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超氧化物歧化酶1调节caspase-1和 内毒素休克

费利克斯·迈斯纳，Kaaweh Molawi和阿图罗·Zychlinsky
炎症的引发由胱天蛋白酶-1和蛋白水解成熟的细胞因子白细胞介素1b和白介素1b形成 。几个样品受体活化的caspase-1在响应微生物和“危险”信号方面，通过组装胞浆蛋白复合形成称为“inflammasomes”。在这里，我们表明，超氧化物歧化酶1（SOD1）规定的caspase-1 激活。在SOD1缺陷巨噬细胞，提高超氧化物产量减少细胞的氧化还原电势，特别由可逆氧化和氧化还原敏感的半胱氨酸残基Cys397和Cys362的谷胱甘肽抑制胱天蛋白酶1方面。相反，在低氧条件废止胱天蛋白酶-1的抑制作用。在体内，SOD1缺陷小鼠产生较少的caspase-1依赖性细胞因子和不太容易受到脂多糖诱导的脓毒性休克。我们的调查结果确定生理翻译后在胱天蛋白酶-1介导的炎性过程的控制机制。
白细胞介素1B （IL -1β ; A003663 ）和IL-18是用于主机必不可少国防和介导许多炎症的发病机制disorders1 。每个这些的非活性前体的合成细胞因子诱导响应于各种刺激如Toll样受体4 （ TLR4 ）激动剂脂多糖（LPS） 2 。微生物或“危险”信号激活的caspase - 1 （ A000492 ）中inflammasomes和需要进行有效的切割和成熟IL-18和IL- 1B3 -5。刺激激活inflammasomes的例子含NALP3 （点头样受体家族的一个成员;也被称为NLRP3或cryopyrin ）包括外ATP ，这通过嘌呤受体P2X 7 （也称为P2X7R ）信号细菌毒素，由链霉菌产生的离子载体尼日利亚菌素，而感染李斯特菌和金黄色葡萄球菌，如以及结晶structures5 -10 。胱天蛋白酶-1在inflammasomes的激活是不完全understood11 。由于巨噬细胞的刺激诱导产生活性氧簇（ROS ） 12 ，它是胱天蛋白酶-1 - 介导的炎症是由ROS5 ， 13,14监管。为了测试这一点，我们使用小鼠缺乏细胞质酶的SOD1 （见15 ） 。 SOD1降低了由内源性产生的超氧阴离子氧化还原酶或作为反应与电子的副产品转移到过氧化物和oxygen12 ， 15氢气。除了女辅助生育， SOD1缺陷小鼠在常规正常生长养殖conditions16 。这里，我们表明， SOD1是所需的活化胱天蛋白酶-1 。 SOD1的不足导致了更多的活性氧在巨噬细胞和引起胱天蛋白酶-1的抑制通过特定的氧化和谷胱甘肽。该变形调节胱天蛋白酶-1的活性和IL -1β和IL- 18的生理条件的成熟和废止缺氧。我们确认我们的观察在体内，表明SOD1缺陷小鼠的caspase-小得多表达 1依赖性细胞因子和内毒素性休克是更耐刺激。

1方法

1.1小鼠的选取

SOD1缺陷（B6.129S7-Sod1tm1Leb/ J）小鼠和gp91phox（CYBB） - 在C57BL / 6背景的缺陷（B6.129S6-Cybbtm1Din/ J）小鼠是从杰克逊实验室获取。胱天蛋白酶1缺失（B6.129S2-Casp1tm1Sesh）小鼠 由BASF27提供。所有小鼠被安置在的的无病原体的设施 马克斯普朗克研究所的感染生物学。所有动物实验均做 根据德国动物保护法。

