Loop B3对GH7内切纤维素酶功能的影响机制.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):281-291收稿日期：20230406基金项目：国家自然科学基金项目（32171869，31770110）作者简介：杨俊钊，女，硕士研究生，研究方向：资源环境微生物学；Email:YJZ通讯作者：郑菲，女，博士，讲师，研究方向：微生物代谢与酶工程；Email:糖 苷 水 解 酶 第 七 家 族 纤 维 素 酶（glycoside Hydrolases family 7,GH7）在天然生物质转化和降解中具有重要作用，因此一直是许多研究的热点。在 GH7 中，主要包含外切纤维素酶和内切纤维素Loop B3 对 GH7 内切纤维素酶功能的影响机制杨俊钊 张新蕊 孙清扬 郑菲（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）摘 要：糖苷水解酶第七家族（GH7）包含内切和外切两类纤维素酶，其中对外切纤维素酶的研究较为成熟，但对内切纤维素酶的研究相对较少。本研究从嗜热真菌 Myceliophthora thermophila 的基因组中鉴定出一个新型 GH7 内切纤维素酶 MtCel7b，其在 60，pH 5.0 时表现出最佳酶活力。在 90孵育 1 h 后，MtCel7b 仍能保留 40%以上的活性。经过序列统计分析发现，MtCel7b loop B3存在长链型和短链型的进化差异，为了探究loop B3对内切纤维素酶结构和功能的影响，将MtCel7b的长链型loop B3进行截短，构建了 B3cut突变体。结果显示，B3cut突变体在高温下的稳定性较野生型提高了约 9%-44%，而其对 3 种纤维素底物的比活性降低了 34%-74%。借助分子动力学模拟进一步分析显示，在突变体 B3cut中，其 loop B3 的截短导致催化裂隙两端的 loop A3 和 loop B1发生了显著位移，缩小了催化口袋的空间结构，加强了催化位点周围的氢键作用网络，从而导致酶在高温下更加稳定。本研究阐明了 loop B3 在 GH7 内切纤维素酶中的重要作用，为酶分子的改良工作提供了新的参考。关键词：GH7；内切纤维素酶；loop B3；嗜热；分子动力学模拟DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230307Affecting Mechanism of Loop B3 on the Function of GH7 EndoglucanaseYANG Junzhao ZHANG Xinrui SUN Qingyang ZHENG Fei（College of Biological Sciences,Beijing Forestry University,Beijing 100083）Abstract:Glycoside hydrolase family 7（GH7）contains two kinds of cellulases,cellobiohydrolase and endoglucanase,of which the study of cellobiohydrolase is more mature,however few studies on endoglucanase.A thermophilic endoglucanase of GH7 from the genome of the M.thermophila,MtCel7b,was identified and characterized with the maximum activity at 60,pH 5.0.After 1 h incubation at 90,MtCel7b retained over 40%activity.The loop B3 of MtCel7b,can be divided into short and longchains based on amino acid sequence comparison.In order to explore the effect of loop B3 on the structure and function of,endoglucanase,the mutant B3cut was formed by truncating 14 amino acids on longchain B3 loop of MtCel7b.At high temperatures,the activity of B3cut was 9%-44%higher than that of MtCel7b;however,the hydrolysis ability of B3cut to different substrates was reduced by 34%-74%.Additional analysis with the assistance of molecular dynamics simulations demonstrated that in the mutant B3cut,the truncation of its B3 loop