干细胞移植离临床应用治疗小儿心脏疾病还有多远.pptx

重庆医科大学儿童医院心内科（400014）重庆医科大学先天性心脏病介入诊治中心干细胞移植离临床应用治疗小儿心脏疾病还有多远？田杰 陈沅 朱静 吕铁伟 张蕾 白永红How far is it to the clinical application of stem cell transplantation in thetreatment of pediatric heart diseaseDeterioration of pump functionHeart failureCritical loss of functional cardiomyocytesAdult cardiomyocytes lack prominent regenerative capacityAlternative therapeutic waysnMedication nPalliative surgerynMechanical ways nHeart transplantation n Cell therapy-Stem Cell Transplantation干细胞治疗心血管疾病目前实验研究的状况 干细胞基础研究临床应用的先导 干细胞来源 胚胎干细胞 （embryonic stem cell,ESC）成体干细胞 (adult stem cell,ASC)骨髓来源（造血干细胞、间充质干细胞等）marrow mesenchymal stem cell,MSCs 肝脏、血管内皮来源 其它（骨骼肌、脂肪、心肌来源等）MSCs的分离方法 密度梯度离心法 贴壁筛选法 流式细胞仪分离法 其它（免疫磁珠法等）nAvailablenEasily to be proliferatednLabel;genetic manipulationnImmune privileges in transplantation：Escape host rejection *易获取 *易扩增*易标记,易于基因操作 *宿主免疫耐受Advantages of MSCs in therapy吕铁伟，田杰等，骨髓间充质干细胞体外适宜分离和培养条件的研究。重庆医科大学学报 2004；29:856-859沈兴，余更生，田杰等 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究。实用医学杂志2006；9：996997 Culture and labelMSCs cultured for 24 hours200MSCs cultured for 3 days 200Mouse吕铁伟，田杰等，骨髓间充质干细胞体外适宜分离和培养条件的研究。重庆医科大学学报 2004；29:856-859沈兴，余更生，田杰等 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究。实用医学杂志2006；9：996997 Culture and label新西兰兔原代培养5天（200）移植前的骨髓MSCs(100)MSCs labeled by DAPI（200）DAPI的细胞标记(100)combined A and B double-labeling rate is 905%MSCs double-labeled with DAPI and BrdUDAPIDAPI标记标记BrdUBrdU标记标记重叠同一视野，双重叠同一视野，双标记率为标记率为90905%5%DAPI staining nuclei of MSCsImmunostaining of BrdU通过实验已证实：MSC在体外微环境（体外加5-氮杂胞苷培养或加心肌细胞混合培养等）的诱导作用下，能够分化为心肌样细胞，并从形态学、组织学等方面给予特异性鉴定（包括心肌特异性蛋白如MHC,Cx43,Titin等和特异性基因Nkx-2.5、GATA-4等的检测）MSC体外分化为心肌样细胞MSC 治疗心脏病的基础可分化有功能的心肌细胞5 5azaaza诱导后的MSCs(200)5 5azaaza诱导前的MSCs(200)MSCs诱导后MHC的检测（200）MSCs诱导后Cx43的检测（200）Cardiomyogenic differentiation of human endometrial progenitor cells通过实验已证实：MSCs在体内微环境（通过直接移植MSCs到正常、心肌梗塞或心肌病心衰活体动物模型的左心室壁心肌组织内）的诱导作用下，能够分化为心肌样细胞，并从形态学、组织学等方面给予特异性鉴定（包括心肌特异性蛋白如MHC,cTnI,Cx43等和特异性基因Nkx-2.5、GATA-4等的检测）MSC体内分化为心肌样细胞MSC 治疗心脏病的基础可分化有功能的心肌细胞吕铁伟，田杰，陈沅等，骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的实验研究。