SN∕T 4656.3-2016 进出口纺织品生物安全检验方法 第3部分：大肠菌群(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 进出口纺织品生物安全检验方法第部分：大肠菌群犅 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋 狔狋 犲 狊 狋 犻 狀 犵犿犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳狋 犺 犲狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犘 犪 狉 狋：犆狅 犾 犻 犳 狅 狉犿 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言 进出口纺织品生物安全检验方法共分为部分： 第部分：白假丝酵母菌； 第部分：大肠埃希氏菌； 第部分：大肠菌群； 第部分：金黄色葡萄球菌； 第部分：菌落总数。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国河南出入境检验检疫局、四川农业大学。本部分主要起草人：郭会清、李轲、徐超、禹建鹰、郭华麟、苗丽、乔晴、王永杰、杨娜、白杰。犛犖犜 进出口纺织品生物安全检验方法第部分：大肠菌群范围 的本部分规定了进出口纺织品中大肠菌群的定性、定量检验方法。本部分适用于进出口纺织品大肠菌群检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 数值修约规则与极限数值的表示和判定 培养基制备指南第部分：实验室培养基制备质量保证通则 培养基制备指南第部分：培养基性能测试实用指南术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 纺织品生物安全犫 犻 狅 狊 犪 犳 犲 狋 狔狅 犳狋 犲 狓 狋 犻 犾 犲 狊纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。 大肠菌群犮 狅 犾 犻 犳 狅 狉犿需氧及兼性厌氧，能在 分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。环境、设备和材料 常规微生物检测用的基本设备与材料。 无菌剪刀、镊子。 电子天平： 。 全滤网无菌均质袋。 拍击式均质器： 。 无菌规格板： 。 无菌干燥棉拭子。 微量移液器： 、 。 无菌小三角瓶： 。 无菌吸头： 、 。犛犖犜 无菌玻璃平皿或塑料平皿： 。 恒温水浴箱： 。 恒温培养箱： 。 放大镜（放大倍 倍）或菌落计数器。 滤膜或一次性无菌滤膜：直径 ，微孔径 。 烧杯： 。 无菌滤器。 抽滤设备。 接种环。 无菌三角瓶： 。培养基、试剂 磷酸盐缓冲液：见 。 无菌生理盐水：见 。 结晶紫中性红胆盐琼脂（） ：见 。 煌绿乳糖胆盐肉汤（肉汤）发酵管：见 。 琼脂：见 。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（肉汤）发酵管：见 。注：本部分中无菌稀释液均为磷酸盐缓冲液（ ）或无菌生理盐水（ ） 。样品制备 称量法无菌方法打开送检的样品，用无菌剪刀（ ）均匀剪样，在电子天平（ ）上准确称取剪下的样品 样品。剪碎后加入到盛有 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（ ）中，用拍击式均质器（ ）拍打 ，充分混匀，得到一个 的样品匀液。 多点采样洗脱法无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均匀布控个采样点，用无菌规格板（ ）按每个采样点 面积范围剪裁，每 平方厘米采样面积为份检样，每个样品共采集份检样，采样面积为 。将上述采集好的份检样放入盛有 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（ ）中，用拍击式均质器（ ）拍打 ，充分混匀，得到一个洗脱液，制成样品匀液作为原液。 棉拭子涂抹法无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（ ） ，在样品四周和中间均匀布控个采样点，用无菌规格板（ ）比照按每个采样点 面积范围均匀涂抹，每个采样点用个无菌干燥棉拭子（ ） ，立即用无菌剪刀（ ）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放入盛有 无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（ ）中，制成 的样品匀液。 样品制备方法的选择样品制备一般依 方法 样品 稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或犛犖犜 多孔时，样品制备应采用 方法。当出现以下情况时：）样品质地致密不容易剪碎制备；）样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用 方法。采用 、 方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样液。采用 方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。大肠菌群定量检验方法平板计数法 原理大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫黑色、带或不带有金属光泽的特定形态菌落。 检验程序检验程序见图。图大肠菌群平板计数法检验程序 操作步骤 样液稀释用微量移液器（ ）移取制备好的样品匀液，缓慢注于盛有稀释液的无菌小三角瓶（ ）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面） ，振摇小三角瓶（ ）或换用支无菌吸头（ ）反复吹打使其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释次，换用次无菌吸头（ ） 。