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乳酸菌在肉品保鲜中的应用

摘 要
利用乳酸球菌发酵液处理冷却猪肉，结合不同的气调包装，通过测定其在冷藏过程中的微生物指标、理化指标和感官评定以及贮存末期的菌相分析和生物胺含量等来考察其对冷却猪肉的保鲜效果。结果显示：冷却猪肉经乳酸球菌发酵液处理后，采用真空包装、气调包装1(CO，和N，)和气调包装2(含有极微量c0、c0。和少量0，)3种不同包装形式，对冷却猪肉的保鲜效果不同。真空包装组汁液流失率高，猪肉色泽呈紫色，感官评分低；气调包装1组的TBA值低，汁液流失率低，但色泽灰白，感官评分也不高；气调包装2组对冷却猪肉的综合保鲜效果最好。产品在冷藏贮存(1±1)℃21 d时，细菌总数的对数值为6．1 5，TVB—N值为1 2．20 mg／1 00 g，TBA值为0．184mg·kg～，汁液流失率控制在3％以下，红度a值为1 9．4 9，此时产品色泽鲜艳，感官评分高(1 8．8 9)。乳酸茵发酵液对冷却猪肉上的致病菌如金黄色葡萄球菌和粪大肠菌群有明显的抑制作用，而对G一茵如假单胞菌属、肠杆菌科等抑制作用不明显。乳酸菌发酵液处理冷却猪肉后，不影响产品的感官特性，贮存末期产品的生物胺含量除腐胺含量较高外，其余均处于较低水平。
关键词：冷却猪肉；乳酸菌发酵液；气调包装；综合保鲜

IV

Abstracts
Lactic acid bacteria is a kind of the umbrella name taking that candy is raw material, main outcome as the lactic acid bacterium, it's significance already arouses broad home and abroad attention. Having that the Lactic acid bacteria produces or the bacterium effect matter bacterium is plain, innocuous, there is no the side effect, the nothing being left over, there is no resistance to drugs, the environment contaminating at the same time neither waits for merit, already becomes the priority that living things food antisepsis studies, and is regarded as the most effective antibiotic substituent. Lactic acid bacteria is in medical treatment, biological control, food, fields such as feed and fermentation also have the broad application prospect.
The BCG medium was used to isolate the single conlony from the cheese in the supermarket. Five kinds of lactic acid bacteria were screened based on the morphological characteristics, and according to the bacteriostatic experiment, GL5 from cheese had the highest bacteriostatic activity. GL5 was homologous with Lactobacillus casei based on the morphological ,physiological characteristics and Bergey's manual of determinative bacteriology.
Key words：Lactic acid bacteria, bactriostasis, indentification

目 录
摘 要............................................................Ⅰ
Abstracts.........................................................Ⅱ
目 录............................................................Ⅲ
第1章 前 言.....................................................1
1.1乳酸菌的生理功能.............................................1
1.2乳酸菌的类型.... ............................................2
1.3乳酸菌的研究历史.............................................2
1.4乳酸菌在食品应用.............................................2
1.5乳酸菌的保鲜.................................................2
第2章 材料与方法...................................................4
2.1 材料........................................................4
2.2 乳酸菌细菌总数的测定............. ..........................5
2.3 挥发性盐基氮................................................4
第3章 结果与分析..................................................9
3.1乳酸菌细菌总数方法与分析.....................................9
3.2挥发性盐基氮的分析与结果.....................................9
第4章 结论........................................................13
4.1实验分析................................................ 13
4.2实验总结....................................................13
致谢............................................ ..................14
参考文献..........................................................15