led to a significant displacement of loop A3 and loop B1 at both ends of the catalytic cleft,narrowing the spatial structure of the catalytic pocket and strengthening the network of hydrogen bonding interactions around the catalytic site,resulting in a more stable enzyme at high temperatures.This study sheds light on the role of loop B3 in GH7 endoglucanase and provides insight into the improvement of the enzyme molecule.Keywords:GH7;endoglucanase;loop B3;thermostability;molecular dynamics simulation生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10282酶两大类，其中，内切纤维素酶全部来自真菌，作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解分子内部的-1,4 糖苷键，将长链纤维素分子切割成短链1；外切纤维素酶作用于纤维素链的还原/非还原性末端，将短链的纤维素分子切成纤维二糖2。目前，对 GH7 的研究主要集中在外切纤维素酶方面，而对内切纤维素酶的关注相对较少。CAZymes 数据 库（carbohydrateactive enzymes,CAZymes）已 被收录的具有性质报道的 GH7 内切纤维素酶仅有 27个，大多在 50-60和 pH 4.0-5.0 显示出最大酶活 力3-6。根据 PDB 数据库（protein data bank,PDB）中收录的 5 个 GH7 内切纤维素酶晶体结构 ThCel7B（Trichoderma harzianum CBS 226.95,PDB ID:5W0A）、TrCel7B（Trichoderma reesei,PDB ID:1EG1）、ReCel7B（Rasamsonia emersonii CBS 394.64,PDB ID:6SU8）、FoCel7B（Fusarium oxysporum,PDB ID:1OVW）和 HiCel7B（Humicola insolens,PDB ID:6YOZ）7-11可知，GH7 内切纤维素酶的催化结构域是由 6 个 loop 区（A1、A2、A3、B1、B3 和 B4）围绕反向平行的-折叠形成的-三明治结构12。GH7 内切纤维素酶中共有 9 个底物结合位点（7-+2）13。其中，loop A1 和 B1 位于底物结合位点 7-4 处，loop A3 和 B3 位于催化活性中心附近，loop B4 位于产物出口处11。由于覆盖在催化口袋的loop 较短，尤其是 loop A3 和 loop B3 的长度不能够完全包裹催化中心，使得活性中心更加暴露。研究表明，催化口袋周围的 loop 参与酶的催化、底物结合过程，同时对酶的热稳定性也起着重要作用14。例如，GH12 内切纤维素酶 NfEG12A 具有较长的 loop 3 结构，通过改变 loop 结构的长度，加强了底物和酶之间的氢键相互作用，从而提高了产物分子的转化率15。将 GH5 纤维素酶 GtCel5 loop 6 上的天冬酰胺 Asn 进行饱和突变后，筛选到N233G 突变体的比活值及催化效率较野生型显著提高16。此外，loop 结构对酶的热稳定性也起到重要作用，有研究人员将几丁质酶 BcChiA 的 loopIII 截断后，其 Tm值下降 1017。GH7 外切酶与内切酶的 loop 区具有类似的结构，在 GH7 外切纤维素酶中，loop 结构参与酶的催化过程。研究人员将 TrCel7A与纤维四糖、纤维戊糖和纤维己糖的复合物分别共结晶，观察到 3 个复合物结构中的 loop B3 区均参与底物的结合过程，且在催化过程中显示出较高的柔性18。研究人员通过截断 TrCel7A loop B3 中的8 个残基（245GTYSDNRY252），验证得出酶对结晶纤维素的活性降低了 50%，这表明 loop B3 是 GH7 酶催化的一个重要组成部分19。尽管有部分研究的关注点在 GH7 外切酶的 loop 区上，但对于内切纤维素酶 loop 区的功能仍缺乏相关研究。经分析，在GH7 内切纤维素酶 loop 区中，loop B3 位于催化中心附近11，其氨基酸序列长度可分为两种类型：一类是包含 18 个氨基酸残基的长链型；另一类是包含4 个氨基酸的短链型。据研究显示，大多数耐热性能比较好的 GH7 内切纤维素酶均包含短链型的 loop B3 结构3-5,11。