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利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白
摘要：牛奶的蛋白质，主要以酪蛋白(Casein)为主，人奶以白蛋白为主。酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳(curds)。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效。利用盐析和等电点沉淀法可以将其分从牛奶中分离。
关键词：盐析沉淀，等电点沉淀，酪蛋白
前言：沉淀（precipitation）是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物（aggregates）的现象。但是沉淀是不定型的固体颗粒，构成成分复杂。蛋白质等生物大分子的分子间相互作用复杂，其溶解度降低或浓度升高时往往生称不定型的颗粒。沉淀原理分离蛋白质是畅通分离技术之一，目前广泛用于实验室和工业规模蛋白质的回收、浓缩和纯化，是血清蛋白质分离提取的主要手段。
1 盐析法沉淀酪蛋白
1.1 蛋白质盐析原理
水溶液中的蛋白质的溶解度在一般生理例子强度范围内（0.15～0.2mol/kg）最大，而低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（salting-out）。如图1所示，当例子强度较高时，溶解度的对数与离子强度呈线性关系。

图1.不同蛋白质溶解度与离子强度的关系
这种线性关系用Cohn方程描述
lgS=β-KsI
式中S—蛋白质的溶解度，g/L；
β—常数；
Ks—盐析常数；
I— 离子强度，mol/L。
蛋白质的溶解度与离子强度的关系曲线上存在最大值，该值在较低的离子强度下出现，在高与此离子强度的范围内，溶解度岁离子强度的增大而迅速降低。
1.2 影响盐析的因素
蛋白质的盐析行为随蛋白质的相对贩子质量和立体结构而异，反应在Cohn方程中就是对β和Ks的影响：不同蛋白质的β值不同；Ks值随蛋白质的相对分子质量的增大或分子不对称性的增强而增大，即结构不对称、相对分子质量打的蛋白质易于沉淀。对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。
1.3 盐析剂的选择
在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4, Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4, K3PO4。本次操作用的盐析剂是(NH4)2SO4。
选择(NH4)2SO4原因：（1）价格便宜；（2）在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度；（3）对大多数蛋白质的活力无损害。
1.4 盐析沉淀操作
① 将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；
②方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；
方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.8。
③ 用细布过滤分别收集沉淀和滤液。将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗中过滤除去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。准确称量。
2 等电点法沉淀酪蛋白
2.1等电点法原理
蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当pI=pH时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0，此时的该溶液的是pH值是该蛋白质的pI值。某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关，而与环境pH无关。在此时，蛋白质之间的静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀（isoelectric precipitation）。
2.2 操作条件
等电点沉淀的操作条件是：低离子强度；pH≈Pi。因此，等电点操作需要在低离子强度下调整溶液的pH值至等电点，或在等电点的pH值下利用透析等方法降低离子强度下，是蛋白质沉淀。由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故等电点沉淀操作中，多加入无机酸（如盐酸，磷酸和硫酸等）调节pH值。
等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。如在工业上生产胰岛素时：先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。
2.3 等电点沉淀操作
将盐析操作中所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。然后倒至离心管中6000r/min离心15min，倒掉上清液。在离心管中加入10mL去离子水，震荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.5-9.0，此时大部分蛋白质均会溶解。
将上述溶液6000r/min离心10min后将上层液倒入50mL烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器中搅拌并调整pH至3.0。
将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。沉淀取出干燥称量。

总结
盐析沉淀法不仅是蛋白质初级纯化的常用手段，在某些情况下还可以用于蛋白质的高度纯化，但是利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般盐析在沉淀后，需要进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作。与盐析相比，等电点沉淀的优点是无需后续的脱盐操作。但是，如果沉淀操作的pH值过低，容易引起目标蛋白质的变性。