第1章 前言
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。
1. 1 乳酸菌的生理功能
　　在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、双歧杆菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肝杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。
　　而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。现在，由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的危胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。目前国际上公认的乳酸菌，被认为是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论，乳酸菌=益生菌=长寿菌。
乳酸菌的生理功能[1]具体有：
1、防治有色人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。
2、促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。
3、使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。
4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。
5、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。
6、免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。
7、抗肿瘤、预防癌症作用。
8、提高SOD酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。
9、有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。
1.2 乳酸菌的类型
乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。因为动物源取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。
1.3 乳酸菌的研究历史
　 早在20世纪初，俄国著名的生物学家梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他获得诺贝尔奖的“长寿学说”里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。这个具有划时代意义的“长寿学说”，为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。
　　早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。到目前为止，人类日常食用的泡菜、酸奶、酱油、豆豉等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的随机天然发酵的代谢产物。
1.4 乳酸菌在食品工业应用
乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改善食品的品质和营养，具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异原和增强免疫力等重要生物学功能，在食品中被广泛应用。
1.5 乳酸菌的保鲜
乳酸菌是一类能以糖为原料，发酵产生大量乳酸的细菌通称。乳酸菌是正常人畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着人畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡作用。而且，乳酸菌能够产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抑菌物质。这些抑菌物质不仅不破坏食品的风味和组织状态，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。乳酸菌产生的细菌素以其对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
由于乳酸菌来源于食品,其无毒副作用、无残留、无抗药性等优点受到人们的关注。乳酸菌在发酵过程中可以产生一系列物质,能够抑制或杀死一些食物腐败菌,其中起主要抑菌作用的是细菌素,其具有一定的热稳定性,易被人体消化道的部分蛋白酶降解,并且不会在体内积蓄引起不良反应。因此，乳酸菌制剂作为一种天然防腐保鲜剂，有着广阔的市场前景。

