MicRNA-126与肝癌细胞增殖、凋亡的关系研究.pdf

388MicRNA-126与肝癌细胞增殖、凋亡的关系研究李宁，崔中锋，李璨*（河南省传染病医院，河南郑州450 0 0 0）摘要：目的分析探究micRNA-126与肝癌细胞增殖、调亡的关系，并筛查作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PL C、H u h 7 以及人肝细胞株L02,将HepG2、M H CC9 7-L 细胞随机分为micRNA-126mimics组（转染mi-cRNA-126mimics）、m i c R NA-12 6 NC 组（转染阴性对照序列)和control 组（不转染任何序列）,RT-PCR法检测人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PL C、H u h 7 中micRNA-126表达水平以及过表达micRNA-126后HepG2、M H CC9 7-L 中micRNA-126表达水平，MTT法检测HepG2、M H CC9 7-L 细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡能力，Westernblot法检测PIK3R2、PI3K、PD K 1、A K T、p-PI3K、p-PD K 1、P-A K T 蛋白水平，建立裸鼠皮下成瘤模型并观察过表达micRNA-126对肿瘤生长的影响，生物信息学软件预测micRNA-126与PIK3R2的靶向关系，采用荧光素酶实验进一步验证micRNA-126与PIK3R2的靶向关系。结果人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PL C、H u h 7 中micRNA-126表达水平显著低于人肝细胞株L02,且差异有统计学意义（P0.05);micRNA-126mimics 组HepG2、M H CC9 7-L 细胞中micRNA-126表达水平显著高于control组和mi-cRNA-126NC组,且差异有统计学意义(P0.05)；M T T 法检测结果显示，在2 4h、48 h、7 2 h 以及9 6 h时,micRNA-126mim-ics组HepG2、M H CC9 7-L 细胞增殖率显著高低于control组和micRNA-126NC组,且差异均有统计学意义(P0.05);流式细胞术检测结果显示,micRNA-126mimics 组HepG2、M H CC9 7-L 细胞调亡率显著高于control组和micRNA-126NC 组,且差异均有统计学意义(P0.05);过表达组裸鼠肿瘤体积显著小于阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05);micRNA-126mim-ics组PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PD K 1/PD K 1、P-A K T/A K T 蛋白表达水平显著低于control组和micRNA-126NC组（P0.05）；PIK3R2为肝癌细胞中micRNA-126的靶基因,与转染WT荧光素酶质粒mimic NC组相比,共转染WT荧光素酶质粒micR-NA-126mimic组荧光素酶活性显著降低（P0.05）。结论肝癌细胞中micRNA-126下调表达,肝癌细胞中PIK3R2可能是micRNA-126的潜在靶基因,micRNA-126可能靶向负调控PIK3R2表达，抑制肝癌细胞增殖及促进其调。关键词：肝癌；细胞增殖；细胞调亡中图分类号：R735.7D0I:10.3969/j.issn.1674-1129.2023.04.003Study on relationship between micRNA-126 and proliferation and apoptosis of liver cancer cells LI Ning,CUI Zhongfeng,LI Cheng.Henan Infectious Disease Hospital,Henan,Zhengzhou 450000,China.Abstract:Objective To analyze the relationship between micRNA-126 and proliferation and apoptosis of liver cancer cells,and to explore the role mechanism.Methods Human liver cancer cell lines HepG2,MHCC97-L,PLC and Huh7 and human livercell line L02 were cultured in vitro,and HepG2 and MHCC97-L cells were randomly divided into micRNA-126 mimics group(transfected with micRNA-126 mimics),micRNA-126 NC group(transfected with negative control sequence)and control group(not transfected with