miR-149-5p通过MSH5_Wnt信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为.pdf

miR-149-5p 通过 MSH5/Wnt 信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为冯毅1），王小峰1），白西民1），姚胜1），党俊涛1），赵云洁1），蔡冰2）（1）渭南市中心医院神经外科;2）病理科，陕西 渭南714000）摘要 目的探索 miR-149-5p 调控 MSH5/Wnt 信号通路影响胶质瘤细胞恶性生物学行为的具体作用机制。方法RT-qPCR 检测 miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系 A172、U251、HS683、H4 中的表达。CCK-8 检测细胞活力，EDU 染色检测细胞增殖，Transwell 小室检测细胞的迁移和侵袭，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验验证 miR-149-5p 和 MSH5 的靶向关系。Western blot 检测 MSH5、GAPDH、GSK3、-catenin、AXIN2 的蛋白表达。结果miR-149-5p 在胶质瘤组织（P 0.0001）和细胞系中表达降低（P 0.0001），过表达 miR-149-5p 可显著抑制 A172 细胞的增殖（P 0.01）、迁移（P 0.05）和侵袭（P 0.01）、细胞周期（P 0.01），并诱导凋亡（P 0.01），敲降 miR-149-5p 则具有相反的作用。双荧光素酶报告基因实验证明 miR-14-5p 靶向 MSH5。敲降 miR-149-5p 可逆转敲降 MSH5 对 A172 细胞恶性生物学行为的作用。过表达MSH5 通过抑制 GSK3、激活-catenin/AXIN2 通路，促进 A172 细胞的增殖、迁移和侵袭和细胞周期，并抑制细胞凋亡。结论miR-149-5p 通过靶向上调 MSH5，抑制 AXIN2 表达激活-catenin/AXIN2 通路，从而抑制间质瘤细胞的恶性生物学行为。关键词胶质瘤；miR-149-5p；MSH5；恶性生物学行为；增殖；转移中图分类号 R739.41 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）08 0059 12miR-149-5p Regulates Malignant Biological Behavior ofGlioma Cells Through MSH5/WNT Signaling PathwayFENG Yi1），WANG Xiaofeng1），BAI Ximin1），YAO Sheng1），DANG Juntao1），ZHAO Yunjie1），CAI Bing2）（1）Dept.of Neurosurgery;2）Dept.of Pathology，Weinan Central Hospital，Weinan Shanxi 714000，China）Abstract ObjectiveTo explore the mechanism of miR-149-5p regulating the malignant biologicalbehavior of glioma cells through MSH5/Wnt signaling pathway.MethodsRT-qPCR was used to detected theexpression of miR-149-5p in glioma tissues and cell lines A172，U251，HS683 and H4.CCK-8 was used todetected cell viability，and EDU staining was performed to measure cell proliferation，Transwell assay was used todetected cell migration and invasion，and flow cytometry examined cell cycle and apoptosis.The dual luciferasereporter gene experiment verified the targeting relationship between miR-149-5p and MSH5.The proteinexpressions of MSH5，GAPDH，GSK3，-catenin and AXIN2 were detected by Western blot.ResultsTheexpression of miR-149-5p was decreased in glioma tissues（P 0.0001）and cell lines（P 0.0001）.Overexpression of miR-149-5p significantly inhibited the proliferation（P 0.01），migration（P 0.05），invasion收稿日期20230613基金项目陕西省渭南市重点科技计划项目（2019-ZDYF-SFCX-13）；陕西省渭南市首批自然科学和工程技术类青年人才支持项目作者简介冯毅（1978），男，陕西西安人，副主任医师，主要从事颅脑肿瘤及脊柱脊髓相关疾病的诊治工作。