1.2试剂和抗体的选取

从鼠伤寒沙门氏菌， Ellman试剂脂多糖和卡莫司汀是从亚历克西斯。尼日利亚菌素，谷胱甘肽乙酯大肠杆菌大肠杆菌脂多糖（血清型0111 ：B4 ，Sigma社制），将细胞渗透性超氧化物歧化酶模拟物TEMPO和钛试剂购自Sigma ;黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶是从Calbiochem公司; ATP是由罗氏公司;和BioGEE是购自Invitrogen 。该下列抗体：兔抗小鼠胱天蛋白酶-1 （SC- 514 ;
Santa Cruz公司） ，兔抗小鼠IL -1β （ 5129-100 ;BioVision公司） ，兔抗人切割IL-1B （ D116 ;细胞信号） ，山羊抗人IL-1B （ 5128-100 ; Biovision公司），兔抗体，以血凝素（ H6908 ，Sigma社制），小鼠抗体对β-肌动蛋白 - 过氧化酶（ AC-15 ; Sigma公司） ，兔抗体IKBA （ 400001 ， Calibiochem ） ，小鼠抗体磷酸化p38 （ 28B10 ; Cell Signaling公司） ，兔抗体P38 （ 9212 ;细胞信令）和多克隆兔抗体对丝裂原活化蛋白激酶P44/42 （ 9102 ）和磷酸化P44/42 （ 9101 ;既从细胞信令） 。金黄色葡萄球菌菌株83254和单增李斯特菌菌株EGD生长在37 1C中脑心脏浸液培养基中18小时。单增李斯特菌是传代培养的稀释度为1:100 ，并让其在37 1C增长到一个0.5吸光度在600nm处。腹腔巨噬细胞被感染单增李斯特菌（多重感染， 10 ）和金黄色葡萄球菌（多重
感染，100）。在感染后30分钟后，细胞外的细菌被杀死同庆大霉素。离心15,800 g的产生金黄色葡萄球菌上清液和无菌过滤。金黄色葡萄球菌培养上清液中含有的致病因素该触发器的caspase - 1 -依赖性释放白细胞介素-1β （未发表数据） 。鼠标细胞因子测定在培养物上清液或与ELISA小鼠血清衡量自R＆D系统工具包; IL-1B是衡量自BD ELISA试剂盒。

1.3检测细胞内ROS的方法

细胞在371C与孵育20分钟 10mM的CM-H2DCFDA（5 - （和6） - 氯甲基-2¢7¢-二氯 二乙酸乙酰乙酯;分子探针），然后用PBS洗涤一次， 再悬浮于无酚红的RPMI培养基中，并刺激30分钟 用5mM ATP。 ROS的产生通过流式细胞仪（激发评估， 488纳米;发射515-545纳米）。至少有1个以104个细胞进行分析 CellQuest软件进行了的FACSCalibur（Becton Dickinson公司）每个样品分析。
可溶性蛋白质的原位标记。 BioGEE被纳入可溶性 细胞蛋白作为described42。腹膜巨噬细胞温育1小时 用含有250mM的BioGEE介质中，然后被引用LPS和 用2mM ATP，2.5mM的尼日利亚菌素或5％（体积/体积）的金黄色葡萄球菌活性 上清液。转染亲IL-1B，ASC，NALP3和293T细胞血凝素标记的野生型或突变半胱天冬-1“饿死”过夜之前被加载在完全培养基与BioGEE5小时。生物素标记的蛋白从细胞裂解液中沉淀生蛋白链菌素连接到琼脂糖珠（Pierce公司），并用含二硫苏糖醇。提取物被解决SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素，并且用探针抗体对小鼠胱天蛋白酶-1或血细胞凝集素。
免疫印迹和免疫沉淀。细胞在含缓冲 1％（体积/体积），诺乃洗涤剂-P40补充有完全蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”（Roche公司）。蛋白浓度通过二辛可宁测定
酸测定法（BCA蛋白检测试剂;皮尔斯）和裂解液调整相应地。裂解物在减少煮沸5分钟用SDS样品缓冲液的条件下，通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素
膜由electroblot。样品在41C与温育4小时适当的抗体并进行30分钟，使用蛋白AG琼脂糖珠（Pierce公司）。免疫沉淀物用免疫印迹分析。
测量谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽的浓度用比色法测定described43。从细胞裂解物中的蛋白质是沉淀用5％（体积/体积），偏磷酸，和硫醇浓度 的上清液，通过吸光度的测定在412nm处测定以1毫米的Ellman氏试剂。道达尔和氧化型谷胱甘肽是衡量一个分光光度法测定试剂盒（Calbiochem公司）。
蛋白酶活性。发色底物（AC-YVAD-pNA的，AC-FR-pNA的，的MeO-SucAAPFpNA; 100毫米;亚历）被用来监测的活动重组蛋白酶（1个单位的caspase-1，0.000016单位的木瓜蛋白酶，0.00021组织蛋白酶L和0.000016单位中性粒细胞弹性蛋白酶的单位;亚历）在超氧化物中含有5mM HEPES，pH值7.2，50mM的缓冲液存在下的NaCl，0.1％（体积/体积）的CHAPS（3 - [（3 - 胆酰胺丙基）二甲基氨基] -1 - 丙烷磺酸水合物），10毫摩尔EDTA，5％（体积/体积）甘油和1mM
二硫苏糖醇。超氧化物是由100其中MMoR1mM的转换生成黄嘌呤由0.0004单位黄嘌呤氧化酶。蛋白酶活性是由评估在405nm处吸光度的增加为1小时，在37±1℃。

