DNA条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用.pdf

四川动物 Sichuan Journal of Zoology 2023，42（5）：508-518DNA 条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用贺杨1，陈文俊1，陈洁琼1，曾文文1，张雪晶1，杨婷1，翟东东1，2，刘红艳1，2，熊飞1，2，王莹1，2*（1.江汉大学生命科学学院，湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心，武汉430056；2.江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，武汉430056）摘要：为了探讨DNA条形码在三峡库区鱼类辅助物种鉴定中的适用性，本研究通过在三峡库区大规模采样，共采集鱼类标本18 466尾，PCR扩增了其中946尾标本的CO基因序列（639 bp），在NCBI和BOLD数据库中比对鉴定出 71个物种，隶属于6目14科55属，其中5个为未命名种，鉴定率为93%；种间遗传距离（6.88%）是种内遗传距离（0.36%）的19.11倍；贝叶斯系统进化树显示，71个物种各自聚为一支且具有高的支持率（PP=1.00）。遗传多样性分析显示，三峡库区中鲢Hypophthalmichthys molitrix、瓦氏黄颡鱼Tachysurus vachellii和蛇Saurogobio dabryi具有较高的CO条形码遗传多样性，而贝氏Hemiculter bleekeri、光泽黄颡鱼Tachysurus nitidus和短颌鲚Coilia brachygnathus的较低。本研究验证了DNA条形码在三峡库区大部分鱼类鉴定中的有效性，同时构建了三峡库区鱼类DNA条形码数据库，评估了6个优势物种的遗传多样性，为三峡库区鱼类资源保护和管理提供了科学数据。关键词：DNA条形码；三峡库区；物种鉴定；遗传多样性中图分类号：Q959.4 文献标志码：A 文章编号：1000-7083（2023）05-0508-11Application of DNA Barcode for Fish Diversity in the Three Gorges Reservoir AreaHE Yang1，CHEN Wenjun1，CHEN Jieqiong1，ZENG Wenwen1，ZHANG Xuejing1，YANG Ting1，ZHAI Dongdong1，2，LIU Hongyan1，2，XIONG Fei1，2，WANG Ying1，2*（1.Hubei Engineering Research Center for Protection and Utilization of Special Biological Resources in the Hanjiang River Basin，School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，China；2.Hubei Key Laboratory of Environmental andHealth Effects of Persistent Toxic Substances，Jianghan University，Wuhan 430056，China）Abstract:To explore the applicability of DNA barcodes in assisting the species identification of fishes in the Three Gorges Reservoir Area，a total of 18 466 fish samples were collected through large-scale sampling.The CO sequences（639 bp）of 946 samples were amplified by PCR，and 71 fish species belonging to 55 genera，14 families and 6 orders were identified by sequence alignment in the NCBI and BOLD databases.Moreover，5 species were found to be unnamed，and the identification success rate was 93%.The interspecific genetic distance（6.88%）of the fish samples was 19.11 times higher than that of the intraspecific genetic distance（0.36%）.The CO sequence-based Bayesian inference tree revealed that 71 species were