通信作者蔡冰，E-mail：昆明医科大学学报2023，44（8）：5970JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20230823CN531221/R（P 0.01），and cell cycle（P 0.01）of A172 cells，and induced cell apoptosis（P 0.01）.However，knockingdown miR-149-5p had the opposite effect.Dual luciferase assay verified that miR-149-5p targeted MSH5.Knockdown of miR-149-5p reversed the effect of knocking down MSH5 on the malignant biological behavior of A172cells.Overexpression of MSH5 promoted the proliferation，migration and invasion of A172 cells，cell cycle，andinhibited apoptosis by inhibiting GSK3 and activating-catenin/AXIN2 pathway.ConclusionsmiR-149-5pinhibited the AXIN2 expression and activated the-catenin/AXIN2 pathway by targeting up-regulation of MSH5，thereby inhibited the malignant biological behavior of stromal tumor cells.Key words Glioma；miR-149-5p；MutS Homolog 5；Malignant biological behavior；Proliferation；Metastasis胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤。据报道，每年约有 14000 例新增的胶质瘤患者1，且老年人具有较高的发病率。尽管目前手术切除以及放化疗等医学技术取得了很大的进步，但患者的预后仍然较差，临床上仍无法彻底治愈恶性程度较高的胶质瘤。因此，探索胶质瘤的潜在发病机制，寻找新的预后标志物迫在眉睫。miRNA 是由1825 个核苷酸组成的非编码 RNA，已被广泛报道参与调节肿瘤细胞的生理过程23，通过与靶 mRNA 的异常表达和交叉调节可作为肿瘤的诊断和预后标志物。例如：miR-4319 在甲状腺癌组织和细胞中下调，抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化4。miR-149 是肿瘤中具有广泛调控作用的 miRNA，由 2q37.3 上的 MIR149 基因编码。Xu B 等5报道，促进 miR-149-5p 表达可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的毒性。但 miR-149-5p 在胶质瘤中的作用机制尚不清楚。因此，本研究将探讨 miR-149-5p 对胶质瘤细胞恶性生物学行为的调控作用及其具体作用机制。1材料与方法1.1临床样本收集收集在渭南市中心医院就诊并确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织样本 30 例，在距肿瘤组织 2 cm处获得相邻的癌旁组织样本（即对照组），在收样前患者知情并签署知情同意书。采集样本的患者除手术治疗外未接受其他治疗。本研究工作遵循世界医学协会赫尔辛基宣言进行，同时获得了渭南市中心医院伦理委员会的批准（2023 研 004-3）。1.2细胞系胶质瘤细胞系 A172（货号：CL-0012，Pricella，武汉）、U251（货号：CL-0237，Pricella，武汉）、HS683（货号：CL-0362，Pricella，武汉）、H4（货号：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形胶质细胞 HA1800（货号：AC340443）和 293T 细胞（货号：KMCC-001-0255）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。1.3主要试剂90%高糖 DMEM 培养基、DMEM 培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司。PrimeScriptRT 试剂盒和 gDNA Eraser 购自 Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和 miR-149-5pinhibitor 序列合成由吉玛基因提供技术支持。MSH5 抗体购自 ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3、-catenin、AXIN2 一 抗 购 自 Abcam。Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒、胰蛋白酶、CCK-8 试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京 Solarbio。