为了探究 loop B3 在 GH7 内切纤维素酶中的影响效果及其机制，本文以嗜热毁丝菌 M.thermophila 来源的 GH7 纤维素酶 MtCel7b 为核心研究材料，通过截短其长链 loop B3 中的 14 个氨基酸残基（216GPYLCEGAECEFDG229），构建 B3cut突变体，并分析比较突变体与野生型之间在酶催化效率及热稳定性方面的差异，为 GH7 内切纤维素酶 loop 区的功能研究提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 基因和载体 Mtcel7b 基因编码序列由北京睿博兴科生物技术有限公司合成；克隆宿主大肠杆菌感受态细胞 Escherichia coli Trans1T1 购自北京全式金生物技术有限公司，用于目的基因的克隆。表达质粒 pPIC9 和表达宿主毕赤酵母 Pichia pastoris GS115 购自美国 Invitrogen 生命技术有限公司，用于表达载体的构建和外源基因的表达。1.1.2 主要试剂与仪器 无缝克隆与重组试剂盒、快速凝胶提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉购自赛默飞世尔科技公司；底物羧甲基纤维素钠（CMCNa）、地衣多糖、大麦葡聚糖购自 SigmaAldrich。琼脂糖购自 Biowest公司、YNB 购自北京兰博利德生物技术有限公司。D无水葡萄糖和琼脂粉均购自博奥拓科技有限公司。PCR 仪，BioRad T100 型梯度 PCR 仪分子扩增2023,39(10)283杨俊钊等：Loop B3 对 GH7 内切纤维素酶功能的影响机制仪；蛋白电泳仪，DYY8C 电脑三恒多用电泳仪；培养箱，一恒 Blue pard 经济型生化培养箱；分子过滤膜包，赛多利斯回旋流切向流超滤器超滤膜包VF20P4；酶标仪，瑞士 Tecan M200 PRO 多功能酶标仪；蛋白纯化仪，KTA Pure；核酸蛋白测定仪，赛默飞 NanoDrop2000 超微量分光光度计。1.2 方法1.2.1 序列与结构分析 使用 ExPASyProtParam tool（https:/web.expasy.org/protparam/）对蛋白的理论分子量和等电点进行分析，使用 SignalP 5.0（http:/www.cbs.dtu.dk/servi Ces/Signa LP/）对蛋白的信号肽进行预 测，利 用 BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool protein）对蛋白序列进行同源性分析，利用Smart（http:/smart.emblheidelberg.de/）对蛋白质的结构域进行预测，利用 AlphaFold2 对蛋白质建模。1.2.2 质粒构建与提取 将目的基因 Mtcel7b 重组至 pPIC9 表达质粒 EcoR I/Not I 克隆位点处，利用热激法转化至 Escherichia coli Trans1T1 细胞中，后涂布于固体 LB 培养基0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化钠（W/V），1.5%琼脂粉（W/V）上，37倒置培养。12 h 后挑取单克隆进行菌落 PCR 验证并送测序，后将测序正确的克隆子接入到液体 LB 培养基0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化钠（W/V）中，在37条件下培养 12 h，然后提取质粒。突变体 B3cut的构建是以 Mtcel7b 为模板，以 MtCel7bF1（5GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC3），MtCel7bR1（5AGGCGAATTAATTCGCGGCCGC3）；B3cutF2（5CTCATCCTTGTTCCAAGGCTGTATGTGATAAGAATGGTTGCGCCTG3），B3cutR2（5CAACCATTCTTATCACATACAGCCTTGGAACAAGGATGAGGAG3）为两组特异性引物进行 PCR 扩增，利用 overlap PCR方法获得突变体基因的全长。PCR 反应程序为：95预变性 3 min；95变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 30 s，30 个循环；72终延伸 5 min；4保存。质粒提取方法同 Mtcel7b。1.2.3 蛋白的表达与纯化 重组质粒 pPIC9Mtcel7b用限制性内切酶 Dra I 线性化处理，经核酸电泳纯化后回收线性化产物，通过电击转化至毕赤酵母GS115 感受态细胞，然后涂布在固体 MD 培养基 1.5%琼脂糖（W/V），2%葡萄糖（W/V），灭菌后加 入 1.34%YNB（W/V），410-4生 物 素（W/V）上。在 30倒置培养 48 h 后，筛选出重组转化子。用牙签随机挑选 48 个克隆子，在固体 MD 平板上点种，并在 30恒温箱内倒置培养 48 h。同时，将牙签挑取的克隆子接种于含有 3 mL BMGY 培养基 1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），1%甘油（W/V），灭菌后加入 1.34%YNB，410-4生物素（W/V）的酵母管中。