any sequence).RT-PCR method was used to detect the expression level of micRNA-126 in HepG2,MHCC97-L,PLC and Huh7 and the expression level of micRNA-126 in HepG2 and MHCC97-L after overexpression of micR-NA-126.MTT method was applied to detect the proliferation ability of HepG2 and MHCC97-L cells and flow cytometry was usedto detect the apoptosis ability.Westerm blot was used to detect the protein levels of PIK3R2,PI3K,PDK1,AKT,p-PI3K,p-PDK1 and p-AKT.A subcutaneous tumor model of nude mice was established to observe the effect of overexpression of micRNA-126 on tumor growth.Bioinformatics software was applied to predict the targeting relationship between micRNA-126 and PIK3R2.Luciferase assay was used to further verify the targeting relationship between micRNA-126 and PIK3R2.Results The expressionlevel of micRNA-126 in human liver cancer cell lines HepG2,MHCC97-L,PLC and Huh7 was significantly lower than that inhuman liver cell line L02(P0.05).The expression level of micRNA-126 in HepG2 and MHCC97-L cells in micRNA-126 mim-基金项目：唾液micRNA-126在肝癌早期诊断和预警作用的研究，编号LHGJ20191098作者简介：李宁，男，本科。职称：主管技师。科室：输血科。研究方向：医学检验。通讯作者：李璨实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine,Aug.2023,Vol.41,No.4论著文献标识码：A文章编号：16 7 4-112 9(2 0 2 3)0 4-0 38 8-0 7实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory MedicineAug.2023,Vol.41,No.4ics group was significantly higher than that in control group and micRNA-126 NC group(P0.05).MTT results showed that at 24h,48 h,72 h and 96 h,the proliferation rate of HepG2 and MHCC97-L cells in micRNA-126 mimics group was significantlyhigher than that in control group and micRNA-126 NC group(P0.05).Flow cytometry showed that the apoptosis rate of HepG2and MHCC97-L cells in micRNA-126 mimics group was significantly higher than that in control group and micRNA-126 NCgroup(P0.05).The tumor volume of nude mice in overexpression group was significantly smaller than that in negative controlgroup(P0.05).The protein expression levels of PIK3R2,p-PI3K/PI3K,p-PDK1/PDK1 and p-AKT/AKT in micRNA-126 mimicsgroup were significantly lower than those in control group and micRNA-126 NC group(P0.05).PIK3R2 was the target gene ofmicRNA-126 in liver cancer cells.Compared with mimic NC group transfected with WT luciferase plasmid,luciferase activity wassignificantly