Hoechst33342 试剂、Wnt 通路抑制剂 Triptonide 以及 Wnt 通路激活剂 HLY78 购自MedChemExpress。荧光显微镜购自莱卡。离心机购自深圳瑞沃德。细胞培养箱购自 Eppendorf。Bio-RAD 蛋白成像系统购自上海艾研。1.4细胞培养A172、U251、HS683、H4 细胞分别接种于含10%FBS、1%P/SH 的 DMEM 培养基。A1800 细胞接种于含 10%FBS 的高糖 DMEM 培养基中。293T 细 胞 培 养 在 含 10%FBS、1%Glutamax 和1%双抗的 DMEM 培养基内。培养基置于 37、5%CO2的细胞培养箱中。1.5细胞转染和处理取生长良好的 A172 细胞，经胰蛋白酶消化后接种于不含抗生素的培养基中。次日，根据Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂盒说明书，分别将 NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和 miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-60昆明医科大学学报第 44 卷MSH5+miR-149-5pinhibitor 以 及pcDNA-MSH5分别转染至 A172 细胞。待细胞培养 48 h 后，分别检测转染效率，成功转染的细胞用于后续实验。转染的 pcDNA-MSH5 的 A172 细胞再根据试剂说明分别用 Triptonide 和 HLY78 处理。1.6RT-qPCR 实验TRIzol 试剂提取总RNA，并使用PrimeScriptRT 试剂盒和 gDNA Eraser 将 1000 ng RNA 逆转录为 cDNA。使 用 SYBR Premix Ex Taq II 和Applied Biosystems 7500 实时 PCR 系统进行实时聚合酶链式反应。2-Ct法计算目标基因的相对表达。U6 作为 miRNA 的内参。引物序列见表 1。表1引物序列Tab.1Primersequences目的基因引物序列（F：正向序列，R：反向序列，5-3）miR-149-5pF:CTCTGGCTCCGTGTCTTCACR:CTGCCCCAGCACAGCCU6F:TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGCR:CCAGTGCAGGGTCCGAGGT1.7CCK-8 实验CCK-8 用于测定细胞活力。调整细胞密度，向 96 孔板的每孔中接种 1000 个 A172 细胞，每孔 100 L。培养板置于 5%CO2细胞培养箱中培养。在培养的第 0、24、48、72、96 h 向每孔中添加 10 L CCK-8 试剂，通过酶标仪测定细胞的光密度值。1.8Western blot 实验细胞在冰上含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 溶液中裂解。BCA 试剂盒检测蛋白质的浓度。将分离的蛋白质进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，随后转移至PVDF 膜 上。将 膜 与 一 抗（MSH5：0.05 g/mL；GAPDH：12000；GSK3：12000；-catenin：14000；AXIN2：1 g/mL）进行过夜孵育，再与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育 2 h。经 ECL 化学发光底物曝光后用蛋白成像系统采集图像。Image J 软件用于分析条带灰度值。1.9EDU 实验收集对数生长期的细胞培养在 96 孔板中，用100 L 含20 mol/L EdU 的培养基处理。在37、5%CO2环境中孵育 2 h，用 4%多聚甲醛分别固定各组细胞 30 min，再置于含 0.5%Triton-X-100 的 PBS 溶液中孵育 20 min。Hoechst33342 溶液染细胞核。荧光显微镜观察染色结果并拍照记录。1.10Transwell 检测迁移和侵袭成功转染的细胞经胰蛋白酶消化后，收集细胞并计数。将 4104个细胞用 100 L 无血清培养基悬浮制得细胞悬液并接种至 Transwell 小室上室，将含 10%FBS 的完全培养基加至小室下室。Transwell 小室置于细胞培养箱中培养 48 h。随后用 4%多聚甲醛固定细胞 0.1%结晶紫溶液染色。显微镜拍照并计数。侵袭实验接种细胞前在小室上室中加入稀释后的 Matrigel 基质胶，胶凝固后再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同。1.11流式细胞术检测细胞周期取生长良好的各组细胞，经 0.25%胰蛋白酶消化后，重悬于 PBS 中。然后在冰冷的 70%乙醇中过夜固定。随后，1000 r/min 条件下将细胞离心 5 min，并重悬在 50 L RNase A 中，于 37 下孵育 30 min。将 400 L 碘化丙啶（PI）细胞悬液中混匀，孵育 30 min，通过流式细胞仪进行检测。1.12流式细胞术检测细胞凋亡率采用双染法 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。将转染后的细胞接种至 6孔板中，加入完全培养基培养 24 h。收集细胞与Annexin V-FITC 试剂在常温中避光孵育 15 min，然后再与 PI 溶液避光孵育 15 min。