LPAR1基因对脂多糖刺激下Ⅱ型肺泡上皮细胞中组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18LPAR1基因对脂多糖刺激下型肺泡上皮细胞中组织因子和纤溶酶原激活物抑制剂1表达的影响刘颖 陈先俊 肖川 袁佳 李清 李璐 杨金凤 沈锋贵州医科大学附属医院重症医学科（贵阳 550004）【摘要】目的了解脂多糖（LPS）刺激下型肺泡上皮细胞（AEC）中差异表达基因溶血磷脂酸受体1（LPAR1）的动态表达特点，以及该基因对LPS刺激下组织因子（TF）和纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）表达的调节作用。方法对LPS损伤后的RLE-6TN细胞进行RNA-seq测序，通过生物信息学分析，以NF-B信号通路为核心，找到该信号通路富集到的的差异表达基因 LPAR1。使用 LPS 刺激处于生长对数期的RLE-6TN细胞6、12、24、48及72 h，检测细胞中LPAR1基因的动态表达水平。在此基础上通过慢病毒转染敲低细胞中LPAR1基因的表达，观察该基因对细胞中TF和PAI-1表达的调节作用。结果RLE-6TN细胞中LPAR1的表达在刺激6 h后开始升高，24 h时候达到顶峰，之后逐渐降低；利用慢病毒转染技术，成功低敲了细胞中LPAR1基因水平。LPS刺激24 h后，RLE-6TN细胞中TF和PAI-1的mRNA和蛋白的表达水平与正常对照组比较显著增加，差异有统计学意义（P 0.05）；低敲LPAR1基因后，TF和PAI-1的表达水平显著降低（P 0.05）。结论LPAR1基因对LPS刺激下RLE-6TN细胞TF和PAI-1的表达具有调节作用。该基因有望成为纠正ARDS肺泡内纤维蛋白沉积的新靶标。【关键词】溶血磷脂酸受体 1；型肺泡上皮细胞；急性呼吸窘迫综合征；组织因子；纤溶酶原激活物抑制剂1【中图分类号】R441.8Regulatory effect of LPAR1 gene on tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 in LPSstimulated type II alveolar epithelial cells LIU Ying，CHEN Xianjun，XIAO Chuan，YUAN Jia，LI Qing，LI Lu，YANG Jinfeng，SHEN Feng.Department of Critical Care Medicine，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical University，Guizhou 550004，China Corresponding author：SHEN Feng Email：【Abstract】Objective To investigate the dynamic expression characteristics of lysophosphatidic acid receptor 1（LPAR1），a differentially expressed gene，in type alveolar epithelial cells（AEC）stimulated by lipopolysaccharide（LPS），and the role of the gene in the regulation of tissue factor（TF）and plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）.MethodsRNA-seq sequencing was performed on RLE-6TN cells after injured by LPS，and then using bioinformatics analysis，identify the differentially expressed gene LPAR1 in the NF-B signaling pathway.LPAR1 gene was dynamically expressed in RLE-6TN cells at 6，12，24，48 and 72 h after LPS stimulation.On this basis，the expression of LPAR1 gene was knocked down by lentiviral transfection to observe the effect of the gene on the expression of TF and PAI-1.ResultsThe expression of LPAR1 in RLE-6TN cells started to increase after 6 h of stimulation，peaked at 24 h，and then gradually decreased.LPAR1 gene levels were successfully knocked down through lentiviral transfection.After 24 hours of LPS stimulation，the expression levels of TF and PAI-1 mRNA and protein in the cells increased significantly compared with normal controls，with statistical significance（P 0.05），and then after knocking down LPAR1 gene，the expression levels of TF and PAI-1 decreased significantly（P 0.05）.ConclusionThe LPAR1 gene has a regulatory effect on TF and PAI-1 in LPS-stimulated RLE-6TN cells.The gene is expected to be a new target for correcting fibrin deposition in the alveoli of ARDS.