decreased in micRNA-126 mimic NC group transfected with WT luciferase plasmid(P0.05).Conclusion The expression of micRNA-126 is down-regulated in liver cancercells,and PIK3R2 in liver cancer cells may be a potential target gene of micRNA-126.micRNA-126 may targeting negativelyregulate the expression of PIK3R2,inhibit the proliferation and promote the apoptosis of liver cancer cells.Key words:Liver cancer;micRNA-126;Cell proliferation;Apoptosis;PIK3R2肝癌是世界上第五大最常见的癌症，也是全球第三大与癌症相关的死亡原因叫。尽管近年来在肝癌诊断和治疗方面取得了不错的进展，但肝癌患者长期预后仍然很差，晚期肝癌患者5年生存率低于5%2。证据表明,肝内复发和转移是影响肝癌患者预后不良的危险因素3。但肝癌复发和转移的分子机制尚未完全阐明。肝癌发生和发展与包括microRNAs在内的多种基因有关。microRNA是一类长度为2 1 2 5个核苷酸的内源性小RNA,可在转录后水平或翻译水平上负调控基因表达，从而参与调控细胞增殖、调亡、迁移和侵袭等多种细胞生物学过程4。研究显示,micRNA-126 在胃癌 、肺癌、前列腺癌 7 等多种肿瘤中下调表达,可能发挥抑制肿瘤发生和发展的作用。亦有文献报道，micRNA-126在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织和正常组织，且micRNA-126低表达是影响肝癌患者预后不良的独立因素 8 。但有关micRNA-126影响肝癌细胞生物学功能作用的报道较少。本研究旨在分析探讨micRNA-126对肝癌细胞增殖、调亡的影响及其相关机制,现详细报告如下。1材料与方法1.1动物和细胞株16 只BALB/c裸鼠(4 5周龄）购买自上海斯莱克实验动物有限公司，体质量16 22g，实验动物合格证号：SYXK（沪）2 0 19-0 0 0 8，人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PL C、H u h 7 以及人肝细胞株L02购买自中国科学院上海细胞库，micRNA-126 mimics 和micRNA-126 NC 均购买自上海吉玛制药技术有限公司。1.2试剂和仪器胎牛血清、胰蛋白酶消化液、389.DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液（批号或货号分别为：SV30184.02、J16 0 0 30、A B2 16 49 6.SV30 0 10。美国Hyclone公司）;MTT、二甲基亚矾（批号或货号分别为：30 3H0523、D 8 37 1。北京索莱宝科技有限公司）；转染试剂Lipofectamine3000（批号或货号：L3000-015。美国Invitrogen公司）；蛋白酶抑制剂（批号或货号：P7626。美国Sigma公司）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号或货号：A211-01。南京诺唯赞生物科技有限公司）;PrimeScriptTMRTreagent试剂盒（批号或货号：RR037A。日本Takara 公司）;LightCycler 480 SYBR Green IMas-ter试剂盒（批号或货号：48 8 7 352 0 0 1。Roche公司）;RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（批号或货号分别：R0010、PC0 0 2 0。北京索莱宝科技有限公司）;ECL化学发光试剂盒（批号或货号：P0018M。杭州碧云天生物技术研究所）；羊抗PIK3R2、PI3K,PDK1、A K T、p-PI3K、p-PD K 1、p-A K T、G A PD H抗体（批号或货号分别为：PA5-101022、M A 1-74183、M A 5-157 9 7、M A 5-149 16,PA 5-10 48 53、PA5-104700、44-6 2 1G、M A 5-157 38-D 6 8 0,T h e r m oFisher公司）；辣根过氧化酶标记二抗（批号或货号：bs-40296G。北京博奥森生物技术有限公司）；CO2细胞培养箱（型号：HF151UV。上海力新仪器有限公司）；紫外分光光度计（型号：Q5000。美国Quawell公司）；流式细胞仪（型号：FACScantoII。美国BectonDickinson公司）；实时荧光定量PCR仪（型号：FTC-3000。上海枫岭生物技术有限公司）；蛋白印迹电泳仪（型号：PowerPacTMHC。美390.国Bio-Rad公司）。