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率。第 8 期冯 毅，等miR-149-5p 通过 MSH5/Wnt 信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为611.13双荧光素酶报告基因实验经 PCR 扩增 MSH5 的 3-UTR（MSH5-WT）并插入 p-GL3 报告载体中，同时构建与 miR-149-5p 具有靶向结合位点的 MSH5 3-UTR 突变序列（MSH5-MUT），并转入 p-GL3 报告载体。将 NCmimic 或 miR-149-5p mimic 分别与 MSH5-WT 或MSH5-MUT 经 Lipofectamine 2000 共转染至 293T细胞中。转染 48 h 后，通过双荧光素酶测定法分析荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性作为内部参照。1.14统计学处理每组实验均进行 3 次重复。GraphPad Prism8.0用于数据分析并作图。来自三个及以上独立重复实验的数据均表示为“均数标准差”。非配对t检验用于分析 2 组间的差异。单因素方差分析用于分析多组间的差异，Tukey 检验用于多组间的两两比较。P 0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞中的表达收集胶质瘤患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织，通过 RT-qPCR 检测显示，miR-149-5p 肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织（图 1A，P 0.0001）。此外，miR-149-5p 在人胶质瘤细胞系A172、U251、HS683、H4 中的表达明显低于人正常星形胶质细胞 HA1800（图 1B，P 0.0001）。由此，推测 miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系中的低表达与胶质瘤的发展密切相关。15AB1050Para-cancerCancer*Rative expression of miR-149-5P1.51.00.50HA1800A172U251HS683H4*Rative expression of miR-149-5P图1miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞中的表达Fig.1miR-149-5pwasdownregulatedingliomatissuesandcellsA：RT-qPCR 检测胶质瘤组织中 miR-149-5p 的表达，与 Para-cancer 组相比，*P 0.0001；B：RT-qPCR 检测 miR-149-5p 在人正常星形胶质细胞阿和人胶质瘤细胞中的表达，与 HA1800 组相比，*P 0.01，*P 0.0001。2.2miR-149-5p 对 A172 细胞恶性生物学行为的影响为进一步探索 miR-149-5p 对胶质瘤细胞的作用机制，分别在 A172 细胞中转染 NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor 和 miR-149-5pinhibitor。检测显示，转染 miR-149-5pmimic 明显增加 miR-149-5p 的表达，转染 miR-149-5pinhibitor 组 中 miR-149-5p 表 达 降 低。CCK-8、EDU、Transwell 以及流式细胞术检测表明，过表达 miR-149-5p 明显抑制 A172 细胞的增殖（图 2B、2C 和 2F，P 0.01）、迁移（图 2D 和 2G，P 0.05）和侵袭（图 2E 和 2H，P 0.01），促进 G1 期细胞比例（图 3A 和 3B，P 0.01）以及凋亡率（图 3C 和3D，P 0.01）。与 NC inhibitor 组相比，敲降 miR-149-5p 组中细胞的增殖活力（P 0.05）、迁移（P 0.05）和侵袭（P 0.05）能力显著升高，G1 期细胞比例（P 0.05）以及凋亡水平（P 0.05）降低。综上可知。过表达 miR-149-5p 可显著抑制 A172 细胞的增殖、转移和细胞周期，诱导细胞凋亡。敲降 miR-149-5p 可明显促进 A172 细胞的恶性生物学行为。2.3miR-149-5p 靶向 MSH5通过 starbase 数据库预测发现，MSH5 与 miR-149-5p 具有靶向结合序列，见图 4A。双荧光素酶报告基因实验验证证实，过表达 miR-149-5p可明显抑制 MSH5 野生型载体的荧光素酶活性见图 4B，P 0.05。通过 GEPIA 数据62昆明医科大学学报第 44 卷库预测显示，MSH5 在胶质瘤组织中表达降低（图 4C，P 0.01）。RT-qPCR 发现，过表达 miR-149-5p 可抑制 MSH5 的蛋白表达（图 4D，P 0.01），而敲降 miR-149-5p 组 A172 细胞中 MSH5表达显著增加（图 4E，P 0.01）。由此证实，miR-149-5p 靶向负调控 MSH5。