unambiguously separated from others with strong support value of PP=1.00.The result of genetic DOI：10.11984/j.issn.1000-7083.20220374收稿日期：2022-10-27 接受日期：2023-05-15基金项目：国家自然科学基金项目（51979123）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（T2020034）；江汉大学2018年高层次人才科研启动费项目（2018年科研启动费059号）；2021年江汉大学校级科研项目（2021yb108）作者简介：贺杨（1996），男，硕士研究生，研究方向：鱼类遗传学，E-mail：*通信作者Corresponding author，E-mail：508贺杨等：DNA条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用diversity analysis showed that Hypophthalmichthys molitrix，Tachysurus vachellii，and Saurogobio dabryi had high levels of genetic diversity，while Hemiculter bleekeri，Tachysurus nitidus，and Coilia brachygnathus had low levels.In conclusion，this study verified the feasibility of CO sequence-based DNA barcode technology in classifying and identifying the most fish species in the Three Gorges Reservoir Area，constructed a DNA barcode database，and evaluated the genetic diversity of the 6 dominant species，which may provide scientific data for the protection and management of fish resources in this area.Keywords:DNA barcode；Three Gorges Reservoir Area；species identification；genetic diversity三峡工程是世界上最大的水利工程之一，1997年实现长江截流，经过多次蓄水，库区水位由135 m上升到175 m（杨志等，2015）。三峡大坝的建设使位于重庆市东部和湖北省宜昌市西部之间形成了长约600 km、面积约1 084 km2的峡谷河道型水库。已有研究成果表明，三峡水库蓄水后，库区水生生境由原来单一的河流生境转变为静水-缓水-流水梯次排列的复杂生境，使库区鱼类物种数急剧减少，鱼类群落结构也发生了显著变化（Yang et al.，2012；邹家祥，翟红娟，2016；Gao et al.，2019；魏念等，2021）。20世纪80年代前，三峡库区江段有 140200 种 鱼 类（Fan et al.，2006）；吴 强 等（2006）在三峡库区长江干流及主要支流共监测到鱼类108种。董纯等（2019）在三峡库区干流鱼类资源现状与物种多样性保护的调查中获得84种鱼类。因此，全面了解三峡库区现有鱼类组成和评估鱼类的遗传多样性并提出保护措施非常必要。自 2006 年建立鱼类条形码数据库 Fish-BOL（http：/www.fishbol.org）以来，鱼类 DNA 条形码数据量呈指数级上升（Ward，2012）。不少研究显示DNA 条形码技术能很好地进行鱼类物种鉴定：Khedkar等（2014）基于印度纳尔默达河流域314条鱼类的CO条形码，发现 5 个隐存种和 43种该地区未报道鱼类；Chen等（2015）研究了怒江1 139个样品的CO条形码，建立了怒江鱼类DNA条形码数据库，验证了CO条形码在鱼类鉴别上的可行性；Wang等（2021）探讨了DNA条形码技术在向家坝库区鱼类鉴定中的应用；郜星晨和姜伟（2021）初次构建了三峡库区常见小型鱼类DNA条形码数据库，但其研究的物种数目较少。本研究一方面利用DNA条形码技术对三峡库区渔获物进行鉴定，探讨DNA条形码在三峡库区鱼类辅助鉴定中的适用性，构建三峡库区鱼类DNA条形码数据库，另一方面对一些鱼类进行了初步的遗传多样性分析，以期为三峡库区鱼类资源监控、保护和管理提供科学数据。1材料与方法1.1实验材料与形态学鉴定2019年811月和2020年58月，在三峡库区及各支流（太平溪、香溪河、小江、云阳、万州、丰都、涪陵、巴南、箭滩河、涪江、嘉陵江）设置11个采样点（图1），渔具选择地笼（网目1.2 cm）和单层多网目复合刺网等。在各采样点进行捕捞、现场鉴定、记录鱼类体长及体重等生物学性状。