GA∕T 1629-2019 法庭科学 血液、尿液中百草枯检验 气相色谱和气相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 血液、尿液中百草枯检验 气相色谱和气相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for paraquat in blood and urine samplesGC and GC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准起草单位：中国刑事警察学院。 本标准起草人：张婷、朱昱、陈学国、宋辉、邢丽梅、姜兆林、邹宁、齐宝坤。GA/T 1 法庭科学 血液、尿液中百草枯检验 气相色谱和气相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学血液、尿液中百草枯的气相色谱（GC）和气相色谱-质谱（GC-MS）定性定量检验方法。 本标准适用于法庭科学血液、 尿液中百草枯的定性分析和定量分析。 其他可疑样品中百草枯的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化、衍生化，采用气相色谱法或气相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法或内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合GB/T 6682 中规定的三级水。在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 环己烷； b) 6%高氯酸水溶液：取 72%高氯酸溶液 10mL，加入水 110mL 混匀； c) 饱和氢氧化钠溶液； d) 20%硼氢化钠溶液：称取硼氢化钠固体 2.0g，加水 8.0mL 溶解并混匀（现用现配） ； e) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据百草枯标准物质的纯度，称取适量，用水配制 1.0mg/mL百草枯标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月； 2) 0.1mg/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的百草枯标准物质溶液 1.0mL，用水稀释并定容至 10mL，配制成 0.1mg/mL 百草枯标准物质工作溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期6 个月。实验中所用其他浓度标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准物质溶液用水稀释得到； GA/T 2 3) 1.0mg/mL 内标溶液：根据乙基百草枯内标物质的纯度，称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL 内标物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 12 个月； 4) 0.1mg/mL 内标工作溶液： 移取 1.0mg/mL 的乙基百草枯内标溶液 1.0mL， 用水稀释并定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 6 个月。实验中所用其他浓度的内标溶液均由 0.1mg/mL 内标溶液用甲醇稀释得到； 5) 0.1mg/mL 基质标准溶液：取与检材基质相同的空白样品，按 7.1.1.1 样品提取方式提取，得上清液，用上清液配制成 0.1mg/mL 百草枯基质标准物质溶液。现配现用。其他浓度的基质标准物质溶液由 0.1mg/mL 基质标准溶液用上清液稀释得到； 6) 0.1mg/mL 基质内标溶液：取与检材基质相同的空白样品，按 7.1.1.1 样品提取方式提取，得上清液，用上清液配制成 0.1mg/mL 乙基百草枯基质内标物质溶液。现配现用。其他浓度的基质内标物质溶液由 0.1mg/mL 基质内标溶液用上清液稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) pH试纸：范围114； 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱仪：配有氮磷检测器（NPD）； b) 气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI）； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡器； f) 水浴锅； g) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 沉淀蛋白 取血样或尿液检材样品1.0mL于具盖离心管中（若采用内标法，则加入内标乙基百草枯溶液，使内标浓度为0.5g/mL，混匀），加入6%高氯酸溶液1.0mL（若为尿液样品，不添加6%高氯酸溶液），振荡30s，8000r/min离心3min，分离上清液，按7.1.1.2进行衍生化操作。 7.1.1.2 衍生化 取7.1.1.1上清液，加入饱和氢氧化钠溶液0.1mL，调节pH值大于等于12，再加入20% 硼氢化钠溶液0.5 mL，于室温反应30min，加入环己烷0.5mL，振荡30s，8000r/min离心3min，取上清液，作为检材样品衍生液，供GC-MS分析。 GA/T 3 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加百草枯标准物质，作为添加样品（血液添加样品的浓度为0.5g/mL，尿液添加样品的浓度为0.2g/mL），与检材样品平行操作，得到空白样品衍生液和添加样品衍生液，同时对基质标准溶液衍生，得到基质标准溶液衍生液，供仪器分析。 若采用内标法，不做添加样品，空白样品（不加内标）与检材平行操作，同时对基质标准溶液和基质内标溶液衍生化，得到空白样品、基质标准溶液及基质内标溶液衍生液，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱 1：DB-5 毛细色谱柱（30m0.32mm0.25m）或等效色谱柱； b) 色谱柱 2：HP-50+毛细色谱柱（30m0.32mm0.25m）或等效色谱柱； 注：DB-5 和 HP-50+都是 Aglient 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 柱温：100 保持 1min，以 20/min 的速率升温至 280，保持 5min； d) 检测器温度：290； e) 进样口温度：260； f) 载气：高纯氮； g) 流速：2.0mL/min； h) 进样方式：不分流，1min 后分流，分流比 5:1。 