhibitor图6 Transwell实验检测骨肉瘤MG-63细胞侵能力（结晶紫染色2 0 0)Fig.6 Transwell assay was used to detect the invasion ability of osteosarcoma MG-63 cells(Crystal violet staining 200)A:miR-196 mimic group.B:miR-196 inhibitor group.3讨论目前miRNAs在骨肉瘤领域取得了大量的研究进展,为骨肉瘤的临床诊断、治疗和预后提供了新的方向15。ZHANG等人的研究发现miR-143高表达可以显著降低肺转移的风险,降低高级别骨肉瘤的发生率,从而提高骨肉瘤患者的整体生存率16 。LIANG 与其同事的研究证明了miRControl-377-3p 是骨肉瘤中的一个抑癌基因,其过表达可以促进肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤细胞的增殖,同时还能够起到抑制EMT和Wnt/c a t e n i n 信号通路的作用17 。还有研究表明,miR-449a和miR-424都以主要的S/Gz期细胞周期蛋白和细胞周期蛋白A2为靶点，来阻止骨肉瘤的进展18 。这些研究都证明了miRNAs在骨肉瘤的临床诊治中具有巨miR-196inhibitor:4140.大的潜力。miR19 6 是miRNAs家族中的重要成员,近年来的研究表明 miR-196 参与到许多癌症的进展中。SHINICHI KAN-NO等人的研究证明miR-196b高表达与胰腺癌不良预后相关,而转染miR-196b 抑制剂则可以在胰腺癌细胞系中起到抑制肿瘤生长的作用,说明miR-196b可能是一种潜在的胰腺癌诊断生物标志物和治疗靶点19 。在喉鳞状细胞癌中，miR-196b水平较高的患者总体生存期较短,其过表达通过靶向抑制SOCS2的表达而促进肿瘤的进展，并导致预后不良【2 0 。ZHAO及其同事的研究表明，卵巢癌组织和细胞系中miR-196a-5p 的表达升高,经 lncRNA GAS5 调控的 miR-196a-5p可以促进卵巢癌的恶化,意味着降低miR-196a-5p的表达可以起到抑制卵巢瘤进展的作用2 1。EMT是一种进化上保守的发育过程,与肿瘤发生有关，通过增强肿瘤细胞的迁移、侵袭和抗调亡能力促进肿瘤细胞转移2-2 3。ZHANG等人证实了NOB1是miR-363的下游靶基因,过表达miR-363或是沉默NOB1基因可以抑制EMT的进展,同时也能抑制骨肉瘤MG-63细胞系的侵袭和转移2 4。LIU等人的研究结果表明,miR-210-5p通过靶向PIK3R5起到促进EMT的作用，进一步加剧了骨肉瘤进展中的致癌自噬,因此抑制miR-210-5p的表达有可能是一种潜在的骨肉瘤治疗方法2 5。另外一项研究指出在骨肉瘤组织中,lncRNAPGM5-AS1可以通过竞争性结合miR-140-5p来上调FBN1,当抑制PGM5-AS1和FBN1的表达或过度表达miR-140-5p时,都可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭、迁移能力以及 EMT 的进程2 6 在本项研究中,我们首先检测了miR-196 在2 0 例骨肉瘤患者的肿瘤组织和瘤旁组织中的表达情况,发现与瘤旁组织相比,骨肉瘤组织中miR-196 的表达水平显著降低。又通过miRDB数据库发现SMAD4与miR-196序列存在结合位点,从而推测 SMAD4可能是miR-196 潜在的靶基因,于是我们通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-196和SMAD4的调控关系,结果证明骨肉瘤组织中 miR-196 可以显著抑制SMAD4的表达。同时我们采用Spearman相关系数对miR-196和SMAD4表达量的相关性进行分析,结果显示二者呈负相关(Y=-0.2418*X+1.188,P0.05)。确定miR-196对SMAD4的靶向调控关系后,我们又通过RT-qPCR和Westernblotting分别对转染miR-196mimic和miR-196 inhibitor的骨肉瘤细胞中的SMAD4、N-c a d h e r i n、Vi m-entin、E一cadherin各自在RNA水平和蛋白质水平的表达情况进行检测，结果发现 miR一19 6 的过表达可以抑制SMAD4、N一cadherin 和 Vimentin的表达，促进E-cadherin的表达,即可以抑制 EMT在骨肉瘤中的进展,而 miR19 6的低表达则起到完全相反的作用。之后又采用Transwell实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力,发现过表达 miR19 6 可以抑制骨肉瘤的侵袭能力。总而言之,本研究发现 miR-196 在骨肉瘤组织中表达下调,并证明了过表达miR-196可以通过靶向抑制 SMAD4的表达而抑制骨肉瘤细胞中EMT的进程,从而降低骨肉瘤细胞的侵袭能力。从我们的实验结果可以推测miR-196和SMAD4有望成为骨肉瘤诊断和治疗的新分子靶点，相关制剂的使用可能降低骨肉瘤的转移率,进一步提高患者的生存率,为骨肉瘤未来的临床治疗策略做出新的贡献。张靖勇，等1CHENGLONG CHEN,LU XIE,TINGTING REN,et al.Immuno-therapy for osteosarcoma:Fundamental mechanism,rationale,andrecent breakthroughsJ.Cancer Lett,2021,500:1-10.2CHENGLONG CHEN,LONG ZHANG,YURUI JIAO,et al.miR-134 inhibits osteosarcoma cell invasion and metastasis through tar-geting MMPI and MMP3 in vitro and in vivo J.FEBS Lett,2019,593(10):1089-1101.3MING HE,GUANGBIN WANG,LINLIN JIANG,et al.miR-486suppresses the development of osteosarcoma by