1.4胱天蛋白酶-1活性测定

用于哺乳动物的基因表达，该表达载体pCAGGS载体是used44 。 cDNA克隆的所有构造（人caspase - 1 ，人类ASC ，人类NALP3 ，人亲IL-1B ）是从RZPD获得德国资源基因组研究中心。基因通过PCR扩增用特异性引物。羧基末端血凝素标签（胱天蛋白酶-1和NALP3 ）或标志标签（ ASC）进行了介绍与基因特异性3 ¢引物含有标签序列。人caspase - 1的单半胱氨酸突变体通过位点定向诱变有两个连续的PCR steps45产生。所有基因导入了pCAGGS载体。所有的结构序列为通过自动测序验证。引物序列可应要求提供。脂质体Lipofectamine 2000（ Invitrogen公司）转染的293T细胞用将pCAGGS质粒编码亲IL- 1b中， ASC， NALP3和所述一个胱天蛋白酶-1的突变体。然后， 24小时后，细胞和细胞收集上清液和IL- 1b的处理是由免疫印迹和ELISA监测。
腹腔巨噬细胞诱发与4 ％ （体积/体积），巯基乙酸溶液并通过腹腔灌洗4天later46收集。贴壁巨噬细胞在补充有10％ （体积/体积）的RPMI培养基中制备的培养heatinactivatedFCS，青霉素（50毫克/毫升）和链霉素（ 50毫克/毫升）和3小时后贴壁细胞被选定。在体外实验均在一天后进行收集在含有0.5％ （体积/体积）的血清的细胞培养基。骨髓源性巨噬细胞制备为described47 。骨髓采集从股骨和小鼠的胫骨。骨髓细胞接种于无菌培养皿中并在DMEM含有10％ （体积/体积） FCS， 5％的（体积/体积），马血清， 10mM的HEPES， pH值7.4 ，1mM的丙酮酸盐，10mL-谷氨酰胺和20 ％ （体积/体积），中型空调与巨噬细胞集落刺激因子（从L929细胞巨噬细胞集落刺激因子的细胞线）。骨髓细胞在37摄氏度和7 ％CO 2 ，和巨噬细胞6 d后收集。骨髓衍生的巨噬细胞与分离的冰冷的PBS ; 106细胞再悬浮inMouseMacrophage Nucleofector
溶液（ Amaxa公司），然后转染2毫克的caspase- 1突变体的根据制造商的方案用Y型001说明。第二天，细胞被引为用LPS 5小时（2毫克/毫升）和刺激1小时，用2毫摩尔ATP ，然后IL-1B用ELISA法测定上清液。胱天蛋白酶-1表达，免疫细胞裂解物进行分析。
缺氧条件下。细胞接种，然后转移到一控制温度和湿度的手套箱（普拉斯实验室）于前18小时实验。氧浓度保持在1％以下与气体混合物含有10％的氢，5％二氧化碳和85％氮气。
LPS诱导的内毒素休克。小鼠8-10周龄腹腔注射以每千克体重（15毫克/千克）15毫克大肠杆菌LPS的剂量。老鼠每日3次，内毒素血症和死亡的迹象进行监测4天并在此后定期。血清细胞因子，另一个测量小鼠的队列接受LPS（15毫克/千克）。鲜血从小鼠获得的在注射后2,6和12小时。血清细胞因子ELISA法测定。