2.4miR-149-5p 靶向 MSH5 调控 A172 细胞的恶性生物学行为为 进 一 步 探 索 miR-149-5p 调 控 MSH5 对A172 细胞恶性生物学行为的影响，分别在 A172细胞中转染 sh-NC、sh-MSH5 和 sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot 结果见图 5A 和 5B，转染 sh-MSH5 组 A172 细胞中 MSH5 的蛋白表达低于 sh-NC 组（P 0.001），转染 sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor 组中 MSH5 的蛋白表达高于 sh-MSH5 转 染 组（P 0.05）。通 过 CCK-8、EDU、Tranwell 和流式细胞术检测表明，敲降 MSH5 可显著抑制 A172 细胞的增殖活力（图 5C5E，均P 0.01）、迁移（图 5F 和 5G，P 0.01）和侵袭（图5H 和5I，P 0.05），促进G1 期细胞比例（图6A5ABDFGHEC43210*#NCNC mimicmiR-149-5pmimicNC inhibitormiR-149-5pinhibitorRative expressionof miR-149-5P150100500NCNC mimicmiR-149-5pmimicNC inhibitormiR-149-5pinhibitorCell viability(%)*#1.51.00.50NCNC mimicmiR-149-5pmimicNC inhibitormiR-149-5pinhibitor*#150100500NCNC mimicmiR-149-5pmimicNC inhibitormiR-149-5pinhibitor*#804060200NCNC mimicmiR-149-5pmimicNC inhibitormiR-149-5pinhibitor*#NCNC mimicNC inhibitormiR-149-5p mimicmiR-149-5p inhibitorNCNC mimicNC inhibitormiR-149-5p mimicmiR-149-5p inhibitorNCNC mimicNC inhibitormiR-149-5p mimicmiR-149-5p inhibitor图2miR-149-5p 对 A172 细胞恶性生物学行为的影响Fig.2EffectofmiR-149-5ponmalignantbiologicalbehaviorofA172cellsA：RT-qPCR 检测 miR-149-5p 的表达；B：CCK-8 检测细胞活力；C 和 F：EDU 检测细胞增殖；D 和 G：Transwell 检测细胞迁移能力；E 和 H：Transwell 检测细胞侵袭能力；与 NC mimic 组相比，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.000 1；与 NCinhibitor 组相比，#P 0.05。第 8 期冯 毅，等miR-149-5p 通过 MSH5/Wnt 信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为63和 6B，P 0.01）以及细胞凋亡率（图 6C 和 6D，P 0.001）。同时敲降 miR-149-5p 和 MSH5 组中细胞的增殖（P 0.05）、迁移（P 0.05）和侵袭（P 0.05）能力高于敲降 MSH5 组，G1 期细胞比例（P 0.05）和凋亡（P 0.05）水平低于仅敲降MSH5 组。综 上 所 述，敲 降 miR-149-5p 靶 向MSH5，可逆转敲降 MSH5 对 A172 细胞恶性生物学行为的抑制作用。2.5MSH5 调控 Wnt 信号通路对 A172 细胞的作用Wnt 信号通路被报道在胶质瘤的发展进程中发挥着重要作用，因此，笔者进一步探讨 miR-WatsonRMS:3.80Freq G1:45.95Freq S:18.42Freq G2:25.28Mean G1:940,832Mean G2:1,800,208G2/G1:1.91CV G1:5.94%CV G2:7.85%Freq Sub-G1:0.02Freq Super-G2:10.34WatsonRMS:3.55Freq G1:43.26Freq S:22.39Freq G2:22.00Mean G1:950,488Mean G2:1,820,194G2/G1:1.92CV G1:4.99%CV G2:7.15%Freq Sub-G1:1.44Freq Super-G2:10.92WatsonRMS:2.08Freq G1:41.78Freq S:25.08Freq G2:19.87Mean G1:979,283Mean G2:1,889,984G2/G1:1.93CV G1:4.53%CV G2:5.74%Freq Sub-G1:0.90Freq Super-G2:12.38NCNC mimicCell cycle(%)miR-149-5pmimicmiR-149-5pinhibitorNC inhibitor1、NC组/E1ACDB2、mimic NC组/E13、miR-149-5p mimic组/E15、miR-149-5p inhibitor组/E14、inhibitor NC组/E1WatsonRMS:1.8Freq G1:44.33Freq S:20.11Freq G2:23.10Mean G1:966,493Mean G2:1,853,568G2/G1:1.92CV