IL-34在表皮生长因子受体突变肺腺癌中的表达及其预后评估价值.pdf

中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期 Chinese Journal of Clinical Medicine，2023，Vol.30，No.3421论 著DOI：10.12025/j.issn.1008-6358.2023.20230601收稿日期 2023-04-09 接受日期 2023-05-31基金项目 国家自然科学基金（82100043）.Supported by National Natural Science Foundation of China(82100043).作者简介 季诗梦，博士，住院医师.E-mail：*通信作者(Corresponding author).Tel:[phone]，E-mail：IL-34 在表皮生长因子受体突变肺腺癌中的表达及其预后 评估价值季诗梦1,2,3，蒋家好4，胡 洁1,2,3，宋元林1,2,3*1.复旦大学附属中山医院呼吸与危重症医学科，上海 2000322.上海市老年医学中心呼吸与危重症医学科，上海 2011043.上海市呼吸病研究所，上海 2000324.复旦大学附属中山医院胸外科，上海 200032引用本文 季诗梦，蒋家好，胡 洁，等.IL-34 在表皮生长因子受体突变肺腺癌中的表达及其预后评估价值 J.中国临床医学,2023,30(3):421-425.JI S M,JIANG J H,HU J,et al.The expression and prognostic value of IL-34 in lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor mutationJ.Chin J Clin Med,2023,30(3):421-425.摘要 目的 检测白介素 34（interleukin-34，IL-34）在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的肺腺癌患者中的表达水平，探讨其对该类肺腺癌患者预后的评估价值。方法 收集 2015 年 7 月至 2017 年 12月在复旦大学附属中山医院诊治的 144 例术前未接受抗肿瘤治疗的 EGFR 突变肺腺癌患者的手术切除标本及其临床资料。通过免疫组织化学染色，检测IL-34 在肺癌组织及正常肺组织中的表达情况。用Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险模型分析IL-34与患者预后的关系。结果 IL-34在EGFR突变的肺腺癌患者的肿瘤组织中相对高表达，在正常肺组织中低表达。随访 64（42,73）个月，IL-34 高表达组患者（n93）总生存率低于低表达组（n51，P0.006），累积复发率高于低表达组（P0.011）。Cox 比例风险模型示，IL-34 表达为患者总生存（HR2.218,P0.015）及复发的独立预测因素（HR 2.486,P0.018）。结论 IL-34 升高可能提示 EGFR 突变肺腺癌患者术后预后较差。关键词 白介素 34；肺腺癌；表皮生长因子受体；预后中图分类号 R 734.2文献标志码 AThe expression and prognostic value of IL-34 in lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor mutationJI Shi-meng1,2,3,JIANG Jia-hao4,HU Jie1,2,3,SONG Yuan-lin1,2,3*1.Department of Pulmonary Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China2.Department of Pulmonary Medicine,Shanghai Geriatric Medical Center,Shanghai 201104,China3.Shanghai Respiratory Research Institute,Shanghai 200032,China4.Department of Thoracic Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China Abstract Objective To detect the expression level of interleukin-34(IL-34)in lung adenocarcinoma(LUAD)with epidermal growth factor receptor(EGFR)mutant and to investigate the relationship between IL-34 and prognosis in these patients.Methods A total of 144 LUAD patients with EGFR mutant were enrolled,who had not received any chemotherapy,immunotherapy or radiotherapy before surgery and underwent resection from July 2015 to December 2017 in Zhongshan