圆二色谱原理与应用.pptx

圆二色谱圆二色谱Circular Dichroism (CD)原理与应用光的性质：波粒二象性诞生光的性质：波粒二象性诞生 人类对光的研究起源很早，但对光本质的认识经历了一个较漫长的过程。光究竟是波还是粒子？光的波动说与微粒说之争从十七世纪初开始，其间牛顿、惠更斯、托马斯杨、菲涅耳、爱因斯坦、波尔等多位著名的科学家努力揭开了遮盖在“光的本质”外面那层扑朔迷离的面纱，至二十世纪初以光的波粒 二象性告终，前后共三百多年的时间。粒子性：光是某种粒子即光量子，具有粒子的性质 如 反射，散射等现象。波动性：即光具有波动性，有衍射、干涉等性质墨子和他的学生做了世界上最早的“小孔成像”实验，并对实验结果作出了光沿直线传播的科学解释，并用此原理解释了物体和投影的关系。爱因斯坦提出了光量子论，解释了光电现象，揭示了微观客体的波粒二重性 光源发射光量子从演示中可以看出：光源发射的单个光量子的运动轨迹是一个轨迹为余弦 函数的简谐振动 轨迹方程为 xAcos（t）而真实光源向外发射的是连续的光量子 如图所示:图中不同颜色的小球代表不同的光量子 所有光量子在一个平面上我们称之为平面偏振光 它的轨迹方程为xAcos（t）公式中 A为振幅与光强度的平方成正比 为初始相位 t为时间我们平时看到的光为自然光具有我们平时看到的光为自然光具有:1.方向随机性方向随机性 自然光源向外发射方向性是随机的光量子 2.不连续性不连续性 会产生无数初始相位不同的光量子 糖葫芦z 传播方向传播方向 360度旋转的轨迹度旋转的轨迹这两个性质决定自然光具有如图所示的性质,既自然光可以看作圆柱形向前传播的光两束光的合成两束光的合成:物理力学力的矢量合成:F1F3F2物体受到的两个力F1,F2等同于物体受到这两个力的矢量合成F3光的合成也遵循矢量合成光的合成也遵循矢量合成:其合成为电场矢量的合成与光强度的平方成正比xytt1t0 t1 t2 t3 t4t0t2t3t4合成平面偏振光图相互垂直的片面偏振光2-1=0取 t0,t1,t2,t3,t4时间的 截面2-1=pi/2 AX=AY pi=3.141592圆偏振光x=AXcos(Wt+1)y=AYcos(Wt+2)xy如果AX=AY合成轨迹为圆如果AX=AY合成轨迹为椭圆垂直传播方向下面我们研究以下两束圆偏振光的合成下面我们研究以下两束圆偏振光的合成:两束旋转方向相反的圆偏振光如果振幅相同（振幅与光强度的平方成正比）矢量合成为平面偏振光。如果振幅不等则根据公式合成为下图右图所示的椭圆偏振光！圆二色性圆二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶轴垂直晶轴电气石晶体当自然光入射到电气石晶片的时,晶片强烈地吸收振动平面与晶轴垂直的光波,而只允许振动平面平行与晶轴的光波通过,因此通过晶片的光就变为具有一定平面的偏振光.各向异性的物质对不同方向的光吸收不同如图所示：平面不对称的分子具有各向异性 如氨基酸核酸、手性分子 也对偏振光有调节活性当两束圆偏振光照射到含有这类分子的溶液时:sample solution溶液对左旋和右旋的圆偏振光的吸收不同这会导致EL不等于ER根据我们前面对振幅不同的两束圆偏正光的叠加现象可以判断透过样品溶液的光变为一束椭圆偏振光当溶液中的样品的结构不同,或成分不同我们可以得到不同的椭圆反过来我们可以通过检测两束旋转方向相反的圆偏振光透过样品所产生的椭圆的不同来判断样品所含的成分,和结构信息。泰勒一阶展开式in proper units(CD spectroscopists use decimol)Per residue2)为了方便比较我们用来描述椭圆的信息度圆二机器测量值光谱学家一般采用摩尔椭圆率 和 Deltaepslon大家形成统 一的单位易于比较tan(i0)n2/n1 时i0 被称为布鲁斯特角 此时的反射光为平面偏振光，利用该原理可制造起偏器。n1折射率n2折射率i0平面偏振光折射：折射：双折射：双折射：o-raye-ray当一束光经过各向异性的晶体或其他状态的介质时产生相互垂直的两束偏振光 o,e当光离开晶体时的2-1=2*pi*l/(n0-ne)*入 四分之一波片四分之一波片 如果l=入/4/(n0-ne)则2-1=pi/2 此时如果入射光与光轴夹角为45度 时o,e的振幅相同则o,e合成的为圆偏振光.45deg45deg光轴光轴偏振光的产生:圆二色谱仪器刨面图M为镜子,p为起偏器 ls代表等和水晶CD特点测量的非常小CD测量的为2.32*(AL-AR)弧度以样品有圆二信号一定要有紫外吸收但有紫外吸收不一定由远而信号CD谱在蛋白质研究中的应用谱在蛋白质研究中的应用The peptide bond is inherently asymmetric&is always optically active蛋白质分子的固有不对称性决定了蛋白质的光学活性蛋白质的结构的不同表现出其对圆二色性特征的差异所以我们可以通过圆二信号来测量蛋白质的结构信息图为一些蛋白的(或肽)的标准园二谱图我们以肌红蛋白为例 193nm208nm223nm我们从图中看到了193,208,223特征峰与上一图中全螺旋的蛋白的特征峰基本相同我们可以从这个信息断定我们样品的结构主要为螺旋结构当我们得到一个图谱可以通过下表来和前面提到的标准图谱来判断我们样品的结构信息对于螺旋性较高的蛋白可以通过下式初步估算螺旋的含量:但是准确性较差不推荐 chymotrypsin(all)lysozyme(+)triosephosphate isomerase(/)myoglobin(all)但一般蛋白的结构信息是较复杂的并非标准的螺旋或折叠之类的结构 