G1:43.57%CV G2:6.10%Freq Sub-G1:0.19Freq Super-G2:12.27WatsonRMS:4.75Freq G1:50.57Freq S:26.47Freq G2:16.41Mean G1:1,009,332Mean G2:1,944,975G2/G1:1.93CV G1:4.27%CV G2:4.40%Freq Sub-G1:0.12Freq Super-G2:6.42150G2G1S10050*#01、NC组/E12、mimic NC组/E13、miR-149-5p mimic组/E15、miR-149-5p inhibitor组/E14、inhibitor NC组/E1370320240Count1608000.6G1G22345 5.6365320240Count1608000.6G1G22345 5.6333240160Count8000.6G1G22345 5.6107.5106105104103102.1PE-H102.2104105106107Q2-45.15%Q2-394.68%Q2-10%Q2-20.17%108.1398320240Count1608000.6G1G22345 5.6484400300Count20010000.6G1G2234PE-A(106)PE-A(106)PE-A(106)PE-A(106)PE-A(106)FITC-HFITC-HFITC-HFITC-HFITC-H5 5.6NCNC mimicCell apoptosis rate(%)miR-149-5pmimicmiR-149-5pinhibitorNC inhibitor*#107.5106105104103102.1PE-H102.2104105106107Q2-46.52%Q2-393.15%Q2-10%Q2-20.33%108.1107.5106105104103102.1107.5106105104103102.1PE-H102.2104105106107Q2-44.91%Q2-394.90%Q2-10%Q2-20.19%108.1107.5106105104103102.1PE-H102.2104105106107Q2-44.34%Q2-395.36%Q2-10%Q2-20.30%108.1PE-H102.2104105106107Q2-410.44%Q2-389.21%Q2-10%Q2-20.35%108.120151050图3miR-149-5p 对 A172 细胞恶性生物学行为的影响Fig.3EffectofmiR-149-5ponmalignantbiologicalbehaviorofA172cellsA 和 B：流式细胞术检测细胞周期；C 和 D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与 NC mimic 组相比，*P 0.01；与 NCinhibitor 组相比，#P 0.05。64昆明医科大学学报第 44 卷149-5p/MSH5 分子轴是否通过 Wnt 信号通路而调控 胶 质 瘤 的 进 程。分 别 用 Wnt 通 路 抑 制 剂Triptonide 以及 Wnt 通路激活剂 HLY78 处理转染pcDNA-MSH5 的 A172 细胞。检测结果见图 7A，与 pcDNA-NC 作 用 相 比，pcDNA-MSH5 组 中MSH5（图7B，P 0.001）、GSK3 表达降低（图7C，P 0.001），-catenin（图 7D，P 0.05）和 AXIN2（图 7E，P 0.01）表达升高。与 pcDNA-MSH5 组相比，pcDNA-MSH5+Triptonide 组中 GSK3 表达 升 高（P 0.001），-catenin（P 0.05）和AXIN2（P 0.01）表达降低；而 pcDNA-MSH5+HLY78 组中 GSK3 表达降低（P 0.001），-catenin（P 0.05）和 AXIN2（P 0.05）表达升高。过表达 MSH5 且经 Triptonide 处理可显著下调过表达 MSH5 对 A172 细胞的增殖（图 7F7H，均P 0.01）、迁移（图 7I7J，P 0.01）和侵袭（图 7K7L，P 0.01）的促进作用以及对 A172 细胞的 G1期细胞比例（图 8A8B，P 0.05）和凋亡水平（图 8C 8D，P 0.05）的 抑 制 作 用。过 表 达MSH5 且经 HLY78 处理可显著上调过表达 MSH5对 A172 细胞的增殖（均P 0.05）、迁移（P 0.05）和侵袭（P 0.05）的促进作用以及对 A172 细胞的G1 期细胞比例（P 0.05）和凋亡水平（P 0.05）的抑制作用。综上表明，过表达 MSH5 通过激活Wnt 信号通路促进 A172 细胞的恶性表型。3讨论胶质瘤占原发性脑肿瘤的 80%，由于有空间占位效应，使患者的颅内压升高，可能导致患者呕吐、视力丧失或出现癫痫症状6。同时，胶质瘤具有较强的侵袭性，手术很难将病灶完全切除7。因此，越来越多的研究者开始研究靶向治疗，以期通过寻找有效的生物标志物为胶质瘤提供新的治疗方案。miRNA 在基因表达中具有重要的调控作用，据估计，约有三分之一的蛋白表达受 miRNA 的调控89。miR-149-5p 被证实在多种肿瘤细胞中作为抑癌因子抑制肿瘤的进程。