参考 中国鲤科鱼类志（伍献文等，1982）、四川鱼类志（丁瑞华，1994）和 Fishes of the World（Nelson et al.，2016）等对物种进行形态学鉴定。共采集鱼类标本 18 466尾，为获取各物种不同地理种群的样本，选取其中946尾PCR扩增，每个样本取适量鳍条和肌肉保存于95%乙醇中用于CO条形码分析，随后所有样品用10%甲醛溶液浸泡成标本，保存于江汉大学动物遗传学实验室。1.2DNA提取、PCR扩增及测序取约100 mg鱼类肌肉组织或鳍条，采用高盐法提取基因组DNA，CO基因序列扩增引物序列为：F1：5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3和R1：5-TAGACTTCTGGGTGGGCCAAAGAATC-3509四川动物 2023 年 第 42 卷 第 5 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.5 2023（Ward et al.，2005）。PCR 反应体系（30 L）：2Taq Master Mix（含 Taq-DNA-Polymerase、PCR-Buffer 和dNTP，上海捷瑞）10.3 L，正、反向引物（10 mmol L1）各1.5 L，DNA模板1.5 L，双蒸水15.2 L。PCR反应程序为：95 5 min；95 30 s，56 45 s，72 45 s，31个循环；72 10 min；16 20 min或者结束后4 保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送天一辉远生物科技有限公司完成纯化回收和序列测定。1.3数据分析通过DNAStar中的SeqMan对测序峰图进行校对和拼接（Swindell&Plasterer，1997），获得有效的样本序列；利用MEGA 7.0进行多序列比对和截取同源序列（Kumar et al.，2016），分析序列变异位点、信息位点、碱基组成情况，基于K2P双参数模型计算遗传距离，可靠性经过1 000次自举检验；通过MEGA 7.0计算分类学分辨率（种间平均遗传距离/种内平均遗传距离）；利用DNASP 5.0计算物种单倍型数目（Librado&Rozas，2009）；通过 MrBayes 3.2.3 构 建 贝 叶 斯 系 统 进 化 树（Ronquist et al.，2012），利用 Tracer 1.6 检查贝叶斯推测的饱和度（Suchard et al.，2018）；通过 DNASP 5.0 计算采样点2，且样本量30鱼类样本的单倍型数目（Nh）、单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（）。参考NCBI和 BOLD 数据库检索所有形态物种的 CO基因序列，将物种序列相似度97%的标本定义为同一物种（Wong&Hanner，2008），最后将测序序列提交至GenBank数据库。2结果2.1物种形态鉴定结果946 尾标本经形态学鉴定隶属于 6 目 14 科55 属 71 种（附录），鲤形目 Cypriniformes 鲤科Cyprinidae 物种最多（39 种，55%），其次是鲿科Bagridae（8种，11%）。2.2DNA条形码序列分析PCR 扩增获得 946 条 CO基因序列，共计303个单倍型，去除两端不可靠的碱基后得到长度为639 bp的CO基因序列矩阵，将上述序列储存在GenBank数据库（附录）。NCBI和BOLD数据库比对结果显示，926尾有98.12%以上的相似性，属于66个物种；20尾的相似性为91.34%95.74%，鉴定到属水平，定义为5个未命名物种，DNA条形码鉴定率为 93%。MEGA 7.0 分 析 表 明，946 条图1三峡库区鱼类采样点Fig.1Fish sampling sites in the Three Gorges Reservoir Area510贺杨等：DNA条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用CO基因序列中包含变异位点287个，简约信息位点273个，平均碱基组成T（28.7%）、C（27.8%）、A（25.3%）、G（18.2%），呈A+T偏倚性。在 K2P模型下，种内遗传距离为 03.39%，平均为0.36%，银飘鱼Pseudolaubuca sinensis的最大，为 3.39%（图 2）；属内种间遗传距离为 2.41%14.83%，平均为6.88%，洞庭小鳔Microphysogobio tungtingensis 与乐山小鳔Microphysogobio kiatingensis 之间的遗传距离最小，为 2.41%，光唇蛇Saurogobio gymnocheilus与蛇Saurogobio dabryi的最大，为14.83%；属间遗传距离为6.25%24.49%，平均为15.57%；科间遗传距离为13.70%26.68%，平均为19.97%。种间遗传距离是种内遗传距离的19.11倍（表1）。