miR-146a在结肠癌中的表达及其作用研究.pdf

177中国实用医药2023年8月第18卷第16期China Prac Med,Aug 2023,Vol.18,No.16miR-146a 在结肠癌中的表达及其作用研究王芹武芳【摘要】目的探究 miR-146a 在结肠癌中的表达及其作用。方法选取 26 只体重 1520 g、周龄6 周的雄性 C57BL/6 小鼠作为实验对象,将其中 13 只为 miR-146a 基因的小鼠作为对照组,另外 13 只 则为 miR-146a 基因敲除的小鼠作为观察组。比较两组小鼠结肠肿瘤情况(肿瘤数、肿瘤直径)、排便情况(便血程度及粪便形状评分)及增殖细胞核抗原(PCNA)相对表达量、肿瘤组织中促炎性因子的信使核糖核酸(mRNA)相对表达量。结果观察组小鼠的肿瘤数(12.483.35)个明显多于对照组的(5.231.31)个,肿瘤直径(3.570.83)mm 明显大于对照组的(2.020.76)mm,差异具有统计学意义(P0.05)。观察组小鼠的便血程度及粪便形状评分分别为(2.040.31)、(3.020.48)分,明显高于对照组的(1.030.12)分和(2.010.33)分,差异具有统计学意义(P0.05)。观察组小鼠的 PCNAmRNA 相对表达量(2.740.79)明显高于对照组的(1.030.31),差异具有统计学意义(P0.05)。观察组小鼠肿瘤组织中促炎性因子的 mRNA 相对表达量白细胞介素-6(IL-6)(1.670.69)、环氧合酶 2(COX2)(6.581.25)、巨噬细胞炎性蛋白 2(MIP2)(7.121.18)均明显高于对照组的(0.910.34)、(1.340.43)、(1.210.54),差异具有统计学意义(P0.05)。结论miR-146a 的表达可以对结肠癌细胞的增殖及生长起到显著的抑制效 果,其可作为一种抑癌基因,通过对肿瘤细胞凋亡的影响实现对肿瘤病理变化的作用,通过对 miR-146a水平的检测可以对患者预后效果等进行评估,具有重要价值。【关键词】结肠癌；miR-146a 表达；抑癌基因；肿瘤细胞凋亡DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2023.16.049Study on the expression and function of miR-146a in colon cancer WANG Qin,WU Fang.Department of Physiology,Jiangsu Health Vocational College,Nanjing 211800,China【Abstract】Objective To investigate the expression and function of miR-146a in colon cancer.Methods 26 male C57BL/6 mice weighing 15-20 g and aged 6 weeks were selected as the experimental subjects,with 13 miR-146a gene mice as the control group,and the other 13 miR-146a gene knockout mice as the observation group.Both groups were compared in terms of colonic tumors(number of tumors and diameter of tumors),defecation(score of blood in stool and fecal property),relative expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and relative expression of messenger RNA(mRNA)of pro-inflammatory factors in tumor tissues.Results The number of tumors of(12.483.35)tumors in the observation group was significantly higher than that of(5.231.31)tumors in the control group;the diameter of tumor of(3.570.83)mm in the observation group was significantly higher than that of(2.020.76)mm in the control group;the differences were statistically significant(P0.05).The scores of blood in stool and fecal property were(2.040.31)and(3.020.48)points,which were significantly higher than those of(1.030.12)and(2.010.33)points in the control group,and the differences were statistically significant(P0.05).The