Hospital,Fudan University.The immunohistochemistry(IHC)was uesd to detect the expression of IL-34 in tumor and paired normal lung tissues.Kaplan-Meier curve and Cox model were used to analyze the association of IL-34 with the prognosis of patients.Results Compared with paired normal tissues,IL-34 was overexpressed in tumor tissues in LUAD patients.The follow-up time was 64(42,73)months.Kaplan-Meier curve showed that the patients in high IL-34 group(n93)had lower overall survival rate(P0.006)and higher accumulation recurrence rate(P0.011)than the patients in the low IL-34 group(n51).Cox model analysis showed that IL-34 expression was an independent predictor of overall survival(HR2.218,P0.015)and recurrence(HR2.486,P0.018)of patients.Conclusion IL-34 could be used to predict prognosis of LUAD patients with EGFR mutation.Chinese Journal of Clinical Medicine，2023，Vol.30，No.3 中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期422 Key Words interleukin-34;lung adenocarcinoma;epidermal growth factor receptor;prognosis肺癌是目前全球发病率最高，同时致死率最高的癌症，5 年生存率仅为 10%20%1。在非小细胞肺癌中，肺腺癌是最常见的组织学类型，占40%50%2-3。虽然早期肺腺癌患者在根治性切除术后可获得较好预后，但患者在确诊时常已发生转移，因此总体预后较差4。在 40%60%的亚洲肺腺癌患者中检测出表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变5。而靶向突变 EGFR 的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）可延长该类患者的生存期6。但是，部分患者在应用TKIs治疗约1年后出现耐药 7。对于这部分患者，寻找新的治疗靶点具有重要意义。通过干预肿瘤免疫抑制细胞（如肿瘤相关性巨噬细胞、调节性T细胞等），可提高抗肿瘤免疫作用或抵抗肿瘤耐药 8。白介素34（interleukin-34,IL-34）是调节肿瘤微环境的重要细胞因子之一，已被证实在骨肉瘤8和肝癌9中通过招募肿瘤相关性巨噬细胞促进肿瘤的进展和转移。另有研 究10表明，IL-34 阻断剂联合 PD-1 抑制剂对肺腺癌具有潜在的治疗效果。本研究通过分析 EGFR突变肺腺癌中 IL-34 的表达情况，评估其预后预测价值，以期为肺腺癌 EGFR-TKIs 耐药寻找新的治疗靶点。1 资料与方法 1.1 一般资料 收集 2015 年 7 月 1 日至 2017 年12 月 31 日在复旦大学附属中山医院胸外科行肿瘤根治性手术切除的 144 例肺腺癌住院患者的手术标本。入选标准：（1）手术标本经复旦大学附属中山医院病理科诊断，确诊为肺腺癌；（2）基因检测示EGFR突变；（3）术前未接受过手术切除、化疗、免疫治疗、分子靶向治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：（1）合并血液系统疾病、其他恶性肿瘤、严重感染性疾病、凝血功能异常；（2）有远处转移。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2021-128），所有患者均签署知情同意书。1.2 观察指标及随访 收集患者性别、年龄、吸烟情况、手术方式、病理类型、肿瘤分化分级、脏层胸膜侵犯情况及 EGFR 基因检测结果。采取电话随访与门诊复查相结合的方式对肺腺癌患者进行随访，随访至 2022 年 9 月 25 日。总生存期定义为手术日期至死亡日期的间隔时间，或手术日期至最后 1 次随访日期的间隔时间；无复发生存期定义为手术日期至复发的间隔时间。1.3 免疫组织化学检测及评估 在石蜡标本上标记出肺腺癌组织和其对应的癌旁组织，用直径 2.0 mm 的组织穿刺针穿取石蜡标本。将取得的组织芯条与蜡块加热融合，制备成组织阵列，并以 4 m 切片，固定于载玻片上。根据免疫组织化学检测试剂盒说明书，将组织芯片于烘箱烘干，二甲苯脱蜡，100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇水化。