在 30，200 r/min 培养 48 h后离心去除上清液，菌体用 1 mL BMMY 培养基1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），灭菌后加入 1.34%YNB，410-4生物素，0.5%甲醇（V/V）重悬，诱导培养 48 h 后离心收集上清液。利用 3,5二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活，并用 SDSPAGE检测是否表达出目的蛋白。将筛选出的高活性阳性克隆子接种至 30 mL YPD 液体培养基1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），2%葡萄糖（W/V）中，30，200 r/min 培养 48 h 后，以 0.5%（V/V）的接种量接种至 BMGY 液体培养基中。30，200 r/min培养 48 h 后，收集菌体转移至 BMMY 诱导培养基中，30，200 r/min 继续诱导培养 48 h，每隔 24 h补加一次甲醇0.5%（V/V）。48 h 后收集上清液，利用 10 kD 膜包浓缩至 15 mL 体积后进行脱盐处理，脱盐处理后的酶液加入到平衡后的 HiTrap QXL 阴离子交换层析柱中，在 10 mmol/L 的 pH 8.0 的 TrisHCl缓冲液中，使用 0-1 mol/L NaCl 进行线性梯度洗脱，收集相应的峰所对应的蛋白并进行酶活性的测定和SDSPAGE 分析。1.2.4 酶活力的测定 纤维素酶的酶活性测定采用DNS 法，具体反应体系为 50 L 适当稀释的酶液加入到 450 L 底物中，恒温中反应 10 min，后加入750 L DNS 终止反应，沸水煮 5 min 后立即置于冷水中冷却至室温。从反应体系中吸取 250 L 在 540 nm 下测定吸光值，根据标准曲线计算出相应酶活值，每组实验设置 3 个重复。酶活定义为：在酶的最适条件下，每分钟产生 1 mol 还原糖所需的酶量为 1个单位（U）。生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.102841.2.5 酶学性质分析 1.2.5.1 最适温度和温度稳定性的测定 将纯化后的酶进行适当稀释，选择 10 mg/mL CMCNa 作为底物，温度范围设定为 40-70，重组酶在最适 pH 条件下反应 10 min，测定酶活。将最高酶活性设置为100%，并计算其他温度下的活性作为相对值（%），并绘制最佳温度趋势图。将重组酶分别在 70、80 和90下分别孵育 2、5、10、30 和 60 min 后，在最适条件下测定酶活力。以未处理酶液的酶活值作为100%，计算各时间点和温度点下的相对酶活值并绘制温度稳定性趋势图。1.2.5.2 最适 pH 及 pH 稳定性的测定 重组酶和底物（10 mg/mL CMCNa）分别用不同 pH 缓冲液（pH 3.0-7.0：100 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠；pH 8.0-9.0：100 mmol/L Tris 盐 酸；pH 10.0-12.0：100 mmol/L 甘氨酸-氢氧化钠）进行稀释，将重组酶放置在最适温度条件下反应 10 min，测定各 pH 条件下的剩余酶活。以酶活最高的 pH 条件下的酶活值作为 100%绘制最适 pH 和 pH 稳定性趋势图。1.2.5.3 比活值测定 以 450 L 的 10 mg/mL CMCNa、10 mg/mL大麦葡聚糖、10 mg/mL地衣多糖为底物，分别向其中加入 50 L 适当稀释的酶液，在重组酶最适条件下反应 10 min，测定重组酶的比活值。1.2.5.4 动力学常数的测定 以浓度范围为 4-20 mg/mL 的 CMCNa 为底物，反应体系包含 450 L 的底物和 50 L 的酶液，在最适条件下反应 5 min，测定酶活性。利用双倒数法作图并计算得到 Km、Vmax、kcat及 kcat/Km的值。1.2.5.5 耐盐性和盐稳定性的测定 重组酶耐盐性的测定是将 CMCNa 溶于不同浓度的 NaCl（1-4 mol/L）溶液中，在最适条件下，与适当稀释的酶液孵育 10 min，测定剩余酶活力。在测定酶的盐稳定性时，将重组酶与不同浓度的 NaCl（1-5 mol/L）混合后在 37下共同孵育 1 h，后取 50 L 孵育后的酶液与 450 L CMCNa 在最适条件下反应 10 min。以酶活最高的盐浓度条件下的比活值为 100%绘制耐盐性和盐稳定性趋势图。1.2.6 分子动力学模拟 利用 AlphaFold2 对野生型MtCel7b 及其突变体 B3cut进行建模，获得二者的模拟结构。选择 Amber ff99SB 为力场，在 343 K 下对MtCel7b 及 B3cut进行分子动力学模拟，时间设置为100 ns。在动力学模拟过程中，每隔 1 fs 输出一帧蛋白结构图，包含蛋白各原子的坐标、轨迹和能量等信息。利用最小二乘法统计蛋白骨架原子、C 原子、N 原子和羰基 C 原子的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD），通过计算每一帧蛋白结构原子的位置坐标得到，均方根波动（root mean square fluctuation,RMSF）值，并以 RMSF 值和 RMSD 值绘制曲线图。