第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
市售新鲜猪肉
2.1.2 实验试剂
1、0.1 mol／L盐酸标准溶液（无水碳酸钠标定）：吸取分析纯盐酸8.3mL，用蒸馏水定容至1000mL。
2、0.01 mol/L盐酸标准溶液：用0.1mol/L盐酸标准溶液稀释获得。
3、2%硼酸溶液：分析纯硼酸2g溶于100mL水配成2%溶液。
4、混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。
5、1%氧化镁溶液；化学纯氧化镁1.0g溶于100mL蒸馏水振接成混悬液。
2.1.3 试剂
溴甲酚绿——上海试剂厂；
培养皿——上海五一玻璃仪器厂；
定性滤纸——杭州特种纸业有限公司；
牛肉膏——上海蓝季科技发展有限公司；
托盘天平——上海光正医疗仪器有限公司；
蛋白胨——南通东海龙生生物制品有限公司；
真空宝——中山市太力家庭用品制造有限公司；
轻质氧化镁——上海统亚化工科技发展有限公司；
亚甲基蓝——中国医疗（集团）上海化学试剂公司；
硼酸、氯化钠——江苏强盛功能化学股份有限公司；
琼脂粉、乳糖、猪胆盐、甲基红——上海润捷化学试剂有限公司；
伊红美蓝色（EMB）琼脂——上海中科昆虫生物技术开发有限公司。
2.1.4 仪器和设备
实验室用样品粉碎机或研钵；
分析天平：感量0.001g；
凯氏蒸馏装置：半微量水蒸汽蒸馏式；
微量滴定管：最小分度0.01ml；
锥形瓶：150ml、250mL具塞；
容量瓶：100mL、 1000mL；
其他器材：烧杯、玻璃棒、吸量管、洗耳球、胶头滴管、涂布棒、试管等。
2.2乳酸菌细菌总数的测定
2.2.1 乳酸菌细菌总数测定的方法
测定方法：平皿计数法
2.2.2 实验测定的原理
细菌总数是指试样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1mL试样所含菌落的总数。
2.2.3 实验测定的步骤
1、将所用玻璃器具洗净、烘干，然后包扎，包扎试管前，每根试管装入蒸馏水9mL，再放高压蒸汽灭菌锅内灭菌30分钟。器具灭菌的同时把超净台的紫外灯开启。
2、在灭菌时准备试样：称取两份1g鸦片鱼，其中一份放上清液中浸泡一分钟。
3、灭菌完后，紫外灯关闭，将所用东西拿进超净台放好。然后自然风干，等待备用。
4、点燃酒精灯，用酒精棉球擦手。
5、将样品与空白放两个研砵中，分别加9mL无菌水，研碎后用滤纸进行过滤。此为第一梯度。
6、以无菌操作方法用灭菌移液管吸取1mL试样上清液，注入另一试管中，并摇匀，使水样与上清液充分混匀，此为第二梯度。然后从中吸取1mL，注入下一试管，摇匀，此为第三梯度。分别两次吸取1mL，一次倾注平板中，作上标记，一次注入下一试管中，摇匀，此为第四梯度。
7、用空白试样作同上步骤，作好标记。所做梯度同样为2、3、4。
8、等培养基温度适宜时，迅速将每个平板中倒入适量培养基，摇平。
9、待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1℃培养箱内培养24~48h，进行菌落计数。
2.2.3 菌数计算的方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
首先选择平均菌落数在30~300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之；若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间，则视二者之比值来决定；若其比值小于2应报告两者的平均数。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数；若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数；若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有稀释度的均无菌落生长，则以<1乘以稀释倍数报告之；菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。
2.3挥发性盐基氮
2.3.1 挥发性盐基氮概述
关于挥发性盐基总氮的概念挥发性盐基总氮是指肉食品的水浸液中在碱性条件下能与水蒸气一起蒸馏出来的总氮量(t。tazv。zatilebasienitr。gen即TvB-N)。
之所以称为盐基氮，是因为肉食品中的蛋白质在酶和细菌的作用下，发生分解而产生氨(NH-)和胺（R一NH:)等碱性含氮物。以_L所产生的胺或氨类碱性产物，可以和组织内的酸性物质结合，形成NH、·R即盐基态氮，故称盐基氮。
目前挥发性盐基氮（TVB-N)值是国标中用于评价肉质鲜度的唯一理化指标。
微生物的代谢，可引起食品化学组成的变化，并产生多种腐败性产物，因此，直接测定这些腐败产物就可作为判断食品质量的依据。
挥发性盐基总氮系指肉、鱼类样品浸液在弱碱性下能与水蒸汽一起蒸馏出来的总氮量，主要是氨和胺类（三甲胺和二甲胺）,常用蒸馏法或Conway微量扩散法定量。例如一般在低温有氧条件下，鱼类挥发性盐基氮的量达到30mg／100g时，即认为是变质的标志。
2.3.2 实验原理
利用弱碱性试剂氧化镁使试样中碱性含氮物质游离而被蒸馏出来，用硼酸吸收，再用标准酸滴定，计算出含氮量。
2.3.3 实验试剂的配置
1、 0.lmol／L盐酸标准溶液（无水碳酸钠标定）：吸取分析纯盐酸8.3mL，用蒸馏水定容至1000mL。
2、0.01mol/L盐酸标准溶液：用0.1mol/L盐酸标准溶液稀释获得。
3、2%硼酸溶液：分析纯硼酸2g溶于100mL水配成2%溶液。
4、混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。
5、1%氧化镁溶液；化学纯氧化镁1.0g溶于100mL蒸馏水振接成混悬液。
2.3.4 实验步骤
1、称取1～5g试样(精确到0.001g)于250mL具塞锥形瓶中，加蒸馏水100mL，振荡摇匀30min后静置，上清液为样液。
2、取20mL2%的硼酸溶液于150mL锥形瓶中，加混合指示剂2滴，使半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入此溶液。
3、蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此溶液为橙红色，否则补加硫酸。
4、准确移取10mL样液注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL%的氧化镁溶液，小心提起玻璃塞使流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水封好，防止漏气，蒸馏10min，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
5、吸收氨后的吸收液立即用0.01mol/L盐酸标准液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点，同时进行试剂空白测定。
2.3.5 测定结果计算
1、计算见下式：
X1=[(V1-V2)xC1x14 /( M1xV’/V)]x100
式中：X1：样品挥发性盐基氮的含量，mg/100g；
V1：滴定试样时所需盐酸标准溶液体积，mL；
V2：滴定空白时所需盐酸标准溶液体积，mL；
C1：盐酸标准溶液浓度，mol/L；
M1：试样重量，g；
V’：试样分解液蒸馏用体积，mL；
V ：样液总体积，mL；
14：与1.00mL盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=1.000mol/L]相当的氮的质量，mg。
2、重复性：
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。允许相对偏差为5%。