【Key words】lysophosphatidic acid receptor 1；type alveolar epithelial cells；acute respiratory distress syndrome；tissue factor；plasminogen activator inhibitor-1基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.18.007基金项目：国家自然科学基金地区基金（编号：82160365）；贵州医科大学附属医院 2021 年度院级临床研究课题（编号：2021-GMHCT-003）通信作者：沈锋 E-mail：2323实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18急性呼吸窘迫综合征（acute respiratorydistress syndrome，ARDS）是由多种肺内、外致病因素引起的急性呼吸衰竭综合征1-2，肺泡内大量纤维蛋白沉积是 ARDS 重要的病理特征，其结果引起肺顺应性降低、肺弥散和换气功能受损等3，是引起ARDS顽固性低氧血症的重要机制4。研究5-6已证实，肺泡内促凝增强及纤溶过度抑制是引起肺泡纤维蛋白沉积的主要原因，但其发生机制不清楚。近年研究7-8发现，型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cell type，AEC）对 ARDS 肺泡内促凝和纤溶抑制具有重要调节作用。本课题组前期研究显示，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下，AECII细胞分泌和表达组织因子（tissue factor，TF）及纤溶酶原激活抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）增加9-13，并由此对肺泡促凝及纤溶抑制进行调控。因此，我们使用该细胞作为本文的研究对象。我们前期研究14-17发现，NF-B 信号通路对TF 及 PAI-1 的表达和分泌具有调节作用，但调节机制尚不清楚，因此，基于该信号通路，寻找相关的调节基因，对完善 ARDS 肺泡内促凝增强及纤溶抑制的发生机制具有重要意义。我们对LPS损伤后的 RLE-6TN 细胞进行 RNA-seq 测序，通过生物信息分析，基于该信号通路找到了差异基因溶血磷脂酸受体 1（lysophosphatidic acid receptor 1，LPAR1）。既往研究18-22证实抑制 LPAR1 基因明显减轻了 NF-B 信号通路的活化，本课题组前期研究发现该信号通路对 RLE-6TN 细胞中 TF和 PAI-1 的表达具有调控作用，推测 LPAR1 通过影响NF-B信号通路进而对肺泡促凝增强及纤溶抑制进行调节。因此，本研究以大鼠AEC细胞为研究对象，观察 LPAR1 对 LPS 刺激下 AEC细胞中TF和PAI-1表达的影响。1材料与方法1.1 细胞系 大鼠AEC细胞株RLE-6TN购自中南大学湘雅医学院细胞中心。实验过程中细胞处理措施符合医学伦理学标准，已取得贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（编号：2304220）。1.2 主要试剂 LPS（货号：L8880）购自Solarbio公司。LPAR1（货号：ab23698）一抗购自美国 Abcam公 司；TF（货 号：NBP2-67731）一 抗 购 自 美 国NOVUS 公司；PAI-1（货号：66261-1-Ig）一抗购自Proteintech中国公司；GAPDH（货号：AP0063）一抗及羊抗鼠二抗均购自巴傲得生物科技有限公司；山羊抗兔二抗购自 Jackson 公司。慢病毒购于北京擎科生物有限公司，靶向干扰LPAR1的shRNA序列为5-GCTTCTACAACGAGTCTATCG-3。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa生物科技有限公司。1.3 筛选关键差异基因 使用edgeR进行标准化并计算两组样品间的倍数变化和p-value，筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。差异表达基因用 P 值和差异倍数（fold change，FC）的对数（logFC）表示，筛选标准为：P 1，使用ggplot2 R包将相关基因绘制成火山图。进一步用clusterProfiler R 包对DEGs 做GO（GeneOntology）功能富集，富集分析的结果以 P 0.05 作为入选标准，从中找到 NF-B 通路相关的差异基因。使用 R 软件 heatmap R 包将差异基因绘制成基因热图，并进一步将通路和基因导入Cytoscape 3.8.2软件构建通路与相关基因网络图，找到与非负调控NF-B通路密切相关的上调基因。