2 结果2.1 序列与结构分析来 源 于 M.thermophila 的 GH7 内 切 纤 维 素酶 编 码 基 因 Mtcel7b（GenBank Accession No.：XP_003664606.1）核苷酸序列全长为 1 368 bp，编码456 个氨基酸，前 20 个氨基酸为信号肽序列，其去除信号肽后的理论分子量为 47.2 kD，等电点为 4.75。MtCel7b 的结构预测模型表明（图 1A），MtCel7b 的结构与其他 GH7 家族纤维素酶一样，由 6 个 loop 区围绕反向平行的-折叠形成的-三明治结构。多序列比对结果（图 1B）显示，E194、D196、E199为催化三联体，其中，E194 和 E199 分别作为亲核试剂和酸/碱试剂催化糖苷键断裂（编号不包括信号肽序列）。MtCel7b 的 loop B3 比其他短链的内切纤维素酶多出 14 个氨基酸残基。MtCel7b 长链的 loop B3 额外形成了一个-折叠片和一个-螺旋结构。2.2 MtCel7b及其突变体的表达和纯化SDSPAGE 结果显示（图 2），野生型 MtCel7b与突变体 B3cut的表观分子量均大于其理论分子量（MtCel7b:47.2 kD；B3cut:45.7 kD）。经预测，野生型与突变体均包含 3 个 N 糖基化位点，可能是造成表观分子量大于理论分子量的原因之一。2.3 MtCel7b及其突变体的酶学性质分析2.3.1 最适温度及温度稳定性分析 在 pH 5.0 条件下测定野生型及突变体在不同温度（40-70）下的酶活力，由图 3A 可知，MtCel7b 的最适温度为60，在 40-60之间的酶活力均在 80%以上。将MtCel7b 分别在 70、80 和 90下孵育，检测其剩余酶活力（图 3D-F）。结果表明，MtCel7b 具有良好的耐热性，在 80和 90条件下处理 5 min 后，2023,39(10)285杨俊钊等：Loop B3 对 GH7 内切纤维素酶功能的影响机制剩余酶活仍保持在 80%以上（图 3E,F）。此外，MtCel7b 在 90孵育 1 h 后仍可检测到 40%以上的酶活性。突变体 B3cut的最适温度为 50，整体趋势较野生型变窄（图 3A）。突变体在 70、80 和 90的热稳定性较野生型提高，尤其在 90孵育 1 h 后，其剩余酶活高达 56%（图 3F）。2.3.2 最适 pH 及 pH 稳定性分析 在 pH 3.0-9.0 范围内测定最适 pH 值（图 3B）。MtCel7b 的最适 pH为 5.0，在 pH 5.0-6.0 范围内保留大约 80%以上的酶活性。B3cut与野生型一致均在 pH 5.0 下表现出最佳酶活性，但突变体的 pH 耐受范围缩小（图 3B）。在 pH 4.0 时，野生型的相对酶活性高达 79%，而突变体的相对酶活性为 40%。此外，MtCel7b 和突变体 B3cut在 pH 4.0-12.0 稳定性较好，在 37下处理1 h 后，仍然具有 90%以上的酶活（图 3C）。2.3.3 耐盐性和盐稳定性分析 在 0-4 mol/L 和 0-5 mol/L NaCl 中，测定了耐盐性和盐稳定性。在耐盐性方面，MtCel7b 的相对比活随着底物中盐浓度的增加而逐渐降低（图 4A），即当 2 mol/L 时，MtCel7b的相对比活值为 55%，而当底物中盐浓度增加至 4 mol/L 时，MtCel7b 的相对比活值下降至 37%。盐稳定性检测中，当酶液分别与 0-5 mol/L NaCl 缓冲液孵育 1 h 后，其野生型的比活值保持恒定，具有稳定的耐盐性（图 4B）。进一步分析显示，虽然突变体 B3cut经过 0-5 mol/L NaCl 溶液分别处理后的活性变化趋势与野生型一致，但是其在不同浓度下的相对比活值明显高于野生型，说明突变体 B3cut在 0-5 mol/L NaCl 的浓度下稳定性更好。2.3.4 比活性和动力学分析 以 10 mg/mL CMCNa、大麦葡聚糖和地衣多糖为底物测定 MtCel7b 及其突变体的比活性。MtCel7b 水解 CMCNa、大麦葡聚糖和地衣多糖的比活值分别为（38 2）、（790 1）和（493 10）U/mg（图 5）。突变体 B3cut表现出与野生型相似的底物偏好，但 B3cut水解这 3 种底物的比活值分别降低至（25 1）、（255 1）和（130 3）mg/mL，较野生型降低了 34%-74%。以 4-20 mg/mL CMCNa 作 为 底 物，在 最 适反 应 条 件 下 测 定 酶 的 动 力 学 参 数。MtCel7b 的Km和 Vmax值 分 别 为（8.8 0.8）mg/mL 和（143 7）mol/（minmg），kcat/Km为（12.8 0.1）mL/（mgs）。与野生型相比，突变体的 Vmax（69 8）mol/（minmg）较野生型降低 52%，催化效率（4.9 0.6）mL/（mgs）比野生型低约62%，并且突变体对底物的亲和力减弱Km=（10.9 3.3）mg/mL。