细胞生物学杂志 2004；26(2)：197-203 MSC植入后（DAPI200）MSC植入后（HE200）MSC植入后Cx43的检测(200）MSC植入后MHC的检测(200）干细胞移植的种类 异种异体移植 同种异体移植 同种同体移植 细胞移植方法 心内膜心肌注射 开胸心肌注射 外周血管注射 冠状动脉注射 开胸心肌注射冠状动脉注射阜外医院：比较两种不同途径的移植效果无显著差别（犬）动物实验 小鼠 大鼠 兔子 小型猪 其它（山羊、猴子等）Transplantation主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器分离气管分离气管分离气管分离气管麻醉固定麻醉固定麻醉固定麻醉固定开胸开胸开胸开胸植入细胞植入细胞植入细胞植入细胞关闭胸腔关闭胸腔关闭胸腔关闭胸腔美国通用美国通用Innova 2000 Innova 2000 造影机造影机术前准备术前准备准备导管准备导管心电监护心电监护 介入操作介入操作介入操作介入操作 显示屏指引导管显示屏指引导管显示屏指引导管显示屏指引导管 冠脉造影冠脉造影冠脉造影冠脉造影 心电图心电图心电图心电图 Improved Heart Function after Transplantation JTCS,20024 weeksRepresentative studies and our study on cardiac function using BMCs in heart injured models European Journal of Cardio-thoracic Surgery (2003)with modifications实验研究发现MSCs移植能使局部心肌病变如心肌梗塞的梗塞面积缩小，所致心力衰竭的心功能改善。MSCs移植后2周阿霉素大鼠心肌病的心功能即左室射血分数（LVEF）、左室缩短分数（LVFS）就出现明显回升，表明MSCs移植可以改善弥漫性心肌病变所致心衰的心功能。江德勤，田杰，陈沅等，骨髓间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠心肌结构和功能的影响。细胞生物学杂志2004；26(6)：617-622。*LVEF*LVFS干细胞移植改善心衰的心功能及其可能机制的研究可能机制的研究MSC分化形成新生心肌细胞和血管差异表达基因MSCs和宿主心肌细胞间接触的信号传导 Cx43、缝隙连接和离子通道等Regenerated cells in myocardial infarct regionCardiac myosin expression(red)in transplanted cells(green)Nature(2001)The marrow stromal cells also differentiated into the endotheliumCD31GFPMergerhodamineThe vessels contained RBCRelated gene of improving Related gene of improving Cardiac functionCardiac functionSSHSSHImplanted MSCsImplanted MSCsCulture mediumCulture mediumUpward Upward subtractionsubtractionDownward subtractionDownward subtractionup-regulation genedown-regulation geneDifferential expressive genes by SSH电泳结果显示电泳结果显示电泳结果显示电泳结果显示151151151151个阳性克隆（部分）个阳性克隆（部分）个阳性克隆（部分）个阳性克隆（部分）正向消减探针未消减tester探针反向消减探针未消减driver探针测序分析测序分析 1、表达上调的基因片段筛选出植入筛选出植入BMMSCsBMMSCs后心肌组织表达上调为后心肌组织表达上调为1313条，条，其功能主要分为两类其功能主要分为两类 线粒体合成有关的基因线粒体合成有关的基因 心肌的收缩蛋白有关的基因心肌的收缩蛋白有关的基因 2 2、表达下调的基因片段、表达下调的基因片段 我们筛选出表达下调的基因片段我们筛选出表达下调的基因片段4 4条条 肌小节的线粒体肌氨酸激酶基因肌小节的线粒体肌氨酸激酶基因 核糖体的磷蛋白核糖体的磷蛋白P2P2基因基因 晶状体蛋白基因晶状体蛋白基因 NADHNADH辅酶辅酶Q Q氧化还原酶氧化还原酶FeFeS S蛋白蛋白7 7基因基因Ion channel geneExpression of KV4.3 mRNA in the procession ofMSCs differentiating into cardiomyocytesExpression of 1C mRNA in the procession ofMSCs differentiating into cardiomyocytes王金菊，田杰等 经BMMSCs诱导分化的心肌样细胞离子通道基因的表达。