1.3方法1.3.1细胞培养将人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PL C、H u h 7 和人肝细胞株L02置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中于37、5%的CO2细胞培养箱中进行培养,每1 2 d传代一次。1.3.2总RNA提取、逆转录以及RT-PCR检测收集对数生长期的人肝癌细胞株HepG2、M H CC9 7-L、PLC、H u h 7 和人肝细胞株 L02,加入1mL Trizol溶液，上下颠倒混匀,并以1:1比例加入氯仿,再加入500L提前预冷异丙醇,提取总RNA。于2 6 0 nm和2 8 0 nm处测定吸光度，并使用PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒将RNA逆转录成 cDNA。将所得cDNA稀释5 50 倍进行RT-PCR反应（反应体系：上游、下游引物0.5L,SYBRGREEN0.3L,2xTaq Master Mix 10.0 L,cDNA 1.0 L，加无RNase水至2 0.0 L。反应程序:9 5、5min,预变性;9 5、10 s,变性,6 0,2 0 s,复性,7 2、15s,延伸,40 个循坏;7 2、5min延伸，以U6为内参基因,引物序列:F:5-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3,R:5-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3，引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，实验重复三次，目的基因micRNA-126mRNA相对表达水平采用2-AA法进行计算。1.3.3细胞转染当HepC2、M H CC9 7-L 细胞密度长至8 0%9 0%时，弃液，并使用PBS磷酸缓冲液冲洗；加人0.2 5%胰蛋白酶消化液进行消化，收集细胞混合液，10 0 0 rpm离心5min；弃液，加人新鲜完全培养基重悬细胞,以每孔1x105个细胞接种至6 孔细胞板中，置于37、5%的COz细胞培养箱中进行培养。第二天，观察细胞生长状态良好，用移液枪轻轻吸走培养液，加人不含胎牛血清的DMEM培养基,分别转染micRNA-126 mimics(mi-cRNA-126 mimics 组)和 micRNA-126 NC(micR-NA-126 NC 组）,control 组不转染任何序列，置于37、5%的COz细胞培养箱中培养4h；用移液枪轻轻吸走培养液，并加人含有10%胎牛血清的DMEM培养基,放回CO,细胞培养箱中继续培养。1.3.4MTT检测肝癌细胞增殖能力分别取510 3个HepG2、M H CC9 7-L 细胞接种至9 6 孔细胞板中,设置6 个复孔，培养至细胞贴壁开始转染mi-cRNA-126mimics 和micRNA-126NC。同时设置空白对照组，置于37、5%的CO细胞培养箱中实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine，A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4培养，于2 4h、48 h、7 2 h 以及9 6 h时进行MTT检测,具体操作为：分别于2 4h、48 h、7 2 h 以及9 6 h时用移液枪轻轻吸走培养液，加入10 0 l新鲜DMEM培养基+10 LMTT混合液（浓度为5mg/mL),置于37、5%的CO,细胞培养箱中培养4h；用移液枪轻轻吸走培养液,并加150 L二甲基亚砜，避光静置10 min，于450 nm处测定吸光度。1.3.5流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡能力分别取生长至8 0%9 0%的HepG2、M H CC9 7-L 细胞接种至6 孔细胞板中，设置6 个复孔，当细胞生长至密度为8 0%9 0%时进行转染，操作同1.3.3；转染48 h，弃液,PBS冲洗，加人0.2 5%胰蛋白酶消化液消化细胞,收集细胞混合液并离心，调整细胞密度为1x105个细胞,PBS冲洗两次；各组细胞分别加人50 0LBindingBuffer，吹打混匀；再分别加人5LAnnexin V-FITC、5 L PI,避光孵育15 min;取1x106个细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.3.6RT-PCR检测转染前后micRNA-126表达水平转染48 h,取对数生长期细胞提取总RNA,检测各组micRNA-126表达水平，具体操作同1.3.2。1.3.7Westernblot检测调亡相关蛋白表达转染48h,取各组对数生长期细胞,加入1mL蛋白裂解液(蛋白酶抑制剂:RIPA裂解液=1:1),置于冰上裂解30 min,12000rpm离心5min，取上清转移至新的离心管中，测定蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，取40 g蛋白样品进行SDS-PACE电泳，设置初始电压为8 0 V,大约电泳30 min，见待溴酚蓝指示带到达分离胶时，调整电压为12 0 V，继续电泳2h，直至溴酚蓝指示带电泳至分离胶底部。