7.1.2.1.2 气相色谱-质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：RTX-5MS 毛细色谱柱（30m0.32mm0.25m）或等效色谱柱； 注：RTX-5MS柱是Restek公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：100 保持1 min，以20/min 的速率升温至280，保持5 min； c) 进样口温度：260； d) 传输线温度：260； e) 离子源温度：200； f) 载气：高纯氦; g) 流速1.0mL/min； h) 扫描范围：50amu200amu； i) 进样方式：不分流，1min 后分流，分流比5:1； j) 百草枯及内标物质衍生物的特征离子见表 1。 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白、添加样品及基质标准溶液的衍生液（若采用内标法，分别吸取检材、空白、基质内标溶液及基质标准溶液的衍生液） ，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 GA/T 4 表 1 百草枯及乙基百草枯衍生物的特征离子 检材 衍生物 特征离子 尿液 百草枯衍生物 m/z 96*，m/z 192*，m/z 194，m/z 148*，m/z150 乙基百草枯衍生物 m/z 110*，m/z 162*，m/z164, m/z 220*, m/z 222 血液 百草枯衍生物 m/z 96*，m/z 192，m/z 194*，m/z 148，m/z150* 乙基百草枯衍生物 m/z 110*，m/z 162，m/z164*, m/z 220, m/z 222* 尿液基质标准溶液 百草枯衍生物 m/z 96*，m/z 192*，m/z 194，m/z 148*，m/z150 尿液基质内标溶液 乙基百草枯衍生物 m/z 110*，m/z 162*，m/z164, m/z 220*, m/z 222 血液基质标准溶液 百草枯衍生物 m/z 96*，m/z 192，m/z 194*，m/z 148，m/z150* 血液基质内标溶液 乙基百草枯衍生物 m/z 110*，m/z 162，m/z164*, m/z 220, m/z 222* 标准物质 百草枯衍生物 m/z96，m/z192，m/z194，m/z148, m/z150 乙基百草枯衍生物 m/z 110，m/z 162，m/z164, m/z 220, m/z 222 注：*表示衍生物定性的特征离子，百草枯衍生物和乙基百草枯衍生物的定量离子碎片均为m/z96。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液或尿液检材样品1.0mL两份（若采用内标法，则加入内标乙基百草枯溶液，使内标浓度为2g/mL），按7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份， 其中两份分别添加百草枯标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(10050)% ，若采用内标法，则添加样品中还需加入内标乙基百草枯溶液，使内标浓度为2g/mL，混匀），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品衍生液和添加样品衍生液， 同时对基质标准溶液及基质内标溶液衍生， 得到基质标准溶液及基质内标溶液衍生液，供仪器分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品衍生液及基质标准溶液衍生液（若采用内标法，分别吸取检材、空白和内标物质衍生液及基质标准溶液衍生液） ，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析 23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标-单点法 记录各样品衍生液平行进样23次的目标物峰面积值，按公式（1）计算含量： GA/T 5 添样添样添样VMAVMAW= . (1) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（g/mL） ； A样检材样品衍生液中目标物峰面积平均值； M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g） ； V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL） ； A添添加样品衍生液中目标物峰面积平均值； M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL） ； V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL） 。 7.2.3.1.2 内标-单点法 记录各样品衍生液平行进样 23 次的目标物及内标物峰面积值，按公式(2)计算校正因子，按公式(3)计算含量： 标内内标AMAMf=. (2) 式中： f 校正因子； M标 添加样品中目标物添加量，单位为微克(g)； A内 添加样品中内标物峰面积平均值； M内 添加样品中内标物添加量，单位为微克(g)； A标 添加样品中目标物峰面积平均值。 样内内样MAMAfW= . (3) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（g/mL） ； f 校正因子； A样 检材样品衍生液中目标物峰面积平均值； M内 检材样品中内标物添加量，单位为微克(g)； A内 检材样品衍生液中内标物峰面积平均值； M样 检材样品的取样量，单位为毫升(mL)。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（3）计算相对相差： %10021=XXXRD . (3) 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 GA/T 6 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 气相色谱法评价，在相同条件下进行样品测定时，在色谱柱 1 和色谱柱 2 分析条件下，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与基质标准溶液衍生液一致（相对误差在1%之内） ，且空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。必要时可通过 GC-MS 进行阳性结果确证。 