2.4 分子动力学模拟分析根据图 6 的 RMSD 的结果来看，MtCel7b 与突ABA：MtCel7b 结构模拟图（红色区域为 loop 结构，E194、D196 和 E199 为催化三联体）；B：Loop B3 区由黄色方框标记A:Modeled structure of MtCel7b,loop structure in red,E194,D196 and E199 are catalytic triplets.B:The Loop region are marked by a yellow box.The strain source and PDB ID of the alignment sequence are HiCel7B（H.insolens,6YOZ）;ReCel7B（R.emersonii CBS 394.64,6SU8）;FoCel7B（F.oxysporum,1OVW）;TrCel7B（T.reesei,1EG1）;ThCel7B（T.harzianum CBS 226.95,5W0A）图 1 MtCel7b 结构模拟（A）及氨基酸序列对比（B）Fig.1 Structural simulation（A）and amino acid sequence alignment（B）of MtCel7bM：蛋白分子质量标准；1：野生型 MtCel7b 纯化蛋白；2：突变体 B3cut纯化蛋白M:Protein molecular weight standard;1:purified protein of wildtype MtCel7b;2:purified protein of mutant B3cut图 2 野生型 MtCel7b 和突变体 B3cut的 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of wild-type MtCel7b and mutant B3cut生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10286变体在 50 ns 后达到平衡，平均 RMSD 值均为 2.0。MtCel7b 与突变体均在 loop 区域表现出相似的 RMSF趋势，波动越大，显示出 loop 区的灵活性越强。突变体中与 loop B3 相邻的 257-266 位残基的 RMSF 值增加到 5，而野生型相应位置的 RMSF 值仅为 2（蓝色虚线框）。说明截短 loop B3 后，会影响相邻结A：最适温度；B：最适 pH；C：pH 稳定性；D：70下温度稳定性；E：80下温度稳定性；F：90下温度稳定性A:Optimal temperatureactivity profile.B:Optimal pH.C:pH stability.D:Thermostability at 70.E:Thermostability at 80.F:Thermostability at 90 图 3 野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut的酶学性质Fig.3 Enzymatic properties of wild-type MtCel7b and mutant B3cut图 4 野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut的耐盐性（A）与盐稳定性（B）Fig.4 Halo tolerant（A）and halo stability（B）of wild-type MtCel7b and mutant B3cut2023,39(10)287杨俊钊等：Loop B3 对 GH7 内切纤维素酶功能的影响机制构的波动情况。图 7A,B 的主成分分析图说明野生型与突变体均具有 5 种不同的状态，分别以不同颜色显示。野生型的样点分布分散，表明每种状态之间的相似性较低，结构变化较大。但是，突变体状态内与状态之间的聚类情况良好，样点分布更加集中，状态间有较好的区分，说明其在 100 ns 分子动力学模拟过程中构象相对稳定。提取分子动力学模拟的平均结构用于进一步分析，根据预测蛋白活性口袋大小的在 线 网 站 POCASA（http:/altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）计算得到野生型 MtCel7b 和突变体B3cut活性口袋的体积分别为 2 799 3和 1 078 3，野生型的口袋体积大概是突变体的 2.5 倍（图 7C,D）。图 7E,F 显示，B3cut的 loop A3（351GDN353）和loop B1（W52）均向催化活性中心移动，导致其催化通道较野生型更加密闭。从平均结构看出，野生型的 loop B3 周围有一个复杂的氢键相互作用网络（图 7E）。C225 主链羧基 O 和主链氨基 H 分别与K233 侧链氨基 HZ2 和 G222 主链羰基 O 形成侧链-主链氢键和主链氢键，并且 C225 还与 C220 的巯基形成二硫桥。在复杂的氢键网络的控制下，K233 侧链氨基 HZ3 和主链氨基 H 分别与 E226 主链羰基 O和 C231 主链羰基 O 形成侧链-主链氢键和主链氢键。