2.3系统发育与遗传多样性分析基于GTR+I+G模型构建的303条CO单倍型序列的贝叶斯系统进化树显示（图3），303条CO单倍型序列形成了71个分支，同种序列都形成了具有较高支持率的单分支（后验概率=1.00）。在属水平上，除黄颡鱼属Tachysurus未聚为一支外，其余54属在属水平上均各自聚为一支，支持率均为1.0。黄颡鱼属、属 Leiocassis 和拟鲿属 Pseudobagrus 聚为一支；在科水平上，鲤科的高体鳑鲏Rhodeus ocellatus、鳑鲏属未命名种Rhodeus sp.和大图2三峡库区捕获的71个物种的DNA条形码间隙Fig.2DNA barcoding gaps of 71 species captured in the Three Gorges Reservoir Area红线表示每个物种的平均种内距离，蓝线表示每个物种的最大种内遗传距离，黑线表示种间遗传距离中位数、最大值和最小值Red line represents the mean intraspecific genetic distance for each fish species，blue line represents the maximum intraspecific genetic distance for each fish species，black line represents the median interspecific genetic distances with maximum and minimum values511四川动物 2023 年 第 42 卷 第 5 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.5 2023鳍Acheilognathus macropterus 未聚在鲤科大支中；在目水平上，鲈形目 Perciformes 未聚成单系。结果显示，CO基因序列适用于物种水平上的分类，不适用于属及更高水平的分类。选取三峡库区优势物种鲢Hypophthalmichthys molitrix、蛇、贝氏Hemiculter bleekeri、光泽黄颡鱼Tachysurus nitidus、瓦氏黄颡鱼Tachysurus vachellii和短颌鲚 Coilia brachygnathus 进行遗传多样性分析（表2）。6种鱼类480尾标本中共有120个单倍型，单个物种的单倍型数目为216个。6种鱼类在不同采样地均存在共享单倍型，其中，短颌鲚的单倍型均为共享单倍型。遗传多样性分析显示，瓦氏黄颡鱼、鲢和蛇的核苷酸多样性较高，分别为0.012 9、0.010 5和0.008 4。贝氏、光泽黄颡鱼和短颌鲚的核苷酸多样性均小于0.002 7；最高的单倍型多样性出现在巴南的蛇种群（h=0.924），最高的核苷酸多样性出现在巴南的瓦氏黄颡鱼种群（=0.012 9），最低的核苷酸多样性和单倍型多样性均出现在短颌鲚万州种群（h=0.186，=0.000 3）。3讨论3.1DNA条形码在三峡库区鱼类物种鉴定中的有效性鱼类DNA条形码最重要的作用就是对鱼类鉴定进行分子水平上的辅助，弥补传统形态学鉴定方法的不足，发现或纠正传统分类学中隐含的错误，为有效利用鱼类资源、保护鱼类多样性提供科学依据（McCusker et al.，2013；Thomas et al.，2014；Wang et al.，2018；Shen et al.，2019）。本研究基于946条 DNA 条形码序列，与 NCBI和 BOLD 数据库比对，鉴定出71个物种，其中5个为未命名种，鉴定率93%，这可能是CO基因序列包含的遗传信息有限，无法对个别物种实现种水平的物种鉴定或这 5个未命名种的CO基因序列还未被数据库收录。Hebert等（2003）认为评价DNA条形码可行性的关键标准是种内遗传距离不得大于2%。本研究中，三峡库区鱼类种内遗传距离平均值为0.36%，高于北欧大陆架海洋鱼类（0.21%）（Thomas et al.，2014）、印度尼西亚石斑鱼科Epinephelidae物种（0.16%）（Fadli et al.，2021），但低于澳大利亚海洋鱼类（0.39%）（Ward et al.，2005）、墨西哥和危地马拉的淡水鱼类（0.45%）（Valdez-Moreno et al.，2009）、北美淡水鱼（0.73%）（April et al.，2011）、法属波利尼西亚、留尼汪岛和马达加斯加珊瑚礁海洋鱼类（1.06%）（Hubert et al.，2012）和青藏高原高原鳅属Triplophysa鱼类（2.9%）（Li et al.，2017），这可能与鱼类频繁的基因交流和环境同质性有关。本研究属内种间平均遗传距离（6.88%）是种内平均遗传距离（0.36%）的 19.11 倍，符合 Hebert 等（2003）提出的种间平均遗传距离必须大于种内遗传距离10倍以上的标准。最大种内遗传距离均显著小于其最小种间遗传距离，能形成明显的DNA条形码间隙；贝叶斯系统进化树中71种鱼类均形成各自的分支，且支持率较高。因此，利用线粒体CO基因作为 DNA条形码进行三峡库区鱼类物种鉴别是可行的。3.2DNA条形码在属及属水平以上分类不适用在鲿科鱼类研究中，黄颡鱼属、拟鲿属和属的属间分类一直存在争议。