基础医学与临床 2007；1：36-39 morphology of transplantiated MSCs in myocardial section with HE stainDisk formation 4th week after MSCs implantation吕铁伟，田杰等，骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察。重庆医科大学学报 2003；28：463-466 研究发现，MSC移植能改善衰竭的心功能，并发现MSCs移植后早早期期心功能的改善与心肌线粒体酶类及收缩蛋白类等相关基因表达上调有关，而后后期期心功能的改善与MSCs分化为具有功能的成熟心肌细胞以及细胞间信号传导通路等形成有关。干细胞定向分化心肌细胞及其分化调控机制探讨心肌细胞发育相关调控基因的表达细胞间相互作用 MSC与心肌细胞直接接触促进高分化结构蛋白的正常组装与MSCs分化密切相关组蛋白乙酰化修饰在MSCs分化中的调控作用 0d 1d 1w 2w 3w 4w 6w 8w N M 0d 1d 1w 2w 3w 4w 6w 8w N MTGF-(313bp)Nkx-2.5(216bp)MEF-2C(347bp)GATA-4(275bp)n半定量RT-PCR显示TGF-,Nkx-2.5,GATA-4,MEF-2CTGF-,Nkx-2.5,GATA-4,MEF-2C基因mRNA在5aza诱导后1d表达开始增强，在诱导后1w时达高峰，以后维持在高水平nTEF-1和RAR基因mRNA在5aza诱导前后无明显变化骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞相关调控基因的时序表达张文，田杰等 骨髓间充质干细胞体外分化为心肌细胞相关调控基因的时序表达。中华心血管病杂志 2004；32：1004-1008 0d 1d 1w 2w 3w 4w 6w 8w N MNkx-2.5(216bp)0d 1d 1w 2w 3w 4w 6w 8w N MGATA-4(275bp)nNkx-2.5Nkx-2.5和GATA-4GATA-4基因mRNA植入后1d表达开始增强，在植入后1w时达高峰，以后维持在高水平。nTGF-、MEF-2C、TEF-1和RAR基因mRNA在植入前后无明显变化。骨髓间充质干细胞体内分化为心肌样细胞相关调控基因的时序表达张文，田杰等，大鼠骨髓间充质干细胞体内分化为心肌细胞的相关基因。基础医学与临床 2006;26:55-60MSCMyocyte混合培养MSCs的titin（肌联蛋白）的表达,可见到肌小节样结构MSC 与心肌细胞直接接触促进高分化RNA干扰5-aza诱导2周的BMMSCs，titin，cTnI明显减少，MHC不受影响 王金菊，田杰等 Titin基因在骨髓间充质干细胞体外分化为心肌细胞过程中的干预研究。重庆医科大学学报 2007；11：11211125张小飞，陈沅，田杰等，骨髓间充质干细胞体外分化为心肌细胞过程中结构蛋白的发育。基础医学与临床 2006；26（7）：710714结构蛋白的正常组装与MSCs分化密切相关组蛋白乙酰化修饰在MSCs分化中的调控作用免疫细胞化学结果经荧光显微镜图像分析,其中，左图 DAPI染色MSCs细胞核（荧光显微镜x400）；中图 shRNA 质粒共转染MSCs，GFP显示集中于胞核。（荧光显微镜x400）；右图 shRNA质粒共转染MSCs 后TRITC特异性显示乙酰化作用蛋白表达情况:表达减弱“淡染核”或不表达的“空洞核”现象（荧光显微镜x400）。以上三图为同一视野。535272 M 1 2 3 4 5 6 7 8M：分子量标准DL2000；1：正常组-actin；2：正常组GATA4；3：阴性对照组-actin；4：阴性对照组GATA4；5：空白对照组-actin；6：空白对照组GATA4；7：实验组-actin；8：实验组GATA4组蛋白乙酰化修饰在MSCs分化中的调控作用临床应用研究状况 2001年德国多夫大学医学院报道了将骨髓干细胞直接注射到6例心肌梗塞病人的冠状动脉内，术后10周患者心肌梗塞面积缩小近1/3，心功能得到改善。从此，加快了基础研究和临床应用的步伐。心内膜心肌干细胞临床治疗心血管疾病的方式 移植治疗 干细胞动员 移植治疗的途径选择 经冠状动脉血管注射 心内膜心肌内注射，应用NOGA系统定位 开胸后心外膜心肌内注射 静脉注射，极少采用 移植治疗的细胞类型选择 混合细胞群 亚群细胞 常用 骨髓单个核细胞 内皮祖细胞 CD133阳性细胞 骨髓间充质干细胞 移植治疗的时机选择 心肌梗塞后2周获益最大（炎症反应消退，疤痕形成前）移植治疗的剂量选择 一般认为，106-108 可能出现的副作用和预防微血管栓塞心律失常 移植治疗所需的基本条件丰富的冠脉介入经验和设备具备临床级的层流间和细胞分离间干细胞专业人员近年国内成体干细胞的临床应用 治疗心肌梗塞 葛均波等对20例急性心肌梗塞病人于PCI后随机分为骨髓单个核细胞移植组和治疗组，支架植入后2小时通过导管将自体骨髓单个核细胞注射到梗死相关动脉，6个月后移植组 LVEF 与第1周相比有明显改善，心肌灌注缺损积分降低，而且支架内再狭窄率降低，未发现与移植相关血栓形成、感染或合并心律失常。