relative expression of PCNAmRNA of(2.740.79)in the observation group was significantly higher than that of(1.030.31)in the control group,and the difference was statistically significant(P0.05).The relative expression of mRNA of pro-inflammatory factors of interleukin-6(IL-6),cyclooxygenase-2(COX2)and macrophage inflammatory protein 2(MIP-2)in tumor tissues were(1.670.69),(6.581.25)and(7.121.18),which were significantly higher than those of(0.910.34),(1.340.43)and(1.210.54)in the control group,and the differences were statistically significant(P0.05).Conclusion The expression of miR-146a can significantly inhibit the proliferation and growth of colon cancer cells.It can be used as a tumor suppressor gene to achieve the role of tumor pathological changes through the impact of tumor cell apoptosis.The detection of miR-146a level can be used to evaluate the prognosis of patients,which is of great value.【Key words】Colon cancer;miR-146a expression;Tumor suppressor genes;Apoptosis临床实验基金项目：江苏省高等学校基础科学(自然科学)面上项目(项目编号：21KJD320006)作者单位：211800江苏卫生健康职业学院生理教研室(王芹),医疗设备教研室(武芳)178中国实用医药2023年8月第18卷第16期China Prac Med,Aug 2023,Vol.18,No.16近 20 年来随着我国经济的发展,人民生活水平的提高和生活方式的改变,尤其在大城市,由于饮食习惯向欧美饮食方式转变,结肠癌发病率明显上升,发病率现在年平均增长 4.2%,估计每年有 40 万新发病例。结肠癌发病率在我国所有恶性肿瘤中位于第 3 位,大约占所有恶性肿瘤的 10.3%,发病率约为 16/10 万。据统计,结肠癌占恶性肿瘤死亡原因的第 5 位,死亡率达到7.42/10 万1。结肠癌的发病率和死亡率均呈现逐年上升驱势,严重威胁着人类健康,成为当前社会重大的公共卫生问题,因此,对结肠癌的发生、发展以及治疗等的研究对改善民生具有重要战略意义。现有研究报道指出,结肠癌的发生与遗传、环境等因素相关,同时也与基因及多分子的异常表达等有相关性,这也成为当前临床研究的重要方向。微小核糖核酸(MicroRNAs)在细胞的多种生活过程中扮演着十分重要的角色,特别是 miR-146a 在胃癌、结肠癌、肺癌等疾病中有着显著的异常表达2,如在肿瘤细胞增殖、肿瘤转移等方面均有异常表达的临床显示。因此,为进一步探究miR-146a 在结肠癌中的表达情况及其对肿瘤增殖等的作用效果,本文选择 26 只体重 1520 g、周龄 6 周的雄性 C57BL/6 小鼠作为实验对象,现将相关研究结果报告如下。1材料与方法1.1动物本次研究选取 26 只体重 1520 g、周龄 6 周的雄性 C57BL/6 小鼠作为实验对象,将其中 13 只 为 miR-146a 基因的小鼠作为对照组,另外 13 只为miR-146a 基因敲除的小鼠作为观察组。1.2实验仪器及试剂由北京众金杉公司生产的免疫组化染色试剂盒等。由美国 Takara 公司生产的聚合酶链式反应(PCR)定量试剂盒、DRR036A 逆转录试剂盒等。由日本奥林巴斯公司生产的 L-25 显微镜。由 Sigma 公司生产的氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)和葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate,DSS)。由美国应用生物公司生产的 PCR 仪。试剂及仪器的使用严格依照操作规范进行,确保实验的科学准确性。1.3动物模型的建立与评价两组实验小鼠均进行相同条件下饲养,并在实验第1天给予小鼠注射8.5 mg/kg 的 AOM,于 7 d 后饮水服用 2%的 DSS,连续饮用 7 d 后给予小鼠正常饮用水,循环进行 3 次。在实验过程中将小鼠的排便情况(如便血程度、粪便形状等)、体重变化情况进行完整记录,并基于以下标准对小鼠排便情况进行评分。粪便形状：0 分：粪便形状处于正常状态；1 分：粪便成形,但稍微有些软；2 分：粪便基本不成形,十分软；3 分：腹泻状态粪便；4 分：痢疾状态粪便。