Li Q 等10证明，在胃癌组织和细胞系中 miR-149-5p 低表达，过表2.0ABCD1.5Rative flusiferase activityRative expression of MSH5 proteinLog2 fold change1.00.50MSH5-WTTumorPara-cancerNCmiR-149-5pmimicmiR-149-5pinhibitorMSH5-MUT*MSH5GAPDH93 kDa37 kDa*NC mimicMSH5-WT:5uugaacguuuu CAU-GAGCCAGg 3miR-149-5p:3 cccucacuucu MSH5-MUT:5 uugaacguuuu CAU-GAGCCAGg 3G U G C C U C G G U C u 5 miR-149-5p mimic1.00.80.60.40.200123456图4miR-149-5p 靶向 MSH5Fig.4miR-149-5ptargetedMSH5A：starbase 数据库预测 miR-149-5p 和 MSH5 的结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证 miR-149-5p 和 MSH5 的靶向关系，与 NC mimic 组相比，*P 0.05；C：GEPIA 数据库预测 MSH5 在胶质瘤组织中的表达，与 Para-cancer 组相比，*P 0.01；D：Western blot 检测 MSH5 的蛋白表达，与 NC 组相比，*P 0.01。第 8 期冯 毅，等miR-149-5p 通过 MSH5/Wnt 信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为65达 miR-149-5p 显著抑制胃癌细胞的增殖和转移并 诱 导 细 胞 凋 亡。在 乳 腺 癌 细 胞 中，circ-0072995 通过靶向下调 miR-149-5p 可促进乳腺癌细胞的恶性表型和无氧糖酵解11。miR-149-5p 靶向下调 RGS17，抑制前列腺癌细胞的活力、增殖和迁移12。在本研究中，笔者发现 miR-149-5p 在胶质瘤组织和细胞系中表达降低，过表达miR-149-5p 显著抑制胶质瘤 A172 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞 G1 期的比例并诱导细胞凋亡。而敲降 miR-149-5p 可促进 A172 细胞的增殖和转移，抑制 G1 期细胞比例以及细胞凋亡率。此外，miR-149-5p 也被报道参与炎症及代谢类疾病的调控1315。例如：miR-149-5p 可抑制骨关节炎和类风湿性关节炎中促炎细胞因子 IL-1、IL-6 和 TNF-的水平15。黄芪多糖通过上调miR-149-5p 的表达，改善高糖和棕榈酸诱导的小鼠胰腺 细胞的增殖和胰岛素的分泌13。过表达 miR-149-5p 显著聚集尿酸诱导的干细胞中甘油三酯的积累16。MutS 同 源 物 5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS 蛋白家族的成员，与 MSH4 形成异二聚体复合物，参与 DNA 配错修复和减数分裂重组，在DNA 双链断裂的同源重组修复过程中发挥重要作用17。研究发现，MSH4 和 MSH5 中的遗传变异是男性不育的相关原因18。MSH5 突变可损害DNA 同源重组修复，可能导致非综合性原发性卵1.51.0*#0.50Rative expressionof MSH5 proteinNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5pinhibitorNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5p inhibitor150100*#500Cell viability(%)NCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5pinhibitor1.51.0*#0.50Relative flusiferaseactivityNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5pinhibitor804060*#200Cell migrationnumbersNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5pinhibitor804060*#200Cell invasionnumbersNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5pinhibitorMSH5ABCEGIDFHGAPDH93 kDa37 kDaNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5p inhibitorNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5p inhibitorNCsh-NCsh-MSH5sh-MSH5-miR-149-5p inhibitor图5miR-149-5p 靶向 MSH5 调控 A172 细胞的恶性生物学行为Fig.5miR-149-5ptargetedMSH5toregulatethemalignantbiologicalbehaviorofA172cellsA 和 B：Western blot 检测 MSH5 蛋白表达；C：CCK-8 检测细胞活力；D 和 E：EDU 实验检测细胞增殖