认为细胞移植于心肌梗塞发生1年内进行具有更佳的疗效。近年国内成体干细胞的临床应用 治疗心肌缺血缺血心肌即“冬眠”心肌，如果重新给予正常血供，可使这些“冬眠”心肌成为正常心肌。内皮祖细胞可通过自身的分化，增殖而形成新生血管有学者将体外培养的成人内皮祖细胞注入大鼠心肌梗死模型中，发现移植的内皮祖细胞聚集在心肌缺血区，并参与了心肌组织内新血管的形成。局部心室室壁运动和毛细血管密度显著优于对照组。近年国内成体干细胞的临床应用 治疗心肌缺血Hung-Fat等将骨髓干细胞移植入8名有顽固性心绞痛病人心脏中，并于移植前与移植后3个月比较，发现缺血心肌的厚度、运动速率、心肌灌注均显著提高。近年国内成体干细胞的临床应用治疗扩张型心肌病沈振亚等将MSCs移植治疗扩张型心肌病中晚期充血性心衰患者，利用DSA下冠状动脉注射法，使15例患者临床症状改善，EF、CI明显增加，说明在此类心脏疾病上，MSCs在临床上是安全和可行的。近年国内成体干细胞的临床应用 治疗心功能不全Emerson等对有严重心肌缺血而没有其他血管重建治疗可选择的终末期心脏病病人进行了骨髓干细胞移植，并与标准治疗组对照，2个月与4个月后通过SPECT进行心功能评价，左室射血分数从20增至29（P0.003），心室收缩末期容量从174.1cc下降至133.5 cc（P=0.03）研究表明骨髓干细胞能分化为心肌细胞和内皮细胞，增加有效心肌数目，恢复心肌收缩力，促使局部新生血管形成，增加毛细血管密度，降低肥厚心肌的细胞凋亡，减少胶原形成。近年国内成体干细胞的临床应用 治疗心律失常构建生物起搏器是目前干细胞移植治疗心律失常的典型例子。阜外医院：移植MSCs到窦房结和房室结可以提高犬病窦综合征模型的心率和改善房室传导阻滞。近年国内成体干细胞的临床应用干细胞动员辽宁省人民医院首先探讨了对急性心肌梗塞患者应用G-CSF行自体外周干细胞动员的效率与安全性，发现在G-CSF动员后第6天CD34+细胞数量达到高峰，此时分离出外周血干细胞，经冠状动脉内回输，术后6个月随访，移植后LVEF明显增加，左室舒张末期容积无明显差异，结论为细胞动员及移植较为安全可行，提高LVEF，但对左室重构无影响。第一届全国干细胞移植在心血管疾病中应用墍第二届全国干细胞治疗终末期心血管疾病研讨会 2005年8月 上海干细胞移植技术的临床应用在国内发展迅猛似呈燎原之态第三届全国干细胞移植在心血管疾病中应用墍第四届全国干细胞治疗终末期心血管疾病研讨会 2007年11月 杭州From bedside back to benchFrom bench quickly to bedside强调对干细胞定向调控机制的研究临床应用研究 存在的问题1.干细胞能否到达心肌的受损部位？2.干细胞在缺血、缺氧与组织坏死等恶劣环境下，如何生存？如何能改善心功能？如何能进一步分化为靶细胞？临床应用研究 存在的问题3.移植后新生细胞能否与实际需要的心脏其他细胞在种类、数量、位置、结构与功能上的全面配合？如心肌细胞、神经纤维、血管平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。4.移植后新生细胞能否与原有心脏组织整合维持终身？临床应用研究 存在的问题5.新生的心肌细胞发育阶段是否会受到体内免疫系统的攻击？6.移植的干细胞是否会形成新的畸形瘤或其他不需要的组织细胞类型？7.细胞标记和示踪技术不完善临床应用研究 目前还未见干细胞在儿科心脏疾病治疗的临床应用报道，那么干细胞移植离临床应用治疗小儿心脏疾病还有多远？小儿心血管疾病病不是成年的缩影，小儿心血管系统有个逐渐成熟健全的过程；面临更大的挑战，小儿处于生长发育阶段，机体免疫排斥反应能力相对低下，抵御外来物能力弱，干细胞移植后致畸可能更大，这样以来没有发挥治疗作用，反而加重了机体的损害；临床应用研究 目前还未见干细胞在儿科心脏疾病治疗的临床应用报道，那么干细胞移植离临床应用治疗小儿心脏疾病还有多远？干细胞植入相对不发达的心血管系统，没有丰富的依赖微环境，其定向分化的能力弱，除不能有效与宿主心肌细胞发生整合、达到改善心功能的作用外，容易导致恶性心血管事件如心律失常等的发生，这些因素均制约干细胞移植治疗小儿心血管疾病的临床应用。复活死鼠心脏美科学家美国自然医学杂志2008年1月13日报道Thanks toThanks toThanks toThank you for your attentionWelcome to our UnitOutpatient roomInpatient wardEcho roomElectrocardiogram roomCardiac Cath LabChildrens HospitalWelcome to Chongqing