regulating PKC-delta pathway J.Int J Oncol,2017,50(5):1590-1600.4I PANEZ-TORO,J MUNOZ-GARCIA,JW VARGAS-FRAN-CO,et al.Advances in osteosarcoma J.Curr Osteoporos Rep,2023,21(4):330-343.5IEVGENIA PASTUSHENKO,CEDRIC BLANPAIN.EMT transitionstates during tumor progression and metastasis J.Trends Cell Bi-ol,2019,29(3):212 226.6ZHI XIONG CHONG,SWEE KEONG YEAP,WAN YONG HO.Unraveling the roles of miRNAs in regulating epithelial-to-mes-enchymal transition(EMT)in osteosarcoma J.PharmacologicalResearch,2021,172:105818.7MAHAFARIN MARALANI,DARIUSH SHANEHBANDI,MILADASADI,et al.Expression profiles of miR-196,miR-132,miR-146a,and miR-134 in human colorectal cancer tissues in accord-ance with their clinical significance:Comparison regarding KRASmutation J.Wiener Klinische Wochenschrift,2021,133(21-22):1162 1170.8MING ZHAO,LOPA MISHRA,CHUXIA DENG.The role of TGF-beta/SMAD4 signaling in cancer J.Int J Biol Sci,2018,14(2):111-123.9MARIE-LUCIE RACU,LAETITIA LEBRUN,ANDREA ALEXSCHIAVO,et al.The role of SMAD4 inactivation in epithelial-mesenchymal plasticity of pancreatic ductal adenocarcinoma:Themissing linkJ.Cancers,2022,14:4.10ERIC HESSE,HANNA TAIPALEENMAKI.MicroRNAs in bonemetastasis J.Curr Osteoporos Rep,2019,17(3):122-128.11 QUE ZHANG,RUI CAI,GUORONG TANG,et al.MiR-146a-5p targeting SMAD4 and TRAF6 inhibits adipogenensis throughTCF-beta and AKT/mTORC1 signal pathways in porcine intra-muscular preadipocytes J.J Anim Sci Biotechnol,2021,12(1):12.12YUBO XIANG,YINGXIN YANG,JIA LIU,et al.Functional roleof MicroRNA/PI3K/AKT axis in osteosarcoma J.Frontiers inOncology,2023,13:1219211.13 HE XIN,CHUANZHUO WANG,ZHAOYU LIU.miR-196a-5ppromotes metastasis of colorectal cancer via targeting IkappaBal-pha J.BMC Cancer,2019,19(1):30.14 HAO ZHENG,FENGRUI BI,YUAN YANG,et al.Downregulationof miR-196-5p induced by hypoxia drives tumorigenesis andmetastasis in hepatocellular carcinoma J.Horm Cancer,2019,10(4-6):177-189.15 JJULIKA HUBER,MICHAEL T LONGAKER,NATALINA QUAR-TO.Circulating and extracellular vesicle-derived microRNAs asbiomarkers in bone-related diseases J.Frontiers in Endocri-nology,2023,14:1168898.16PEI ZHANG,JIALE ZHANG,HUAHONG QUAN,et al.MicroR-NA-143 expression inhibits the growth and the invasion of osteo-sarcoma J.J Orthop Surg Res,2022,17(1):236.17K LIANG,L LIAO,Q LIU,et al.microRNA-377-3p inhibitsmiR-196通过调控上皮-间充质转化抑制骨肉瘤细胞侵袭【参考文献】现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期osteosarcoma progression by targeting CULI and regulating Wnt/beta-catenin signaling pathway J.Clinical&TranslationalOncology,2021,23(11):2350-2357.18 RITU SHEKHAR,PRIYANKA PRIYANKA,PRAVEEN KUMAR,etal.The microRNAs miR-449a and miR-424 suppress osteosar-coma by targeting cyclin A2 expression J.J Biol Chem,2019,294(12):4381-