便血程度：0 分：经检验,显示便潜血阴性；1 分：经检验,显示便潜血阳性；2 分：肉眼可见血；3 分：可明显见到直肠出血。1.4相关检测免疫组织化学检测。取死后小鼠的结肠组织作蜡状切片(一般为 4 mm),进行免疫组织化学染色,并经二氨基联苯胺(DAB)显色后于显微镜下进行观察。实时荧光定量 PCR 检测。经提取结肠组织内核糖核酸(RNA)后,基于 DRR306A 逆转录和进行 RNA 逆转录后,进行实时荧光定量 PCR 检测,得出 PCNA、促炎性因子白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、环氧合酶 2(cyclooxygenase-2,COX2)和巨噬细胞炎性蛋白 2(macrophage inflammatory protein 2,MIP2)mRNA 的相对表达量。1.5观察指标比较两组小鼠结肠肿瘤情况(肿瘤数、肿瘤直径)、排便情况(便血程度及粪便形状评分)及PCNA 相对表达量、肿瘤组织中促炎性因子的 mRNA相对表达量。1.6统计学方法采用 SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数 标准差(x-s)表示,采用 t 检验；计数资料以率(%)表示,采用2 检验。P0.05 表示差异具有统计学意义。2结果2.1两组小鼠结肠肿瘤情况比较观察组小鼠的肿 瘤 数(12.483.35)个 明 显 多 于 对 照 组 的(5.23 1.31)个,肿瘤直径(3.570.83)mm 明显大于对照组的(2.020.76)mm,差异具有统计学意义(P0.05)。见表1。2.2两组小鼠排便情况比较观察组小鼠的便血程度及粪便形状评分分别为(2.040.31)、(3.020.48)分,均高于对照组的(1.030.12)、(2.010.33)分,差异具有统计学意义(P0.05)。见表 2。2.3两组小鼠 PCNA 相对表达量比较观察组小鼠的PCNAmRNA 相对表达量(2.740.79)明显高于对照组的(1.030.31),差异具有统计学意义(P0.05)。见图 1。2.4两组小鼠肿瘤组织中促炎性因子的 mRNA 相对表达量比较观察组小鼠肿瘤组织中促炎性因子的 mRNA 相对表达量 IL-6(1.670.69)、COX2(6.58 1.25)、MIP2(7.121.18)均明显高于对照组的(0.91 0.34)、(1.340.43)、(1.210.54),差异具有统计学意义(P0.05)。见表 3。179中国实用医药2023年8月第18卷第16期China Prac Med,Aug 2023,Vol.18,No.16表 1两组小鼠结肠肿瘤情况比较(x-s)组别只数肿瘤数(个)肿瘤直径(mm)观察组1312.483.35a 3.570.83a对照组13 5.231.312.020.76t7.2674.966P 0.0000.000注：与对照组比较,aP0.05表 2两组小鼠排便情况比较(x-s,分)组别只数便血程度粪便形状观察组13 2.040.31a 3.020.48a对照组131.030.122.010.33t10.9556.252P 0.0000.000注：与对照组比较,aP0.05图 1PNCA 免疫组化染色对照组观察组表 3两组小鼠肿瘤组织中促炎性因子的 mRNA 相对表达量比较(x-s)组别只数IL-6COX2MIP2观察组13 1.670.69a 6.581.25a 7.121.18a对照组130.910.341.340.431.210.54t3.56214.29216.421P 0.0000.0000.000注：与对照组比较,aP0.053讨论我国是结肠癌的高发国家,结肠癌的发病率呈上升趋势,并且有年轻化趋势。特别是现代人饮食、生活习惯等的巨大改变,也是导致结肠癌高发的重要因素之一。结肠癌作为一种常见恶性肿瘤,其发生与遗传、环境等因素有关。随着对结肠癌研究的不断深入,大量研究显示,基因及其分子异常表达也可对肿瘤细胞的增殖等形成影响。由于结肠癌早期无典型症状,导致病情发展至一定程度后患者出现严重的便血、腹泻或腹痛等症状3。故而如何对基因及多分子的异常表达的研究分析中,探寻结肠癌早期诊断及治疗预后评估的新机制,对于进一步强化结肠癌的理论与临床实践研究,均具有十分重要的意义,也是当前结肠癌研究的重要领域。因此,本文以 26 只体重 1520 g、周龄 6 周的雄性 C57BL/6 小鼠作为实验对象展开研究,旨在对 miR-146a 在结肠癌表达及其作用进行深入性、全面性探究。目前,结肠癌治疗主要以手术及放化疗为主,但整体治疗效果不理想,患者生活质量显著下降,病死率较高。在基因及多分子研究中发现,miRNA 是一种可对细胞增殖、分化、凋亡等形成调控的内源性单链非编码小 RNA 分子4。故而,在肿瘤的发生及其改变过程中 miRNA 扮演着十分重要的角色。有研究指出,miR-146a 在结肠癌患者的病情发展中起到抑制作用,也就是说,miR-146a 的表达水平越低,则患者的肿瘤细胞增殖、分化程度越高,患者的治疗预后效果不理想,180中国实用医药2023年8月第18卷第16期China Prac Med,Aug 2023,Vol.18,No.16严重影响生存期5。在本文研究中,观察组小鼠的肿瘤数(12.483.35)个明显多于对照组的(5.231.31)个,肿瘤直径(3.570.83)mm 明显大于对照组的(2.02 0.76)mm,差异具有统计学意义(P0.05)。