T∕CVMA 12-2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 R∕T-PCR 检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 122018 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR 检测方法 Real-Time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：周智、王传彬、杨林、吴佳俊、宋晓晖、翟新验、倪建强、刘玉良、张硕、刘颖昳、赵柏林、顾小雪、曲萍。 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR诊断技术、鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR诊断技术。 本标准主要用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 25172 猪常温精液生产与保育技术规范 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行 3 试剂与耗材 3.1 RNA 提取试剂 RNA提取试剂详见附录A，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 3.2 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5 U/L），PrimeScriptTM RT Mix反转录酶混合物，50 ROX Reference Dye, 2 One Step RT-PCR Buffer缓冲液， 无水乙醇，无菌无核酸酶水，生理盐水。 3.3 引物探针 3.3.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 引物和探针，见表 1。 表1 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 引物和探针序列 名称 序列（5-3 ） 美洲型上游引物（NAF） TGGARATTCATCACCTCCAGR 美洲型下游引物（NAR） GTGCCGTTRACCGTAGTGGA 欧洲型上游引物（EUF） ACTTCCAGATGCAGATTGTGT 欧洲型下游引物（EUR） GCCGTTCACTGATGTTAGTCC 探针 FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ 注：将表中引物和探针用无菌无核酸酶水稀释至10 pmol/ L后使用。 3.3.2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR 引物和探针,见表 2。 表2 美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光 RT-PCR 引物和探针序列 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 2 名称 序列（5-3 ） 美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF） CGCCAGCCAGTCAATCARC 美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR） GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG 欧洲型探针 FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ 美洲型探针 HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ 注：将表中引物和探针用无核酸酶的灭菌蒸馏水稀释至10 pmol/ L后使用。 4 仪器与设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨器、-20冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品采集 组织样品采集按照NY/T 541进行。 取病死猪肺脏、 淋巴结、 扁桃体等组织； 待检活猪， 采集血液3 mL5 mL，也可采取扁桃体样品。 5.1.2 公猪精液采集 公猪精液采集按照GB/T 25172的方法进行。 5.2 样品的处理 5.2.1 组织样品处理 每份组织分别从三个不同的典型病变位置处称取样品约1 g，剪碎混匀后取0.02 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，6 000 g离心2 min，吸取上清液到新的离心管备用。 5.2.2 血液样品处理 将采集的血液室温或者37 倾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的离心管备用。 5.2.3 精液样品处理 精液样品无需处理，直接用于核酸提取。 5.2.4 阳性对照样品处理 取美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性组织研磨上清液各100 L (病毒含量105.0 TCID50/mL)，用于病毒RNA提取。 5.2.5 阴性对照样品处理 取猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性组织研磨上清液100 L，用于病毒RNA提取。 5.3 病毒 RNA 提取 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 3 5.3.1 若选用附录 A 中所列试剂提取病毒 RNA，则参照以下步骤进行操作： a) 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照各 100 L，分别加入裂解液 600 L，充分颠倒混匀，室温静置 3 min5 min。 b) 将液体吸入吸附柱中，10 000 g 离心 30 s。 c) 弃去收集管中液体，加入 600 L 洗涤液，10 000 g 离心 30 s。 d) 重复步骤 c)。 e) 弃去收集管中液体，10 000 g 离心 2 min，以除去残留的洗涤液。 f) 将吸附柱移入新的离心管中， 向柱中央加入洗脱液 50 L， 室温静置 1 min， 10 000 g 离心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。 5.3.2 若使用病毒 RNA 试剂盒提取病毒 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。 5.4 实时荧光 RT-PCR 扩增方法 5.4.1 按照表 3 配制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系。 