然而，由于 loop B3 截短，K233 失去周围氢键束缚，导致其侧链扭转了 120，并且侧链氨基 HZ2与催化残基 E194 的侧链羧基 OE1 形成盐桥，并且K233 的主链氨基 H 和 D232 侧链羧基 OD2 形成新的侧链-主链氢键，使两个催化残基（E194、E199）的 C 距离从 12.7 减少到 11.7，并且明显缩小了催化口袋。除此之外，催化通道两端残基的位置也发生了改变。图 7C,D 表明，突变体的催化口袋明显较野生型窄。如图所示，残基 W52、Q172、K233、图 5 野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut的比活值Fig.5 Specific viabilities of wild-type MtCel7b and mutant B3cutA：野生型 MtCel7b 的均方根偏差图；B：突变体 B3cut的均方根偏差图；C：野生型 MtCel7b 的均方根波动图；D：突变体 B3cut的均方根波动图A:RMSD of wildtype MtCel7b;B:RMSD of mutant B3cut;C:RMSF of wildtype MtCel7b;D:RMSF of mutant B3cut图 6 野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut的均方根偏差和均方根波动图Fig.6 RMSD and RMSF of wild-type MtCel7b and mutant B3cut生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10288N234、R242、G351、D352、N353、W356 和 E361均向催化中心移动。在催化通道的 3 位处，突变体 B3cut中的 loop B1 中 W52 侧链的方向发生了变化，与野生型相比更接近催化中心。B3cut的 loop A3中 D352 主链羰基 O 和靠近 loop B3 的 Q172 侧链酰基 2HE2 之间形成侧链-主链氢键，导致催化口袋A、B：野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut分子动力学模拟轨迹的主成分分析；C、D：野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut的蛋白质分子表面图；E、F：野生型 MtCel7b及突变体 B3cut催化裂隙周围氨基酸残基A and B:Principal component analysis of the molecular dynamic simulation trajectory of wildtype MtCel7b and mutant B3cut.C and D:Protein surface of wildtype MtCel7b and mutant B3cut.E and F:Amino acid residues around the catalytic cleft of wildtype MtCel7b and mutant B3cut图 7 野生型 MtCel7b 及突变体 B3cut分子动力学模拟的轨迹主成分分析及平均结构图Fig.7 Trajectory principal component analysis plots and average structure of molecular dynamics simulations of wild-type MtCel7b and mutant B3cut2023,39(10)289杨俊钊等：Loop B3 对 GH7 内切纤维素酶功能的影响机制被周围的氨基酸覆盖，催化通道的入口变窄。同时，在催化通道的+2 位点处，氨基酸的取向也发生了变化，从而引起了氢键的改变。在野生型中，R242 侧链胍基 2HH2 和主链氨基 H 只与 W356 主链羰基 O和 N239 侧链酰基 OD1 之间形成侧链-主链氢键（图7E），而在 B3cut中，R242 周围形成了一个新的复杂的氢键网络。如图 7F 所示，R242 主链氨基 H、侧链胍基 1HH1、2HH2、HE 分别与催化裂隙上方的N239 侧链酰基 OD1、A237 主链羰基 O 和裂隙下方的 E361 侧链羧基 OE1、OE2 之间形成侧链-主链氢键，这使得催化通道正位处变窄。虽然 R242 没有与 W356 形成氢键作用力，但 W356 的吲哚环旋转了 50，使产物生成部位更加封闭，增加了催化裂隙的疏水性。3 讨论MtCel7b 的最适温度和最适 pH 值与大多数真菌源的 GH7 内切葡聚糖酶相似，均在 50-60和 pH 4.0-5.0 的范围内显示出最大的酶活性3-6。此外，与先前的报道一致，MtCel7b 对大麦葡聚糖的比活值高于对 CMCNa 的水解活性，这可能是由于 CMCNa 的分子结构被甲氧基侧链高度取代，从而干扰酶的活性20。目前报道的大多数 GH7 内切酶都属于嗜中温酶，例如，来源于 Aspergillus oryzae KBN616的 CelA 和 CelB 分别在 60和 55的温度处理 10 min 后迅速失活3，当在 60条件下处理 10 min 后，来自 H.grisea var.thermoidea 的 EGI 稳定性瞬间下降