1.4 细胞培养 将细胞置于25 cm2的培养瓶中，加入 10%胎牛血清和 1%青霉素/链霉素溶液的 DMEM 培养基，置于恒温细胞培养箱（37、5%CO2）中培养至对数期，用含 0.25%的胰蛋白酶进行消化传代。1.5 慢病毒转染 根据预实验 MOI 加入病毒液进行感染，按照北京擎科生物公司提供的慢病毒使用手册，在感染慢病毒后的72 h，置于倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，后将细胞继续培养于含Puromycin（8 g/mL）的培养液中进行筛选，得到稳转细胞株。1.6 LPAR1 的动态表达及实验分组 用 LPS 刺激处于生长对数期的 RLE-6TN 细胞 6、12、24、48及72 h，检测LPAR1基因的动态表达水平，选取变化最明显的时间点作为研究时间。RLE-6TN细胞转染 LPAR1（sh-LPAR1）低表达慢病毒，空载慢病毒（sh-NC）作为对照。细胞分为对照组（PBS）、模型组（LPS）、模型+sh-LPAR1（LPS+sh-LPAR1）组和模型组+sh-NC（LPS+sh-NC）组。各组细胞分别加入PBS和LPS刺激24 h。1.7 蛋白质免疫印迹实验（Western blotting，WB）检测LPAR1、TF、PAI-1的蛋白表达 将给予处理的细胞放置于冰上裂解，收集裂解液离心后取上清液并使用 BCA 试剂盒检测蛋白水平。按 Western blotting检测试剂盒操作说明检测蛋白表达量。1.8 实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，RT-q PCR）检测LPAR1、TF、PAI-1的mRAN表达 使用TRIzol提取RLE-6TN的总RNA，并通过逆转录试剂盒合成c DNA，采用95 预变性2 min，95 变性 10 s，60 退火和延伸 30 s，共 40 个循2324实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18环的 PCR 扩增，采用 2-Ct法对数据进行量化。引物序列如下：LPAR1 正向：5-ACTTCTTCGCTGGACTGG-3，反向：5-CTGTGATGTGCCTCT-CGAT-3；TIFA 正向：5-TGGACCTGCCTTACAAGT-G-3，反 向：5-GTATGGGGCTCTGCGTT-3；TF 正 向：5-ACTCAAGCACAGGAAAAAC-3，反 向：5-TG-GAGAAAATCACGGCTTGTAC-3；PAI-1正向：5-G-CCTGTTCCACAAGTCTGATG-3，反向：5-ATGAACATGCTGAGGGTTTTCG-3；GAPDH正向：5-GAC-ATGCCGCCTGGAGAAAC-3，反 向：5-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3。1.9 统计学方法 实验结果以3次重复实验的均数标准差表示。用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本 t 检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1 NF-B信号通路相关的条目 对LPS损伤后RLE-6TN 细胞进行 RNA-seq 测序，与正常细胞比较，检测到差异表达基因 531 个（P 0.05），其中上调基因201个，下调基因330个，并绘制成火山图（图1）。进一步对531个差异基因进行GO功能富集分析，富集结果共16个差异表达基因映射到4个NF-B信号通路相关条目，且具有显著富集标准（P 0.05，图1）。2.2 NF-B信号通路相关差异基因筛选 使用R软件，将上述16个差异基因绘制热图（图2），同时我们将富集结果绘制成通路-基因靶点网络图（图 2），找到 LPAR1、TIFA（具有叉头相关结构域的肿瘤坏死因子受体相互作用蛋白）为上调且非负调控NF-B信号通路的差异基因。进一步我们通过预实验发现，LPS 刺激下 RLE-6TN 细胞中LPAR1 表达升高（P 0.05），而 TIFA 的表达却减少（P 0.05，图2），因此，本研究选择LPAR1进行后续实验。2.3 LPAR1在LPS刺激RLE-6TN细胞中的动态变化 WB和RT-q PCR结果显示，LPS处理6 h后，LPAR1 mRNA 和蛋白表达开始升高，24 h 达到顶峰，之后逐渐降低（图 3）。各时间点的表达均高于正常细胞LPAR1表达水平（P 0.05）。基于上述结果，我们选择 LPS 刺激细胞 24 h 进行后续相关实验。2.4 转染慢病毒抑制 LPAR1 的表达 RT-qPCR及WB结果显示，与sh-NC组相比，sh-LPAR1组成功低敲了细胞中LPAR1的表达（均P 0.05，图4）。2.5 低表达LPAR1对LPS诱导下RLE-6TN细胞中TF表达的影响 LPS刺激24 h后，RLE-6TN细胞中TF的mRNA和蛋白的表达水平与NC组比较显著增加，差异有统计学意义（P 0.05）；低敲LPAR1基因后，与sh-NC 组相比TF 的表达水平显著降低（P 0.05），接近正常对照水平（图5）。2.6 低表达LPAR1对LPS诱导下RLE-6TN细胞中 PAI-1 表达的影响 LPS 刺激在 RLE-6TN 细胞中引起PAI-1mRNA和蛋白表达量升高（P 0.05）；低敲 LPAR1 基因后，与 sh-NC 组相比 PAI-1 的表达水平显著降低（均 P 0.05），接近正常对照水平（图6）。