根据目的分子条带切取凝胶，并准备相应大小的硝酸纤维素膜,使用“三明治”夹转膜,设置恒定电流2 0 0mA,时间为1.5h。使用TBST配制的5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h,再分别加入一抗(PIK3R2、PI3K、PDK1、A K T、p-PI3K、p-PD K 1、P-A K T、G A PD H)4孵育过夜,然后加人二抗孵育2 h;在避光条件下混匀ECL化学发光液A液和B液，使用移液枪均匀地滴加至硝酸纤维素膜上,静置5min,曝光显影，并置于显影仪中拍照，采用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer)软件测定各蛋白灰度值，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。1.3.8裸鼠成瘤实验16 只BALB/c裸鼠随机分为过表达组和阴性对照组,转染 micRNA-126 mimics实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine,Aug.2023,Vol.41.,No.4和micRNA-126NC 的HepG2细胞培养48 h,经0.25%胰蛋白酶消化液消化，制成细胞密度为11013个/L的细胞悬液，取10 0 L分别从两组裸鼠腋下注射,每组各8 只，每周测量裸鼠皮下肿瘤体积,计算公式为体积=（肿瘤最长径肿瘤最短径)2x0.5,观察6 周后处死小鼠,称重。1.3.9生物信息学预测采用miRwalk2.0（h t t p:/zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)网站预测micRNA-126可能的作用靶点。1.3.10micRNA-126与PIK3R2的靶向关系验证采用荧光素酶实验进一步验证micRNA-126与PIK3R2的靶向关系，体外合成含micRNA-126与PIK3R23UTR碱基互补区域的DNA片段（WT)及含该位点突变体的DNA片段（MUT),并克隆至双荧光素酶启动子载体，将质粒转染到micRNA-126 细胞和mimics 细胞,培养48 h,采用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。1.4统计学方法数据分析处理应用SPSS20.0统计学软件进行，计量资料实验结果采用（x土s）表示，多组组间数据对比首先进行正态性检验和方差齐性检验，方差齐性采用单因素方差分析（one-wayANOVA）,多组两两对比采用LSD法,P0.05,为差异有统计学意义。2结果2.1 RT-PCR 检测micRNA-126 在肝癌细胞中的表达通过检测micRNA-126在人肝癌细胞株HepG2、M H C C 9 7-L、PL C、H u h 7 以及人肝细胞株L02中的表达,micRNA-126在人肝癌细胞株HepG2、M H C C 9 7-L、PL C、H u h 7 中的表达水平显著低于人肝细胞株L02中的表达水平，差异有统计学意义(P0.05)。见图1。2.2RT-PCR检测转染前后micRNA-126表达水平的变化RT-PCR检测结果显示,micRNA-126mimics 组HepG2、M H CC9 7-L 细胞中 micRNA-126表达水平显著高于control组和micRNA-126NC组,差异有统计学意义(P0.05)。见图2。2.3MTT法检测过表达micRNA-126对肝癌细胞增殖的影响MTT法检测结果显示,在2 4h、48 h、72 h 以及 9 6 h 时,micRNA-126 mimics 组 HepG2、MHCC97-L细胞增殖率均显著高低于control组和micRNA-126NC组,差异有统计学意义(F=12.167，F=6.771,F=17.073,F=38.671;F=17.182,F=18.590,F=12.604,F=32.876,P0.05)。见图 3。3911.571.00.50.0L02图1micRNA-126在人肝癌细胞和人肝细胞中的表达水平注：与人肝细胞株L02比较，P0.05。ABHepG2*#3图2 转染mimics后HepG2、M H CC9 7-L细胞中micRNA-126表达水平注：与control组比较,P0.05；与micRNA-126NC组比较,P0.05。2.4流式细胞术检测过表达micRNA-126对肝癌细胞调亡的影响流式细胞术检测结果显示,mi-AcotolmmCKNA-126NCtmickNA-126mimicsE272HepG2图3MTT法检测过表达micRNA-126对肝癌细胞增殖能力的影响注：与control 组比较,*P0.05;与micRNA-126 NC组比较,P0.05cRNA-126 mimics 组 HepG2、M H CC9 7-L 细胞调亡率均显著高于control组和micRNA-126NC组，差异有统计学意义(P0.05)。见图4。2.5过表达micRNA-126对裸鼠移植瘤生长的影PLCHepG2MHCC97-LB96h24hHuh7MHCC97-L-miRNA-126NCELieRNA-126mimikct472hMHCC97-L*#392.A实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4AKT蛋白表达水平显著低于control组和micR-B1510F*#NA-126 NC 组(P0.05)。