1.5统计分析

数据是用双尾Student t-检验分析。生存率采用Kaplan-Meier法分析和比较通过log-rank检验。

2结果

活化的caspase - 1和成熟的IL-1B要求的SOD1到炎性激活期间调查SOD1的功能，我们底漆腹膜野生型和SOD1缺陷巨噬细胞用LPS ，然后刺激它们与ATP ，尼日利亚菌素，或金黄色葡萄球菌上清液含有细菌毒素。响应于所有的三个刺激，胱天蛋白酶1进行处理，使其在野生型的活性P10 subunit4但不能在30分钟内SOD1缺陷巨噬细胞（图1a和补充图。 1A ，B在线） 。根据这一观察协议，两个成熟的IL -1β和IL- 18是从有效释放野生型，但在应对所有不SOD1缺陷巨噬细胞3刺激，如酶联免疫吸附法测定（ ELISA法; 。图1和补充图1C ，D ） 。值得注意的是， IL -1β成熟针对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌感染也抑制SOD1缺陷型巨噬细胞（补充图2） 。的caspase - 1和IL- 18人组成expressed17 ，而IL-1B表达“开启”后，才促发的LPS （补充图 3） 。 SOD1是必需的成熟IL-1B （LPS -引发的细胞）与IL -18（无底漆） ，这表明该规例是独立的LPS促发的。此外，刺激与ATP ，尼日利亚菌素和金黄色葡萄球菌上清液诱导野生型而不是SOD1缺陷巨噬细胞的死亡和是独立的LPS吸（补充图4）的。这种效果是特异性的，因为细胞凋亡的caspase-3和caspase- 7在SOD1 -缺陷型巨噬细胞（数据未示出）进行了处理。些数据共同表明， SOD1是激活caspase - 1 必需的物质。
为了评估是否SOD1的其他调节促炎信号途径，我们刺激巨噬细胞通过Toll样受体与LPS或通过嘌呤受体P2X7 （ P2X7R ）与ATP ，然后监测其激活。的丝裂原活化的磷酸化蛋白激酶p38和ERK的以及该抑制剂的降解IKBA相似于野生型和SOD1 -缺陷型细胞中响应于LPS （图2a）或ATP（数据未显示）。的此外，分泌肿瘤坏死因子（TNF）和趋化因子KC是难以区分在任一基因型的巨噬细胞（图2b） 。其他研究报道说，活性氧的药理学抑制信号传导的影响通过促分裂原活化蛋白激酶和转录因子NF- kB18 ， 19并抑制炎性activation5 ， 13,14 。我们的数据表明，这些化合物必须是功能性的其他步骤比超氧化物转化为过氧化氢。更多值得注意的是，我们的研究结果表明， SOD1的专门规定了激活胱天蛋白酶-1的方法。