彭作刚等（2002）利用线粒体细胞色素b基因对东亚鲿科鱼类的系统发育研究表明，黄颡鱼属与属关系较为混乱；梁宏伟等（2018）利用线粒体CO基因对鲿科鱼类物种鉴定的研究中发现，鲿科黄颡鱼属、属和拟鲿属表1三峡库区捕获的71个物种在不同分类阶元间基于K2P的遗传距离Table 1Genetic distance of 71 species capturedin the Three Gorges Reservoir Area within various taxonomic levels based on K2P项目Item种内种间属间科间遗传距离Genetic distance平均值Average/%0.366.8815.5719.97最小值Minimum/%02.416.2513.70最大值Maximum/%3.3914.8324.4926.68SE00.0020.0070.009分类学分辨率Taxonomic resolution19.11512贺杨等：DNA条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用图3基于303条线粒体CO单倍型序列构建的贝叶斯系统发育树Fig.3Bayesian inference tree based on 303 mitochondrial CO haplotype sequences of fish species capturedin the Three Gorges Reservoir Area节点上的数字代表贝叶斯的后验概率，n代表单倍型数目Bayesian posterior probability is indicated at each node，n represents the number of the haplotypes513四川动物 2023 年 第 42 卷 第 5 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.5 2023鱼类在聚类上存在交叉现象，未能在属水平上形成属间分类。本研究结果显示，在贝叶斯系统进化树中黄颡鱼属的瓦氏黄颡鱼、光泽黄颡鱼、黄颡鱼、属的长吻、拟鲿属的细体拟鲿 Pseudobagrus pratti和拟鲿属未命名种聚成一支，对线粒体CO基因序列的分析结果也证实了黄颡鱼属的光泽黄颡鱼与属的长吻、拟鲿属的细体拟鲿亲缘关系较近且在属水平上利用线粒体CO基因序列无法对以上3个属进行准确的分类。在属及属水平以上没有准确的种群分类可能是由于线粒体CO基因序列的DNA条形码信息位点有限，在高级阶元时碱基置换趋于饱和未能解析更高分类水平的系统发育关系，提示需要探索更多兼具保守性和差异性的DNA序列来实现物种分类和鉴别（彭居俐等，2008）。3.3三峡库区鱼类遗传多样性核苷酸多样性指数和单倍型多样性指数是衡量一个物种群体遗传多样的重要指标（Vrijenhoek，1994）。遗传多样性越高，对环境的适应能力越强，其进化潜力就越强（王瑾瑾等，2014）。本研究中太平溪、箭滩河和万州的鲢种群、巴南和小江的瓦氏黄颡鱼种群、巴南和香溪河的蛇种群呈高的单倍型多样性和核苷酸多样性，可能是这些物种在其采样地拥有较稳定且持续壮大的种群或在种群演化过程中异域分化的谱系出现了二次交流，积累了大量的核苷酸突变。万州的蛇种群、巴南和万州的光泽黄颡鱼种群、巴南、太平溪和万州的贝氏种群呈较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，可能是这些种群在历史上经历了瓶颈效应，后来种群发生了快速扩张。太平溪和万州的短颌鲚种群呈较低的单倍型多样性和核苷酸多样性。据历史文献资料记载，短颌鲚主要分布在长江及淮河流域的中下游地区，及与长江流域相通的淡水湖泊（袁传宓，秦安舲，1984），截至2015年未见短颌鲚在三峡库区分布的记录（杨丽亚等，2022）。三峡大坝的建立使三峡库区由急流水生境变为缓流水生境（Gao et al.，2010），迫使喜急流鱼类向上游迁移，原有鱼类的繁殖和摄食也受到影响，造成库区生态位空缺（陈辙聿等，2022），为短颌鲚提供了适宜的栖息生境，三峡库区的短颌表2三峡库区捕获样本的遗传多样性信息Table 2Genetic diversity of fish species captured in the Three Gorges Reservoir Area物种Species鲢Hypophthalmichthys molitrix蛇Saurogobio dabryi贝氏Hemiculter bleekeri光泽黄颡鱼Tachysurus nitidus瓦氏黄颡鱼Tachysurus vachellii短颌鲚Coilia brachygnathus采样地Sampling site箭滩河太平溪万州巴南香溪河万州巴南太平溪万州巴南太平溪万州巴南小江太平溪万州样本量Sample size30303030303030303030303030303030单倍型数目No.ofhaplotypes（Nh）149111416111681485914922单倍型多样性Haplotypediversity（h）0.8530.8390.8230.9240.9150.7660.9030.7520.8620.7790.3590.6530.9100.7560.2870.186核苷酸多样性Nucleotidediversity（）0.010 50.006 90.008 60.008 40.005 10.003 40.002 70.001 80.002 40.002 40.001 10.002 50.012 90.006 60.000 50.000 3514贺杨等：DNA条形码在三峡库区鱼类多样性研究中的应用鲚种群可能是中下游的短颌鲚种群通过葛洲坝、三峡大坝船闸扩散到三峡库区形成的新种群（Yang et al.