犛犖犜 样品接种 检测时应根据样品的实际污染情况，选择个个合适稀释度样品匀液（包括原液） ，在进行 倍递增稀释时，同时吸取样品匀液于无菌平皿（ ）内，每个稀释度接种两个平皿。同时分别吸取空白稀释液加入两个无菌平皿（ ）内做空白对照。 及时将 冷却至 的结晶紫中性红胆盐琼脂（） （ ） 可放置 水浴箱（ ）中保温倾注平皿，边倾注边轻转动平皿使其混合均匀。 培养待琼脂凝固后，将平板翻转，倒置放入培养箱（ ） ， 培养 。 典型菌落计数和确认 培养结束时应及时计数。可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器（ ） 。菌落计数以菌落形成单位（ ，）表示。 大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（） （ ）平板上呈紫红色菌落，菌落周围有红色胆盐沉淀环，菌落较大，直径约 。 选择有典型或可疑大肠菌群菌落平板计数，计数合适范围为 ，原则上尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板，计数典型或可疑菌落数，每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。如果：）只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在 之间，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。）最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于 ，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。）所有稀释度平板上的菌落数均大于 且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。以上典型或可疑菌落确证后按式（）计算。犜犽犃犅犆犱（）式中：犜 样品中大肠菌群菌落数；犽 根据样品制备方法得出的系数，按 制备样品，犽；按 、 制备样品，犽；犃 某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数；犅 某一稀释度确证试验阳性的菌落数；犆 某一试验中用于确证试验的菌落数；犱 稀释因子。）两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在 之间，则这两个连续稀释度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式（）计算。犜犽犃犅犆犃犅 犆犱（）式中：犜 样品中大肠菌群菌落数；犽 根据样品制备方法得出的系数，按 制备样品，犽；按 、 制备样品，犽；犛犖犜 犃 第一稀释度（低倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；犅 第一稀释度（低倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；犆 某一试验中第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数；犃 第二稀释度（高倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；犅 第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；犆 某一试验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数；犱 稀释因子（第一稀释度） 。）所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落，则直接以小于乘以最低稀释倍数报告结果。）如典型或可疑菌落计数出现其他情况，可先计算同一稀释度的两个平板平均数，选择典型或可疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数，如只有一个平均结果在计数范围内，确证后按式（）计算结果，如两个平均结果都在计数范围内，确证后按式（）计算。 一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见 ，两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见 。 从可计数的平板上任意挑取个（小于个全部挑取）不同类型典型或可疑菌落，分别接种于肉汤发酵管（ ）中， 培养 ，观察产气情况。 培养 后肉汤发酵管（ ）产气的，即可确证为大肠菌群阳性菌落，反之为阴性。 结果报告根据结晶紫中性红胆盐琼脂（） （ ）平板上典型或可疑菌落数，按照 中公式计算，报告每平方厘米、每克或每 平方厘米样品大肠菌群数，以、或 表示。如犜值为，则以小于乘以最低稀释倍数报告；如犜值小于 ，以实际数值报告；如犜值大于或等于 时，报告时数值按 规则进行修约，用 的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。大肠菌群定量检验方法 微孔滤膜法 原理用生理盐水洗脱纺织品中的微生物，采用孔径为 微孔薄膜快速抽提，此种滤膜能滤过大量液体，并将样液中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在大肠菌群培养基上，经过培养后，大肠菌群在培养基上长出具有相应特征性的菌落，直接计数菌落数，根据样品制备方法对大肠菌群进行定量计算。 检验程序检验程序见图。犛犖犜 图大肠菌群微孔滤膜法检验程序 操作步骤 样液稀释用微量移液器（ ）移取制备好的样品匀液 ，缓慢注于盛有 稀释液的无菌三角瓶（ ）中，振摇三角瓶使其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释次，换用次无菌吸头（ ） 。 