表3 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系 试剂 体积 无菌无核酸酶水 4.3 L 美洲型上游引物（10 pmol/ L） 0.9 L 美洲型下游引物（10 pmol/ L） 0.9 L 欧洲型上游引物（10 pmol/ L） 0.9 L 欧洲型下游引物（10 pmol/ L） 0.9 L 探针（10 pmol/ L） 0.6 L 2 One Step RT-PCR BufferIII 缓冲液 12.5 L Taq DNA 聚合酶(5 L) 0.5 L PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5 L 50 ROX Reference Dye 0.5 L RNA 模板 2.5 L 总体积 25.0 L 将表3中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后， 充分混匀， 做好标记。 猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）通用型实时荧光RT-PCR扩增所用荧光报告基团为FAM， 淬灭基团为BHQ或None。 在荧光PCR仪上按表4所示程序进行扩增反应。 表4 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通用型实时荧光 RT-PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 5 min 1 2 95 10 s 1 3 95 5 s 40 4 60 35 s 注：在每个循环第二步（60 35 s）收集荧光信号。 5.4.2 按照表 5 配制鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系。 表5 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增反应体系 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 4 试剂 体积 无菌无核酸酶水 5.5 L 美洲型探针（10 pmol/ L） 0.5 L 欧洲型探针（10 pmol/ L） 0.5 L 美洲型和欧洲型上游引物（NAF-EUF） （10 pmol/ L） 1 L 美洲型和欧洲型下游引物（NAR-EUR） （10 pmol/ L） 1 L 2 One Step RT-PCR BufferIII 缓冲液 12.5 L Taq DNA 聚合酶(5 L) 0.5 L PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5 L 50ROX Reference Dye 0.5 L RNA 模板 2.5 L 总体积 25.0 L 将表5中所有试剂加入荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为FAM， 扩增美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光报告基团为HEX， 淬灭基团均为BHQ或None（如果仪器未经HEX校正过，可用VIC代替）。在荧光PCR仪上按表6所示程序进行扩增反应。 表6 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 5 min 1 2 95 10 s 1 3 95 5 s 40 4 60 35 s 注：在每个循环第二步（60 35 s）收集荧光信号。 6 结果判定 6.1 阈值设定 阈值线设定于阴性对照扩增曲线的最高点。 6.2 结果判定 6.2.1 通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 结果判定 6.2.1.1 美洲型或欧洲型阳性对照 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线， 阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录 B.1。 6.2.1.2 被检样品 FAM 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为 PRRSV 阳性。 6.2.1.3 被检样品 30Ct 值37 并出现特定的扩增曲线， 需重新取样提取 RNA， 扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。 6.2.1.4 被检样品 Ct 值37 时，判定为阴性。 6.2.1.5 对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。 6.2.2 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征实时荧光 RT-PCR 结果判定 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 5 6.2.2.1 美洲型和欧洲型阳性对照 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线， 阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成立，否则实验结果不成立，实例可参考附录 B.2。 6.2.2.2 被检样品若 FAM 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为欧洲型 PRRSV 阳性；被检样品若Hex 荧光信号 Ct 值30 并出现特定的扩增曲线为美洲型 PRRSV 阳性。 6.2.2.3 被检样品 30Ct 值35 并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后结果判定仍是可疑的，可判定为阳性。 6.2.2.4 被检样品 Ct 值35 时，判定为阴性。 6.2.2.5对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 6 A A 附 录 A （规范性附录） RNA 提取液的配制 A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液（pH值 8.0） EDTA 18.61 g 灭菌纯化水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌纯化水 加至100 mL A.2 裂解液 异硫氰酸胍 236.4 g 氯化钠 23.2 g 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（ pH值8.0 ） 40 mL 灭菌双蒸水 加至2 000 mL A.3 洗涤液 磷酸氢二钠 143.2 g 磷酸二氢钾 62.4 g 氯化钠 18 g 无水乙醇 6 000 mL 灭菌双蒸水 加至8 000 mL A.4 洗脱液 磷酸氢二钠 143.2 g， 磷酸二氢钾 62.4 g 灭菌双蒸水 加至2 000 mL A.5 吸附柱和收集管 吸附柱的离心柱层析膜材质为硅基质膜，厚度0.28 cm；吸附柱的装量为800 L/个。 中国兽医协会CVMAT/CVMA 122018 7 B B 附 录 B （资料性附录） 实时荧光 RT-PCR 扩增实例参照 B.1 通用型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增实例参照 B.2 鉴别美洲型和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒双重实时荧光RT-PCR扩增实例参照 _ 中国兽医协会CVMA