气相色谱-质谱法评价，在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与基质标准溶液衍生液一致（相对误差在 1%之内） ，且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3 个）与基质标准溶液衍生液一致，特征离子丰度比与浓度接近的基质标准溶液衍生液相比，相对偏差不超过表 1 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 1 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 8.1.2 阴性结果评价 气相色谱法评价，在相同条件下进行样品测定时，在色谱柱 1 或色谱柱 2 分析条件下，检材样品中未出现与基质标准溶液衍生液保留时间一致的色谱峰， 且在色谱柱 1 和色谱柱 2 分析条件下， 添加样品中均出现与基质标准溶液衍生液保留时间一致的色谱峰， 空白样品无干扰， 则可判断检材样品中未检出目标物。 气相色谱-质谱法评价，检材样品中未出现与目标物一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 本方法的检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。 百草枯衍生化反应原理及相关谱图参见附录 A，中毒诊断参考资料参见附录 B。GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 百草枯衍生化反应原理及相关谱图 A.1 本方法血液的检出限为0.2g/mL，尿液的检出限为0.1g/mL。 A.2 百草枯与硼氢化钠还原反应原理见图A.1。 H3CNNCH3NaOHNaBH4+H3CNNCH3 (1) 或： H3CNNCH3NaOHNaBH4+H3CNNCH3 (2) 图A.1 百草枯与硼氢化钠的反应式 A.3 百草枯及乙基百草枯衍生物的相关质谱图及化合物结构式见图A.2图A.6。 NNCH3CH3 百草枯 NNCH3CH3 NNCH3H3C 百草枯衍生物（1） 百草枯衍生物（2） NNC2H5C2H5 NNC2H5C2H5 乙基百草枯衍生物（1） 乙基百草枯衍生物（2） GA/T 8 说明： 色谱峰1-百草枯衍生物（1）； 色谱峰2-乙基百草枯衍生物（1）； 色谱峰3-百草枯衍生物（2）； 色谱峰4-乙基百草枯衍生物（2）。 图A.2 百草枯衍生物和乙基百草枯衍生物的总离子流色谱图 zt0901-2 #926RT: 6.15AV: 1SB: 2 6.13 , 6.15NL: 1.76E7T: 0,0 + c EI Full ms 45.00-500.0050100150200250300350400450m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance9614812294134917013519212097149811606519158162193177253223231266313280328 339287401386351371411431453467493 图A.3 百草枯衍生物1的一级质谱图 zt0902-3 #713 RT: 5.42AV: 1 SB: 2 6.14 , 6.16NL: 8.19E7T: 0,0 + c EI Full ms 45.00-500.0050100150200250300350400450m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance967015012272941361511621947910813758821796553195206 222341267 281401240328297313357376478451422250464429485 图A.4 百草枯衍生物2的一级质谱图 GA/T 9 zt0901-2 #1219 RT: 7.14 AV: 1 SB: 2 6.13 , 6.15 NL: 3.73E7T: 0,0 + c EI Full ms 45.00-500.0050100150200250300350400450m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance1101621361089556111589114982220971631231907221955179205221239 247 267281313341373429294324352390415455475 489401442499 图A.5 乙基百草枯衍生物1的一级质谱图 zt0902-3 #1014 RT: 6.45 AV: 1 SB: 2 6.14 , 6.16 NL: 4.60E7T: 0,0 + c EI Full ms 45.00-500.0050100150200250300350400450m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance110841641368658176150108111792221515312272177 19320767223441233 250281264400308427325371295331409356391481461489 图A.6 乙基百草枯衍生物2的一级质谱图 GA/T 10 A A 附 录 B （资料性附录） 百草枯中毒诊断参考资料 B.1 理化性质 百草枯（又名见绿杀），是季铵盐类除草剂，纯品为白色结晶，易溶于水，微溶于乙醇、丙酮，不溶于烃类。市售百草枯多为其二氯盐、双硫酸甲酯盐的绿色水溶剂，浓度以 20%和 2.5%水剂较为常见。 B.2 中毒症状 百草枯对人、畜毒性大，口服后2h以内出现血浓度高峰，胃肠道吸收比例少。通过胃肠道、呼吸道及皮肤粘膜吸收的百草枯，经电子传递而产生氧化物离子，这种离子与脂肪作用形成脂肪酸过氧化物，它能破坏肺泡表面活性物质，抑制肺泡扩张，导致肺萎缩，肺部永久性损伤。 人口服百草枯后可引起口腔溃疡、食道炎、胃炎等，出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肌肉震颤、惊厥等症状，严重时可引起中毒性肾病、肺水肿和中毒性心肌炎。消化道吸收（4896）h后有蛋白尿、血尿及脓尿。该药可引起皮炎、 损坏指甲、 刺激眼睛。人吸收后鼻孔会出血。根据口服百草枯量的多少，中毒者可于摄入后24h至（34）周内死亡。 B.3 百草枯尸检所见 尸检可见两侧瞳孔散大，直径0.5cm，各脏器充血，尤其以肺部出现明显的充血和水肿，肠及小肠的上、中部含有红褐色泡沫样液体。肝有广泛性点状出血，肾盂周围可见出血点，心脏充血。 B.4 百草枯的中毒浓度 人中毒多发生于口服较多量的百草枯水剂，口服百草枯量20mg/kg40mg/kg可引起慢性中毒，口服量超过40mg/kg可于数小时内死亡，也有的延后于数日内死亡。通常2g/mL以上的血浓度就会致命。一般百草枯中毒后可救治， 但于数周后死亡的案例中血液中不能检出百草枯， 此时从脏器中检出百草枯能很好地证明百草枯中毒，所以血浓度与死亡的关系不易确定。吸收百草枯后48h内，有90%以原体形式由尿排出。 _