由此提示,miR-146a 可以对结肠癌细胞的侵袭、转移等形成有效的抑制作用。故而,在对患者手术或放化疗治疗效果等的预测评估中,通过对 miR-146a 表达水平的分析可对预后效果进行有效预测,进而为治疗方案的改进起到重要作用。在临床研究中,便血、粪便的形状是评价其肿瘤发展程度的重要方面。本文研究结果显示,观察组小鼠的便血程度及粪便形状评分分别为(2.040.31)、(3.020.48)分,明显高于对照组的(1.030.12)分和(2.010.33)分,差异具有统计学意义(P0.05)。由此可见,敲除基因 miR-146a 的小鼠便血程度更严重,粪便不成形更突出,这也一定程度反应出 miR-146a 可对病情发展形成有效的调控作用,通过对肿瘤细胞增殖、分化及凋亡等的控制以控制患者病情发展,减轻便血等临床症状,这对于更好地提高患者的生活质量具有十分重要的作用,是体现 miR-146a 作用的重要研究内容6。炎性水平的降低是结肠癌治疗的重要内容,也是评价治疗效果的重要评价指标。有研究报道指出,结肠炎性与结肠癌有密切联系,在炎性因子的促进作用下,患者发展至结肠癌的风险增加,如何降低炎性水平对于更好地降低结肠癌发生风险有积极意义7,8。本文研究结果显示,观察组小鼠肿瘤组织中促炎性因 子 的 mRNA 相 对 表 达 量 IL-6(1.670.69)、COX2(6.581.25)、MIP2(7.121.18)均明显高于对照组的(0.910.34)、(1.340.43)、(1.210.54),差异具有统计学意义(P0.05)。由此提示 miR-146a 可以有效抑制促炎性因子(IL-6、COX2、MIP2 等)的表达,这对于抑制肿瘤细胞增殖及分化均有重要作用。有研究报道发现,miR-146a 的表达量与肿瘤分期等有相关性。在对不同肿瘤直径患者比较分析中,肿瘤直径5 cm 患者的 miR-146a 表达量明显低于直径 5 cm 患者,并且对于不同炎性程度患者表达量的差异性不断增加9,10。这也对本次研究结果给出了解释,即炎性水平与 miR-146a 水平有着相关性,特别是 IL-6 是衔接炎症与肿瘤最为核心的炎症因子,IL-6/转录激活子 3(STAT3)信号通路在结肠癌发生发展中具有重要作用。本文对于观察组小鼠敲除基因 miR-146a,患者的炎性水平明显更高,肿瘤细胞增殖发展及分化更显著。因此,通过对 miR-146a 水平的检测可更好地了解患者的炎性情况,进而更好地给予抗炎治疗方案,为手术或放化疗的实施提供良好的治疗条件。此外,miR-146a 作为一种抑炎因子,在 Toll 样受体(TLR)/核因子(NF)-B 信号通路中促炎性因子水平显著性下降,这也进一步表明,miR-146a 的高表达水平可以抑制炎性水平,对肿瘤细胞增殖等形成影响,其可作为结肠癌病情判断及预后效果预测的重要指标11-13。综上所述,miR-146a 的表达可以对结肠癌细胞的增殖及生长起到显著的抑制效果,其可作为一种抑癌基因,通过对肿瘤细胞凋亡的影响实现对肿瘤病理变化的作用,通过对 miR-146a 水平的检测可以对患者预后效果等评估均具有重要的价值。但本次研究也存在不足,如 miR-146a 的抑制作用机制尚不清楚,并且 miR-146a 是否可以作为结肠癌患者的治疗靶点,还需在今后的研究中不断深入探讨,形成更完善的研究结果。参考文献1 Teodori L,Petrignani I,Giuliani A,et al.Inflamm-aging microRNAs may integrate signals from food and gut microbiota by modulating common signalling pathways.Mech Ageing Dev,2019,182(12):111127.2 曾长青,黄良祥,郑羽,等.miR-146a 在结肠癌中的表达及意义.南方医科大学学报,2014,34(3):396-400.3 Karimi N,Ali Hosseinpour FM,Safaralizadeh R,et al.Serum overexpression of miR-301a and miR-23a in patients with colorectal cancer.J Chin Med Assoc,2019,82(3):215-220.4 Lv ZC,Cao XY,Guo YX,et al.Effects of MiR-146a on repair and inflammation in rats with spinal cord injury through the TLR/NF-B signaling pathway.Eur Rev Med Pharmacol 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多态性与结肠癌发生及转移的关系.上海交通大学学报(医学版),2016,36(6):809-813.12 曹锴,狄建彬,魏文祥,等.miRNA 在结肠癌早期诊断和筛选中的作用.世界华人消化杂志,2009,17(35):3615-3619.13 王俊丽,欧阳湖,谢虹雅,等.太子参内生细菌 RPB-32 的分类鉴定及其代谢物对小鼠肠道微生物群落的影响.微生物学通报,2021,48(2):502-515.收稿日期：2023-02-10