3 讨论 AEC是 ARDS 发生发展过程中受损的主要靶细胞之一，对 ARDS 肺泡促凝和纤溶抑制具有10.07.55.02.50.0-log10（pvalue）-8-404logFCsignificantDown n=300NotUp n=201Gene Ontology EnrichmentPvalue0.0090.0060.0030.0060510Gene numbersnegative regulation of NFkappaB transcription factor activityregulation of IkappaB kinase/NFkappaB signalingIkappaB kinase/NFkappaB signalingnegative regulation of IkappaB kinase/NFkappaB signalingTermAB 注：A为LPS组和对照组相关基因火山图，红色代表上调差异基因（P 0.05），绿色代表下调差异基因（P 0.05），B为LPS组和对照组中差异的GO富集结果中与NFB信号通路相关的条目。纵轴表示富集的GOterms，横轴表示该GO terms包含的差异基因数目图1筛选NF-B信号通路相关的条目Fig.1Screening for NF-B signaling pathway-related entries2325实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18重要作用，因此我们选择该类细胞作为本文研究对象。在课题组前期研究中，我们发现以5 g/mL的 LPS 浓度刺激 RLE-6TN 细胞，既未影响细胞活力，又能明显刺激 TF、PAI-1 的表达12。因此，本实验仍采用 5 g/mL 的 LPS 浓度刺激 RLE-6TN 细胞，模拟革兰阴性杆菌诱导的 ARDS 细胞损伤模型。如前所述，肺泡促凝增强和纤溶过度抑制导致的肺泡内大量纤维蛋白沉积是 ARDS 重要特征，在探讨其发生机制中，课题组研究结果证实，NF-B信号通路参与对肺泡内促凝增强及纤溶抑制的调节14-15，但调节机制不清楚。因此，我们对LPS损伤后的RLE-6TN细胞进行RNA-seq测序，通过生物信息学分析，以NF-B为核心，找到上调且非负调控 NF-B 信号通路的差异基因 LPAR1、TIFA，进一步通过RT-q PCR进行验证，发现在LPS刺激下RLE-6TN细胞中LPAR1表达升高，而TIFA的表达却减少，因此我们对LPAR1基因进行研究。通过LPS处理RLE-6TN细胞6、12、24、48、72 h后，发现 6 h 后 LPAR1 mRNA 和蛋白表达开始升高，24 h达到顶峰，之后逐渐降低，故我们选择LPS刺激细胞24 h进行实验。NCLPS1.00 0.010.64 0.10b2.57 0.28a1.00 0.063210LPAR1TIFAmRNA expressiontypeNCSeq_NC210-1-2typeMturnLparlTifaPiddlS100bRhohTnip3Tlr2Tnfaip3Cx3cl1Nod2Tnip1CyplblZc3h12aNlrx1NfkbiaSeq_NC1Seq_NC2Seq_NC3NC1NC2NC3ABC 注：A为NFB信号通路相关差异基因热图，Seq_NC是LPS刺激细胞组；NC是正常细胞组；颜色越红，基因表达越显著;颜色越绿，基因表达越不显著，B为NFB信号通路-基因的网络展示图，包括20个节点，其中4个NFB信号通路节点和16个基因节点，C：LPAR1、TIFARTq PCR结果统计图。与NC组比较，aP 0.05；bP 0.05图2NF-B信号通路相关差异基因的筛选Fig.2Screening differential genes related to NF-B signaling pathwayNC6 h12 h24 h48 h72 h43210LPAR1 mRNA（2-Ct）NC6 h12 h24 h48 h72 h1.51.00.50.0LPAR1蛋白（LPAR1/GAPDH）GAPDHLPAR141 kD36 kDNC 6 h 12 h 24 h 48 h 72 hABC 注：NC是正常对照组，6、12、24、48、72 h分别是LPS刺激不同时间组；A为LPAR1RTq PCR结果统计图，B为LPAR1蛋白免疫印迹检测图，C为LPAR1蛋白免疫印迹检测统计图。与NC组比较，aP 0.05；与shNC组比较，bP 0.05图4低表达LPAR1的慢病毒转染Fig.4Lentiviral transfection with low expression of LPAR1LPS+shNCLPS+shLPAR1LPSNCLPS+shNCLPS+shLPAR1LPSNC3210TF mRNA（2-Ct）1.51.00.50.0TF蛋白（TF/GAPDH）LPS+shNCLPS+shLPAR1LPSNC47 kD36 kDTFGAPDHA AB BC C 注：NC是对照组，LPS组是脂多糖刺激组，LPS+sh-NC组转染了空病毒后脂多糖刺激组，LPA+sh-LPAR1组是转染了LPAR1低表达慢病毒后脂多糖刺激组；A为TF的RT-q PCR 结果统计图；B为TF蛋白免疫印迹检测图；C为TF蛋白免疫印迹检测统计图。与NC组比较，aP 0.05；与LPS+sh-NC组比较，cP 0.05图5各组RLE-6TN细胞中TF的表达Fig.5Expression of TF in each group of RLE-6TN cells2327实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18本实验存在的不足：（1）由于细胞实验与临床存在一定差异，本实验通过得出的结果不一定完全符合临床，因此还需要进一步临床研究证实。