样品接种 如滤膜（ ）未经灭菌，则使用前需将滤膜放入烧杯（ ）中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌次，每次 ，前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤次次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜（ ） 。 取出无菌滤器（ ） ，用无菌镊子（ ）夹取无菌滤膜（ ）边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器（ ） ，根据样品污染情况确定样品的稀释度，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于 个菌落为宜。取个个合适稀释度样品匀液各 注入滤器中，打开抽滤设备（ ）阀门，在 （ 大气压）下抽滤。 样液滤完后，再抽气约，关上阀门，取下滤器，用无菌镊子（ ）夹取滤膜边缘部分，滤膜截留细菌面向上移放在 琼脂（ ）平板上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平板放入 培养箱（ ）内培养 。 大肠菌群在 琼脂（ ）平板上培养出的菌落具有以下特征：紫色或红色小菌落。 结果计算直接计数 琼脂（ ）平板上紫色或红色小菌落，按式（）计算。犜犽犃犞犱（）式中：犜 样品中大肠菌群菌落数；犛犖犜 犽 根据样品制备方法得出的系数，按 制备样品，犽；按 、 制备样品，犽；犃 数出的大肠菌群菌群数；犞 过滤的样液量；犱 稀释因子。 结果报告如果样品原液培养基上无菌落长出，结果报告为；如果 倍样品稀释液培养基上无菌落长出，结果报告为 （）或 ；其他选择培养基上菌落数小于 的平板计数，按式（）计算报告。大肠菌群定性检验方法乳糖胆盐发酵法 原理利用大肠菌群发酵乳糖产酸产气的特性，接种适合大肠菌群生长且含有乳糖的肉汤培养基，发酵乳糖产气后接种煌绿乳糖胆盐肉汤复发酵，排除能够发酵乳糖产酸产气的杂菌干扰对大肠菌群的鉴定，复发酵阳性，可判定为大肠菌群阳性。 检验程序检验程序见图。图大肠菌群乳糖胆盐发酵法检验程序犛犖犜 操作步骤 初发酵试验用微量移液器（ ）无菌取制好的样液接种 肉汤发酵管（ ）内，置 培养箱（ ）内培养 ，观察发酵管内是否产酸产气。 复发酵试验如初发酵产酸产气，则用无菌接种环（ ）挑取一环接种肉汤发酵管（ ）进行复发酵试验，置 培养箱（ ）内培养 ，观察复发酵情况。 结果判定如初发酵产酸产气，复发酵也产酸产气，则报告大肠菌群阳性。其他情况则报告为大肠菌群阴性。 结果报告报告被检样品检出或未检出大肠菌群。犛犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 培养基制备及质量保证按 和 ，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用市售的脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。犃 磷酸盐缓冲液犃 成分磷酸二氢钾 蒸馏水 犃 制法贮存液：称取 的磷酸二氢钾溶于 蒸馏水中，用大约 的 氢氧化钠溶液调 ，用蒸馏水稀释至 后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液 ，用蒸馏水稀释至 ，分装于适宜容器中， 高压灭菌 。犃 无菌生理盐水犃 成分氯化钠 蒸馏水 犃 制法称取 氯化钠溶于 蒸馏水中， 高压灭菌 。犃 结晶紫中性红胆盐琼脂（犞犚犅犃）犃 成分蛋白胨 酵母膏 乳糖 氯化铵 胆盐或号胆盐 中性红 结晶紫 犛犖犜 琼脂 蒸馏水 犃 制法无需高压灭菌，将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至 。煮沸 ，将培养基冷至 倾倒平板，临用时制备，不得超过。犃 煌绿乳糖胆盐肉汤（犅犌犔犅肉汤）发酵管犃 成分蛋白胨 乳糖 牛胆粉（ 或 ）溶液 煌绿水溶液 蒸馏水 犃 制法将蛋白胨、乳糖溶于约 蒸馏水中，加入牛胆粉溶液 （将 脱水牛胆粉溶于 蒸馏水中，调至 ） ，用蒸馏水稀释到 ，调 ，在加入 煌绿水溶液 ，用蒸馏水补足到 ，用棉花过滤后，分装到有玻璃小导管的试管中，每管 ， 高压灭菌 。犃 犃 犾 犻 狕 犵 犪 犾琼脂犃 成分胰蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 月桂基硫酸钠 （纯度不低于 ） 异丙基硫代半乳糖苷 硫酸铝钾 柠檬酸铁铵 琼脂 蒸馏水 犃 制法准确称取以上各成分于 蒸馏水中加热溶解，调 ， 高压灭菌 ，倾注平板，备用。 犛犖犜 犃 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（犔犛犜肉汤）发酵管犃 成分胰蛋白胨 氯化钠 乳糖 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 月桂基硫酸钠 蒸馏水 犃 制法准确称取以上各成分溶解于蒸馏水中，调 。分装到内有倒立小玻璃产气管的 试管中，每管 ， 灭菌 。 犛犖犜 附录犅（资料性附录）示例犅 示例只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在合适计数范围内时，计数结果见表 。表犅 计数结果稀释度 稀释度（第一稀释度） 稀释度（第二稀释度）典型或可疑菌落数 ， ，用于确证试验的菌落数确证试验阳性的菌落数则犃（ ） ，犅，犆按 制备样品，犽犜 按 制备样品，犽犜 按 制备样品，犽犜 犅 示例两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在合适计数范围内时，计数结果见表 。表犅 计数结果稀释度 稀释度（第一稀释度） 稀释度（第二稀释度）典型或可疑菌落数 ， ， 用于确证试验的菌落数确证试验阳性的菌落数则犃（ ） ，犅，犆，犃（ ） ，犅，犆按 制备样品，犽犜 按 制备样品，犽 犛犖犜 犜 按 制备样品，犽犜 犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口纺织品生物安全检验方法第部分：大肠菌群 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元