见图 6。AP-P3KPBKP-PDK1PDK1P-AKTAKTPIK3R2GAPDHBE8ap-PI3K/PI3Kp-PDK1/PDK1c p-Akt/Akt口PIK3R215rDC图4过表达micRNA-126对肝癌细胞凋亡的影响注：与control 组比较,P0.05；与micRNA-126 NC 组比较,tP0.05;A、B为HepG2细胞调亡实验结果;C、D 为MHCC97-L细胞亡实验结果。响过表达组裸鼠肿瘤体积显著小于阴性对照组，差异有统计学意义(P0.05）。见图5。0.50.410.30.20.101图5裸鼠皮下成瘤模型肿瘤体积变化2.6micRNA-126靶向抑制PIK3R2蛋白表达并调控PI3K/PDK1/AKT信号通路micRNA-126mim-ics 组PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PD K 1/PD K 1、p-A K T/图6 Westernblot检测PIK3R2、PI3K、PD K 1、A K T、工p-PI3K、p-PD K 1、p-A K T 蛋白表达10注：与control组比较,P0.05；与micRNA-126 NC 组比较,#P0.05。2.7肝癌细胞中PIK3R2是micRNA-126的靶基因通过生物信息学预测工具（miRwalk2.0网站）发现,PIK3R2是micRNA-126的潜在靶点,micR-NA-126与PIK3R23UTR区域碱基互补,PIK3R2为肝癌细胞中micRNA-126 的靶基因。见图 7。Wildtype3UTR5mir-1263MutanttYpe3UTR5.GAGGCAGGUUUUGUAACCCGGCU.图7 生物信息学预测PIK3R2为micRNA-126的靶基因2.8 micRNA-126与PIK3R2的靶向关系与转染WT荧光素酶质粒mimic NC组相比，共转染WT荧光素酶质粒micRNA-126mimic组荧光素酶活性显著降低(P0.05),micRNA-126可靶向负调控PIK3R2。见图 8。3讨论各种microRNAs在肝癌中的发病机制中发挥着重要的作用,microRNAs可通过调控其靶基因参与肝癌发生和发展。MicroRNA-23a可抑制肝癌细23时间（周）.GAGGCAGGUUUUGUACGGUACGU.,GCGUAAUAAUGAGUGCCADGCU4511111116胞MHCC97H细胞生长和增殖，并通过下调KIAP诱导MHCC97H细胞调亡 。Liu等 10 证明microR-NA-222抑制剂靶向BBC3抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制肝癌细胞调亡。Yu等 发现miR-195通过靶向YAP来抑制肝癌细胞转移和上皮间充质转换。故microRNA可能作为预测肝癌进展的新型生物标志物。实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory MedicineAug.2023,Vol.41,No.41.571.0-0.5-0.0图8 荧光素酶实验验证micRNA-126与PIK3R2的靶向关系注:与mimic组相比,P0.05。大量研究表明,micRNA-126可能是多种肿瘤患者的调节因子和预后生物标志物 12-15。Nie等 16 文献报道指出，与癌旁正常组织相比，micRNA-126在食管鳞状细胞癌组织中表达显著降低，EC109细胞中micRNA-126过表达可抑制细胞增殖和迁移。过表达micRNA-126可抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭，并可能通过调节PI3K/PDK1/AKT途径诱导 HeLa 细胞凋亡 7 。Zhang等 18 研究也表明,micRNA-126在卵巢癌中显著下调,micRNA-126下调表达提示患者预后不良，其表达恢复则可明显抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移,其可能与调节表皮生长因子样结构域7 以及ERK/MAPK信号通路和上皮间充质转换有关。本研究结果显示，肝癌细胞中micRNA-126表达水平显著下调,与既往报道结果一致 19 。本研究中体外实验结果发现，micRNA-126过表达可显著抑制肝癌细胞HepG2、MHCC97-L细胞增殖,促进细胞调亡,提示micR-NA-126可能是通过抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞调亡影响肝癌发生和发展，从而在肝癌细胞中发挥抑癌功能。同时,裸鼠皮下成瘤模型实验结果显示，micRNA-126过表达可明显抑制裸鼠皮下肿瘤生长，进一步证明micRNA-126在肝癌中起着抑癌作用。彭吉祥等 2 0 也认为,micRNA-126过表达可抑制肝癌细胞HepG2细胞增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞调亡,并抑制裸鼠皮下成瘤模型肿瘤生长。故micRNA-126可能是调控肝癌发393.生和发展的重要影响因素。