（2）本研究只低表达了 LPAR1 基因，可进一步过表达 LPAR1 进行验证。（3）LPAR1 基因是否通过NF-B信号通路来影响LPS刺激下RLE-6TN细胞中 TF 和 PAI-1 表达和分泌，需进一步验证。综上所述，LPAR1 基因对 LPS 刺激下 RLE-6TN 细胞 TF和PAI-1的表达具有调节作用。该基因有望成为纠正ARDS肺泡内纤维蛋白沉积的的新靶标。【Author contributions】LIU Ying performed the experiments and wrote the article.CHEN Xianjun，XIAO Chuan，YUAN Jia and LI Qing performed the experiments.LI Lu and YANG Jinfeng collected data.SHEN Feng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 MEYER N J，GATTINONI L，CALFEE C S.Acute respiratory distress syndrome J.Lancet，2021，398（10300）：622-637.2 KAKU S，NGUYEN C D，HTET N N，et al.Acute Respiratory Distress Syndrome：Etiology，Pathogenesis，and Summary on Management Z.J Intensive Care Med，2020，35（8）：723-737.3 MCCLINTOCK D，ZHUO H，WICKERSHAM N，et al.Biomarkers of inflammation，coagulation and fibrinolysis predict mortality in acute lung injury J.Crit Care，2008，12（2）：R41.4 BOS L D J，WARE L B.Acute respiratory distress syndrome：causes，pathophysiology，and phenotypesJ.Lancet，2022.http：/dx.doi.org/10.1016/S0140-6736（22）01485-4.5 KOYAMA K，KATAYAMA S，TONAI K，et al.Biomarker profiles of coagulopathy and alveolar epithelial injury in acute respiratory distress syndrome with idiopathic/immune-related disease or common direct risk factors J.Crit Care，2019，23（1）：283.6 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0.05图6各组RLE-6TN细胞中PAI-1的表达Fig.6Expression of PAI-1 in each group of RLE-6TN cells2328实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18inhibition through NF-B inactivation in ARDS mice J.Biomed Pharmacother，2021，139：111569.16CHENG Y，LIU B，QIAN H，et al.BAY11-7082 inhibits the expression of tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 in type-II alveolar epithelial cells following TNF-stimulation via the NF-B pathway J.Exp Ther Med，2021，21（2）：177.17LIU B，WU Y，WANG Y，et al.NF-B p65 Knock-down inhibits TF，PAI-1 and promotes activated protein C production in lipopolysaccharide-stimulated alveolar epithelial cells type II J.Exp Lung Res，2018，44（4-5）：241-251.18LEE C H，SAPKOTA A，GAIRE B P，et al.NLRP3 Inflammasome Activation Is Involved in LPA（1）-Mediated Brain Injury after Transient Focal Cerebral Ischemia J.Int J Mol Sci，2020，21（22）：8595.19LEE J H，SARKER M K，CHOI H，et al.Lysophosphatidic acid receptor 1 inhibitor，AM095，attenuates diabetic nephropathy in mice by 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