滴加内源性过氧化物酶、抗原修复液，5%胎牛血清封闭；滴加按 1 500浓度稀释的 IL-34 抗体（abcam，ab224734），于4 冰箱孵育 12 h；加入二抗，室温孵育 30 min后加入显色剂。结果由两位经验丰富的病理医师进行双盲评估。根据肿瘤细胞 IL-34 染色强度及阳性比例进行评分。IL-34 染色强度评分：无阳性染色（阴性表达）计 0 分，淡黄色（弱阳性）计 1 分，棕黄色（阳性）计 2 分，棕褐色（强阳性）计 3 分；阳性肿瘤细胞比例评分：阳性肿瘤细胞百分比25%计 1 分，26%50%计 2 分，51%75%计 3 分，76%100%计 4 分。将染色强度评分与阳性肿瘤细胞比例评分相乘，乘积7判断为IL-34低表达，大于 7 判断为 IL-34 高表达。1.4 统计学处理 采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计数资料以 n(%)表示，组间比较采用卡方检验。采用 Kaplan-Meier 绘制生存曲线，并进行log-rank 检验。采用 Cox 比例风险模型进行预后影响因素分析。检验水准（）为 0.05。2 结 果2.1 患者总体情况 144 例患者中，男性 54 例、中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期 Chinese Journal of Clinical Medicine，2023，Vol.30，No.3423女性 90 例，年龄 3578 岁，平均（58.149.12）岁。所有患者经基因检测判定为 EGFR 基因 18、19、20 或 21 外显子突变。免疫组织化学检测（图1）显示：IL-34 在肺腺癌癌组织中的表达强于周围正常肺组织。肺腺癌癌组织中 IL-34 高表达者93 例、IL-34 低表达者 51 例。图 1 IL-34 在 EGFR 突变肺腺癌中的表达情况A、B：IL-34 高表达肺癌组织（A）及其对应的癌旁组织（B）；C、D：IL-34 低表达肺癌组织（C）及其对应的癌旁组织（D）。Original magnification：200。2.2 IL-34 低表达组与高表达组患者临床病理特征比较 结果（表 1）显示：IL-34 低表达组与高表达组患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤大小、肿瘤分化程度、脏层胸膜侵犯情况、TNM 分期差异均无统计学意义。2.3 IL-34 低表达组与高表达组患者预后比较 患者的中位随访 64（42，73）个月，1 年、3 年、5年总生存率分别为 92%、76%和 63%，1 年、3 年、5 年累积复发率分别为 16%、29%、32%。Kaplan-Meier生存分析（图 2）显示：IL-34 低表达组患者的 1 年、3 年、5 年总生存率分别为 92%、88%、80%，累积复发率分别为 8%、17%和 19%；IL-34高表达组患者的 1 年、3 年、5 年总生存率分别为 92%、70%、53%，累积复发率分别为 20%、35%、40%。IL-34 高表达组患者总生存率低于IL-34 低表达组（P0.006），累积复发率高于低表达组（P0.011）。表 1 IL-34 低表达组与高表达组临床病理特征比较n(%)指标总计低表达组(n51)高表达组(n93)P值性别0.113 男 5423(42.6)31(57.4)女 9028(31.1)62(68.9)年龄0.173 60岁 7423(31.1)51(68.9)60岁 7028(40.0)42(60.0)吸烟情况0.253 是 3916(41.0)23(59.0)否10535(33.3)70(66.7)肿瘤最大径*0.145 3 cm 9236(39.1)56(60.9)3 cm 5215(28.8)37(71.2)肿瘤分化程度0.180+级12542(33.6)83(66.4)级 19 9(47.4)10(52.6)侵犯脏层胸膜0.386 是 9836(36.7)62(63.3)否 4615(32.6)31(67.4)TNM分期0.372 期 7528(37.3)47(62.7)+期 6923(33.3)46(66.7)*T1分期肺癌最大径3 cm。图 2 Kaplan-Meier 分析 IL-34 表达与 EGFR 突变肺腺癌患者预后的关系IL-34 高表达IL-34 低表达IL-34 高表达删失IL-34 低表达删失时间/月时间/月总生存率累积复发率2.4 患者预后影响因素分析 单因素 Cox 比例风险模型分析（表 2）显示，肿瘤大小、IL-34 表达与患者术后生存相关（P0.01）；肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM 分期、IL-34 表达与患者术后Chinese Journal of Clinical Medicine，2023，Vol.30，No.3 中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期424复发相关（P0.05）。将单因素分析中差异有统计学意义（P0.05）的指标纳入多因素分析，结果（表 3）显示：肿瘤最大径3 cm、IL-34 表达增加提示患者术后生存时间较短（P0.05）；肿瘤分化程度分级越高、TNM 分期越高、IL-34 表达增加提示术后复发率较高（P0.05）。