mimicNCPIK3R2编码PI3K蛋白，PI3K/Akt信号通路micRNA-126mimic是与细胞生长密切相关的通路之一 2 1。PI3K是由调控亚基(P85、P8 5、P8 5)和催化亚基(P110)组成的复合物,其产物 PIP2 和PIP3均是细胞内重要的第二信使,并在细胞增殖、调亡以及代谢过程中发挥着重要作用 2 。PI3K被激活后,可使得细胞膜上的肌醇磷酸化,进而产生PIP3,PIP3则与Akt结合并使其活化，活化的Akt可调控细胞色素C以及凋亡因子的释放,最终抑制细胞调亡 2 3。本研究通过生物信息学预测分析micRNA-126可能的靶基因，结果显示，micRNA-126与PIK3R23UTR区域碱基互补,PIK3R2为肝癌细胞中micRNA-126的靶基因。进一步荧光素酶实验验证发现，micRNA-126能够抑制野生型PIK3R2细胞活性，且并不抑制突变型PIK3R2细胞活性,提示micR-NA-126可靶向负调控PIK3R2表达。Westernblot检测结果显示,micRNA-126mimics组PIK3R2、p-PI3K/PI3K、p-PD K 1/PD K 1、P-A K T/A K T 蛋白表达水平显著低于control组和micRNA-126NC组。提示micRNA-126可能是通过与PIK3R2mRNA3UTR区域结合，诱导PIK3R2基因mRNA序列降解，从而抑制PIK3R2蛋白合成，从而抑制PI3K/PDK1/AKT信号通路,最终促进肝癌细胞调亡。具体而言，一方面micRNA-126通过作用于PI3K抑制PDK1,使得AKT磷酸化，进一步激活下游信号通路中GSK3、c y c l i n D 1、p 7 0 S6 K 和S6，最终调控细胞增殖；另一方面micRNA-126通过作用于PI3K抑制PDK1，使得AKT磷酸化，从而抑制Bad、Bc l-x L、Ba x 以及激活Caspase-3/7，最终促进细胞凋亡 2 4。Wu等 2 5 研究也发现,micRNA-126通过靶向PIK3R2抑制骨肉瘤细胞增殖。除此之外，有报道 2 6 指出,PLK-4也可能是micRNA-126的靶基因,miRNA-126/PLK-4轴以及 ATR/CHEK 1通路的激活是肝癌发生和发展的关键,PLK-4/ATR/CHEK 1通路可能是肝癌治疗的潜在靶点。总而言之，这些研究为进一步理解肝癌发生和发展的机制提供了依据，但micRNA-126影响肝癌细胞生物学功能作用有待继续深入研究。综上所述，肝癌细胞中micRNA-126下调表达,过表达micRNA-126可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌调亡,抑制裸鼠皮下成瘤模型肿瘤生长,肝癌细胞中PIK3R2是micRNA-126的潜在靶基因，,394micRNA-126可能靶向负调控PIK3R2表达，抑制肝癌细胞增殖及促进其凋亡，可为进一步研究PIK3R2在肝癌中的作用奠定理论基础,对开发肝癌治疗新药具有一定指导意义。参考文献1Jli DG,Jiang CW,Luo X,et al.MicroRNA-23a induces apoptosisof hepatocarcinoma cell line MHCC97H via down-regulating KI-AP:a mechanism studyJ.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2018,22(18):58995905.2JHan S,Han B,Li Z,et al.Downregulation of long noncoding RNACRNDE suppresses drug resistance of liver cancer cells by in-creasing microRNA-33a expression and decreasing HMGA2 ex-pressionJ.Cell Cycle,2019,18(19):2524-2537.3吕少诚,潘冰,李立新,等.原发性肝癌肝移植患者预后评价及相关影响因素分析 J.中华肝胆外科杂志,2 0 19,2 5(7):49 3-49 6.4JOura K,Morishita A,Masaki T.Molecular and Functional Roles ofMicroRNAs in the Progression of Hepatocellular Carcinoma-A Re-viewJJ.Int J Mol Sci,2020,21(21):8362.5JFeng R,Chen X,Yu Y,et al.miR-126 functions as a tumour sup-pressor in human gastric cancerJ.Cancer Lett,2010,298(1):50-63.6Liu B,Peng XC,Zheng XL,et al.MiR-126 restoration down-regu-late VECF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitroand in vivoJ.Lung Cancer,2009,66(2):169-75.7JHua Y,Liang C,Miao C,et al.MicroRNA-126 inhibits prolifera-tio