，2019；Zhai et al.，2022）。为防止三峡库区鱼类遗传多样性遭到更严重破坏，应对短颌鲚等外来入侵种群开展科学动态监测和风险评估等相关研究，以期为库区鱼类种群生物多样性保护和资源种群的科学管理提供技术支撑。参考文献:陈辙聿，陶怡曦，叶勤，等.2022.三峡库区短颌鲚（Coilia brachygnathus）新建种群的年龄结构、生长特征及遗传多样性分析 J.海洋与湖沼，53（2）：430-439.丁瑞华.1994.四川鱼类志 M.成都：四川科学技术出版社.董纯，杨志，龚云，等.2019.三峡库区干流鱼类资源现状与物种多样性保护 J.水生态学杂志，40（1）：15-21.郜星晨，姜伟.2021.三峡库区常见鱼类DNA条形码本地BLAST 数据库的构建和应用 J.基因组学与应用生物学，40（5）：1952-1960.梁宏伟，孟彦，罗相忠，等.2018.线粒体CO基因条形码在鲿科鱼类物种鉴定中的应用 J.中国水产科学，25（4）：772-782.彭居俐，王绪桢，何舜平.2008.DNA条形码技术的研究进展及其应用 J.水生生物学报，32（6）：916-919.彭作刚，何舜平，张耀光.2002.细胞色素b基因序列变异与东亚鲿科鱼类系统发育 J.自然科学进展，12（6）：596-600.王瑾瑾，童金苟，张耀光，等.2014.厚颌鲂两个野生群体遗传多样性分析 J.水生生物学报，38（5）：975-979.魏念，张燕，吴凡，等.2021.三峡库区鱼类群落结构现状及变化 J.长江流域资源与环境，30（8）：1858-1869.吴强，段辛斌，徐树英，等.2006.长江三峡库区蓄水后鱼类资源现状 J.淡水渔业，37（2）：71-75.伍献文，曹文轩，易伯鲁，等.1982.中国鲤科鱼类志M.上海：上海科学技术出版社.袁传宓，秦安舲.1984.我国近海鲚鱼生态习性及其产量变动状况 J.海洋科学，7（5）：35-37.杨丽亚，吕红健，付梅，等.2022.三峡库区短颌鲚年龄和生长特性的研究 J.水生生物学报，46（1）：17-28.杨志，唐会元，朱迪，等.2015.三峡水库175 m试验性蓄水期库区及其上游江段鱼类群落结构时空分布格局J.生态学报，35（15）：5064-5075.邹家祥，翟红娟.2016.三峡工程对水环境与水生态的影响及保护对策 J.水资源保护，32（5）：136-140.April J，Mayden RL，Hanner RH，et al.2011.Genetic calibration of species diversity among North America s freshwater fishes J.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，108（26）：10602-10607.Chen WT，Ma XH，Shen YJ，et al.2015.The fish diversity in the upper reaches of the Salween River，Nujiang River，revealed by DNA barcoding J.Scientific Reports，5（5）：17437-17449.Fadli N，Muchlisin ZA，Siti-Azizah MN.2021.DNA barcoding of commercially important groupers（Epinephelidae）in Aceh，Indonesia J/OL .Fisheries Research，234（2）：105796 2022-11-21 .https：/doi.org/10.1016/j.fishres.2020.105796.Fan XG，Wei QW，Chang Jb，et al.2006.A review on conservation issues in the upper Yangtze Rivera last chance for a big challenge：can Chinese paddlefish（Psephurus gladius），Dabry s sturgeon J.Journal of Applied Ichthyology，22（1）：32-39.Gao X，Fujiwara M，Winemiller KO，et al.2019.Regime shift in