3讨论

几种微生物和“危险”信号，引起炎症激活胱天蛋白酶-1在NALP3 inflammasome11 。常见的分子活化的机制仍在进一步调查中。尽管NALP3已经建议作为一个胞质receptor28 ，29，的损失细胞内的钾似乎是共同的要求为激活胱天蛋白酶-1的由NALP3 inflammasome14 ， 30 。在这里，我们已经表明，除了那些建议的机制胱天蛋白酶-1是由SOD1和生理活性调控氧气。我们在与巨噬细胞的实验证明了这一点从SOD1缺陷小鼠在常氧和缺氧条件下。我们发现这种调节的生理意义由SOD1缺陷小鼠中的较大阻力机构内毒素休克。半胱氨酸氧化是一个可逆调控机制的蛋白质酪氨酸phosphatases31 ， 32 。只有蛋白质的半胱氨酸残基，其酸解离常数减少了一个不寻常的环境邻近残基是ROS的潜在目标。我们建议，半胱氨酸残基的选择性氧化是一种常见的机制酶的调节。事实上， SOD1的不足提供了一个功能强大的工具为研究细胞成分调节氧化还原修改。我们发现，刺激内源性和微生物后“危险”信号， ATP ，金黄色葡萄球菌毒素或尼日利亚菌素，如超氧氧化和抑制胱天蛋白酶1 。胱天蛋白酶-1的调节通过两种氧化还原敏感的氧化作用起作用具体半胱氨酸残基（ Cys362和Cys397 ） 。这些半胱氨酸氧化残防止胱天蛋白酶-1的激活和随后的成熟的IL -1β和IL- 18 。针对这些刺激产生的超氧不主要来源于NADPH氧化酶，如遗传缺陷在吞噬体细胞色素氧化酶B的91千道尔顿亚单位没有显著影响胱天蛋白酶-1激活。我们的研究结果与已发布的研究结果显示，对比“撞倒”的吞噬体NADPH氧化酶的亚基P22在人单核细胞样细胞系增加了制作IL-1B响应外源性“危险” signals5 。是否这些差异是由于不同的实验系统或中的caspase- 1采用了不同的激活必须通过确定未来的研究。我们发现的caspase - 1直接谷胱甘肽作为结果氧化。谷胱甘肽化提供了强大的机构对于许多动态，翻译后调节蜂窝processes33 。事实上，TNF-α诱导的裂解和凋亡的影响胱天蛋白酶-3是由glutathionylation34调节。酶能够减少谷胱甘肽化蛋白质，如glutaredoxins ，硫氧还蛋白和sulfiredoxin ，保留这些修改过性的。值得注意的是，谷胱苷肽
S-转移酶的ω 1-1 ，促进谷胱甘肽酶转移，则建议将涉及胱天蛋白酶-1依赖性
成熟的IL- 1B35的。事实上，我们的数据表明的caspase- 1是谷胱甘肽是按照该要求谷胱甘肽S-转移酶活性在IL -1β的分泌。在体内，没有SOD1的移位的氧化还原电位。因此，的caspase - 1的氧化增强，导致其抑制并在胱天蛋白酶-1依赖性细胞因子的低血清浓度LPS刺激后的SOD1缺陷小鼠。的caspase - 1抑制作用伴随着较低的免疫细胞死亡和受保护的小鼠脓毒性休克，类似于之前描述的用于表型胱天蛋白酶-1 - 缺乏mice27 ,36- 38 。根据我们的模型，发现在炎症缺氧条件sites39青睐胱天蛋白酶-1的激活块状由于缺乏抑制氧。因此，胱天蛋白酶-1 - 的结果释放依赖的细胞因子IL- 1b和IL-18的放大炎症。在除了转录因子，包括低氧诱导因子在缺氧conditions40 ，我们的研究结果，即控制基因表达提示胱天蛋白酶-1的翻译后调节增强所述在炎症部位的免疫反应。我们的研究结果提供了遗传学和生物化学的证据表明，SOD1是胱天蛋白酶-1激活必需的，并且它的功能由调节特异性半胱氨酸氧化和谷胱甘肽残留物。这表明ROS的调节剂，诸如特定的SOD1抑制剂，有可能作为药物用于炎症性病变，包括败血症。 SOD1也被认为与神经退行性病肌萎缩侧索sclerosis41 。未来的研究应该解决的分子机制是否在这里也说明有助于神经退行性病变。

4致谢

我们感谢Zychlinsky实验室进行讨论的成员; B. RAUPACH 和J. de地亚哥的意见;和M. Schmidt和J. Lambers技术援助。