表 2 单因素 Cox 比例风险模型分析 EGFR 突变肺腺癌患者预后相关影响因素 变量总生存无复发生存HR（95%CI）P值HR（95%CI）P值年龄（60 岁vs 60岁）1.406(0.8302.382)0.2041.126(0.6192.047)0.698性别（男vs女）1.014(0.5901.742)0.9590.922(0.5001.699)0.795吸烟史（是 vs 否）0.886(0.4841.623)0.6931.143(0.5962.192)0.690肿瘤大小（3 cm vs 3 cm）2.241(1.3253.789)0.0032.073(1.1383.775)0.019肿瘤分化程度（级 vs 级）1.712(0.8853.310)0.1312.624(1.2895.340)0.015侵犯脏层胸膜（是 vs 否）0.753(0.4381.294)0.3100.594(0.3241.090)0.099TNM分期（期 vs 期）1.433(0.8462.427)0.1792.847(1.5025.395)0.001IL-34表达水平（高vs 低）2.364(1.2474.480)0.0082.490(1.1935.197)0.015表 3 多因素 Cox 比例风险模型分析 EGFR 突变肺腺癌患者预后相关影响因素 变量总生存无复发生存HR（95%CI）P值HR（95%CI）P值肿瘤大小（3 cm vs 3 cm）2.114(1.2473.581)0.0051.349(0.7052.580)0.366肿瘤分化程度（级 vs 级）NANA2.309(1.1004.845)0.027TNM分期（期 vs 期）NANA2.515(1.3034.857)0.007IL-34表达水平（高 vs 低）2.218(1.1684.212)0.0152.486(1.1685.290)0.0183讨论IL-34 是 集 落 刺 激 因 子 1 受 体（colony-stimulating factor-1 receptor,CSF-1R）的配体11，作为肿瘤微环境调节因子之一，可以促进炎性细胞因子分泌，激活核因子 B（nuclear factor-B，NF-B）和JNK（c-Jun N-terminal kinase）相关信号通路12-14，招募巨噬细胞并调节其分化15，介导肿瘤细胞免疫逃逸及调控肿瘤微环境，进而促进肿瘤的进展和转移。其中，巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤免疫调控中发挥重要作用 16。TKIs 可改善 EGFR 突变肺癌患者的预后，总体反应率为 60%80%17-18。但部分患者在应用TKIs 治疗约 1 年后出现耐药。深入探讨肿瘤的异质性和耐药机制有利于防止耐药克隆的出现19。EGFR-TKIs 获得性耐药的常见机制包括 MET 扩增、HER2 扩 增、RAS/MAPK 通 路 蛋 白 突 变、PI3K 通路蛋白突变等20。Blakely 等21的研究表明，NF-B 通路可通过调控 IL-6、IL-8 等细胞因子介导肺腺癌 EGFR-TKIs 的耐药，表明白介素在EGFR-TKIs 获得性耐药中发挥重要作用。另有研究22显示，IL-34 可通过调控肿瘤相关性巨噬细胞的功能来介导肺癌的化疗耐药。同时，在人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft,PDX）模型中，通过联合使用 IL-34 抗体可以显著提高免疫治疗效果10，提示 IL-34 在肿瘤微环境中扮演重要的免疫抑制角色。本研究中，IL-34 蛋白在EGFR突变肺腺癌患者的癌组织中相对高表达，而在正常肺组织中低表达，与既往研究21相符；Kaplan-Meier生存分析结果表明，高表达IL-34 患者的 5 年总生存率降低，而累积复发率升高；Cox比例风险模型分析表明，IL-34 表达升高为该类患者生存期缩短、复发率升高的独立预测因子（P0.05）。但是本研究目前仅检测 IL-34 在 EGFR 突变肺腺癌中的表达情况，而未探讨 IL-34 对 EGFR 突变肺腺癌肿瘤微环境的调控作用及其对相关通路的影响。此外，Passaro 等23的研究证实，联合化疗、抗血管生成药物等有助于延迟 EGFR-TKIs 耐药的发生。因此深入探讨 IL-34 抗体联合 EGFR-TKIs 及其他治疗方案的治疗效果，可能为 TKIs 耐药肿瘤患者提供有效的治疗方案。综上所述，本研究提示，IL-34 可用于预测EGFR 突变肺腺癌患者的术后预后。IL-34 有望成中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期 Chinese Journal of Clinical Medicine，2023，Vol.30，No.3425为 EGFR 突变肺腺癌患者的治疗新靶标。后续须进一步探讨IL-34 对 EGFR 突变肿瘤微环境及相关通路的作用，以及与EGFR-TKIs联合治疗效果，从而辅助 EGFR 突变肺腺癌患者尤其是 EGFR-TKIs耐药患者诊治。利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。参考文献1 SIEGEL R L,MILLER K D,WAGLE N S,et al.Cancer statistics,2023 J.CA A Cancer J Clinicians,2023,73(1):17-48.2 ALLEMANI C,MATSUDA 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