第3章 结果与分析
3.1 乳酸菌细菌总数方法与分析
3.1.1 平板菌落计数法
最常用的活菌计数法：将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。利用弱碱性试剂氧化镁使试样中碱性含氮物质游离而被蒸馏出来，用硼酸吸收，再用标准酸滴定，计算出含氮量。
技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；
注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；
适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，
误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。
3.1.2 稀释度选择及菌落总数报告方式
表3-1-2稀释度选择及菌落总数报告方式
例次
稀释液及菌落数
两稀释
液之比
菌落总数
报告方式
[cfu/g]
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20

16400
16000或1.6×104
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
600
350
313

313000
310000或3.1×105
5
27
11
5

270
270或2.7×102
6
0
0
0

＜1×10
＜10
7
多不可计
305
12

30500
31000或3.1×104

3.1.3 乳酸菌细菌总数记录
表3-1-2 第一次实验

浸泡
空白
梯度2
一个直径4mm和两个直径1mm的菌落
二个直径2mm的菌落
梯度3
一个直径6mm和两个个直径3mm的菌落
一个直径3mm、一个直径2mm
梯度4
一个直径8mm和一个直径4mm的菌落
两个直径3mm、一个直径2mm
表3-1-2 第二次实验

浸泡
空白
梯度2
一个直径5mm和一个直径2mm的菌落
一个2mm直径的菌落
梯度3
一个直径6mm和一个直径2mm的菌落
一个1mm、一个2mm
梯度4
一个直径7mm和一个直径3mm的菌落
两个2mm直径的菌落

表3-1-2 第三次实验

浸泡
空白
梯度2
未长菌
未长菌
梯度3
未长菌
未长菌
梯度4
未长菌
未长菌

3.2 挥发性盐基氮的分析与结果
3.2.1 实验数据
盐酸标准溶液浓度：0.01mol/L、硼酸溶液浓度2.011%、甲基红0.1%乙醇溶液、溴甲酚绿0.5%乙醇溶液、氧化镁溶液浓度1.008%
(1)试样重量，5.012g、(2)5.021g、(3)5.025g
滴定试样时所需盐酸标准溶液体积，1.32mL、0.460mL、0.462mL
滴定空白时所需盐酸标准溶液体积，0.912mL、0.232mL、0.288mL
3.2.2数据处理
样品挥发性盐基氮的含量：
(1) X1=[(V1-V2)xC1x14 /( M1xV’/V)]x100
=[(1.321-0.92)x0.01x14 /( 5.021x10/100)]x100
=11.42(mg/100g)

(2) X1=[(V1-V2)xC1x14 /( M1xV’/V)]x100
=[(0.460-0.232)x0.01x14 /( 5.012x10/100)]x100
= 6.35(mg/100g)

(3) X1=[(V1-V2)xC1x14 /( M1xV’/V)]x100
=[(0.462-0.288)x0.01x14 /( 5.025x10/100)]x100
= 4.85(mg/100g)
3.2.3实验结果
三次实验，样品挥发性盐基氮的含量结果分别是11.05 (mg/100g)、6.45(mg/100g)、4.85(mg/100g)，均小于30mg/100g，所以样品都没变质。

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第4章 结论
4.1实验分析
本试验冷却猪肉经乳酸菌发酵液处理后，放入到真空包里袋抽成真空；同时把相同的冷却猪肉也放到相同的真空也抽成真空作对比。刚放进去的都成鲜红色，冷却猪肉经乳酸菌发酵液处理后在冷藏过程中，就像发酵食品一样，通过竞争性的抑制，产生不同的抑菌物质，包括乳酸、其它小分子物质(氢过氧化物、乙醇、C 0。、丁二酮、苯甲酸等)，从而防止食品腐败，保证食品安全[引。和化学防腐不同，生物防腐并不是简单地将乳酸菌培养物添加到食品中去起防腐作用，而是一个动态的过程。经过一段时间，无论从微生物和理化指标，还是从感官指标方面会发现被乳酸菌浸泡过的冷却猪肉都超过没过浸泡过的。
4.2 实验总结
乳酸菌能够产生的细菌素等抑菌物质，不仅不会破坏水产品的风味和组织状态，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长猪肉的保藏期。

致谢

参考文献
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