fish assemblage structure in the Yangtze River following construction of the Three Gorges Dam J.Scientific Reports，9（1）：4212-4223.Gao X，Zeng Y，Wang JW，et al.2010.Immediate impacts of the second impoundment on fish communities in the Three Gorges ReservoirJ.Environmental Biology of Fishes，87（6）：163-173.Hebert PD，Ratnasingham S，deWaard JR.2003.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species J.Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences，270（Suppl 1）：S96-S99.Hubert N，Meyer CP，Bruggemann HJ，et al.2012.Cryptic diversity in Indo-Pacific coral-reef fishes revealed by DNA-barcoding provides new support to the centre-of-overlap hypothesis J/OL.PLoS ONE，7（3）：e28987 2022-11-21.515四川动物 2023 年 第 42 卷 第 5 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.5 2023https：/doi.org/10.1371/journal.pone.0028987.Khedkar GD，Jamdade Rl，Naik S，et al.2014.DNA barcodes for the fishes of the Narmada，one of India s longest rivers J/OL.PLoS ONE，9（7）：e101460 2022-11-21.https：/doi.org/10.1371/journal.pone.0101460.Kumar S，Stecher G，Tamura K.2016.MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasetsJ.Molecular Biology and Evolution，33（7）：1870-1874.Li JX，Wang Y，Jin HF，et al.2017.Identification of Triplophysa species from the Qinghai-Tibetan Plateau（QTP）and its adjacent regions through DNA barcodes J.Gene，605（5）：12-19.Librado P，Rozas J.2009.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism dataJ.Bioinformatics，25（11）：1451-1452.McCusker MR，Denti D，Van GL，et al.2013.Barcoding Atlantic Canada s commonly encountered marine fishesJ.Molecular Ecology Resources，13（2）：177-188.Nelson JS，Grande TC，Wilson MVH.2016.Fishes of the world，5nd edn M.Hoboken：John Wiley&Sons.Ronquist F，Teslenko M，Mark VD，et al.2012.MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model J .Systematic Biology，61（3）：539-542.Shen YJ，Hubert N，Huang Y，et al.2019.DNA barcoding the ichthyofauna of the Yangtze River：insights from the molecular inventory of a mega-diverse temperate fauna J.Molecular Ecology Resources，19（5）：1278-1291.Suchard MA，Lemey P，Baele G，et al.2018.Bayesian phylogenetic and phylodynamic data integration using BEAST 1.10J/OL.Virus Evolution，4（1）：vey0162022-11-21.https：/do