对于这些蛋白结构的分析我们要选择合适的软件和算法进行分析CD谱的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法谱的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.180nm260nmHelixa+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.sheetb+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.c=测量的样品谱v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.Random coila/(a+b+c)=螺旋含量b/(a+b+c)=折叠含量c/(a+b+c)=无规卷曲含量通过最最小二乘法求解出最优a,b,c的值Recommended MethodsFor determination of globular protein conformation in solution:SELCON,CDNN and K2D.For determination of polypeptide conformation:LINCOMB with a suitable polypeptide set of references.For determining the effects of mutation s,ligands and perturbants on protein structure:LINCOMB.For evaluating the number of folding states giving rise to a set of spectra:The CCA algorithm and SVD.The Protein Circular Dichroism DataBank(PCDDB)http:/pcddb.cryst.bbk.ac.uk/On Line Circular Dichroism Analysis http:/public-1.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cca分析 http:/www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform061122-5lyxPGDxoLsM6-00园二二级结构分析相关文献http:/lamar.colostate.edu/sreeram/PDF/index.html下载软件分析:http:/www2.umdnj.edu/cdrwjweb/#InstructionsCdpro分析:定期更新:SELCON3,CDSSTR,and CONTIN CLUSTERhttp:/lamar.colostate.edu/sreeram/CDPro/从CD谱分析准确性对全、/和变性蛋白质的准确度90-100%对+的准确度为85%对全的准确度为75%Applications of CD in structural biologyDetermination of secondary structure of proteins that cannot be crystallised Investigation of the effect of e.g.drug binding on protein secondary structure Dynamic processes,e.g.protein folding Studies of the effects of environment on protein structure Secondary structure and super-secondary structure of membrane proteins Study of ligand-induced conformational changes Carbohydrate conformation Investigations of protein-protein and protein-nucleic acid interactions Fold recognition CD实验要点仪器操作及参数仪器操作及参数:Nitrogen flushingFlushing the optics with dry nitrogen is a must:Xe lamp has a quartz envelope,so if operated in air itll develop a lot of ozone,harmful for the mirrorsbelow 195nm oxygen will absorb radiation氮气流量15-20 for 180nm 20 for 95%所用试剂尽量用光谱纯 要确定蛋白的分子量和浓度 防止气泡干扰 超声波除气泡 防止粒子的散射 使用0.02um滤膜对过滤样品Protein Concentration:0.2 mg/mlCell Path Length:5 mmVolume 200 ml Stabilizers(Metal ions,etc.):minimumBuffer Concentration:5 mM or as low as possible while maintaining protein stability scan speed 100nm/min responce 4sec band width 2