PCR原理及其操作.ppt

PCR反应原理及其操作生物化工生物化工韩韩 栋栋 1.PCR的基本原理的基本原理 2.PCR反应体系反应体系 3.PCR的基本步骤的基本步骤 4.PCR反应五要素反应五要素 5.PCR 的反应流程的反应流程PCR的基本原理的基本原理vv试管中管中进行的行的DNA复制反复制反应，依据，依据DNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变性性和复性和复性的性的性质；vv通通过人人为控控制制体体外外合合成成系系统的的温温度度，使使双双链DNA变成成单链，单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，DNA聚聚合合酶使使引引物物沿沿着着单链模模板板延延伸伸为双双链DNA。PCR反反应体系体系v4种dNTP混合物 各200umol/Lv引物 各10100pmolv模板DNA 0.12ugvTaq DNA聚合酶 2.5uvMg2+1.5mmol/LPCR的基本步的基本步骤 7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的基本步的基本步骤v1.变性：高温使双链变性：高温使双链DNA解离形成单解离形成单链（链（94，30s）。）。v2.退火：低温下，引物与模板退火：低温下，引物与模板DNA互互补区结合（补区结合（55，30s）。）。v3.延伸：中温延伸。延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化聚合酶催化以引物为起始点的以引物为起始点的DNA链延伸反应链延伸反应（7072，3060s）PCR的基本步的基本步骤1234522557294时间（min）温度（）低温退火2高温变性1适温延伸3重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍高温高温变性性低温退火低温退火中温延伸中温延伸uuPCR每每一一步步的的转换通通过温温度度的的改改变控控制制。DNA模模板板解解链（变性性）、引引物物与与模模板板结合合（退退火火）、DNA聚聚合合酶催催化化新新生生DNA的的合合成成（延延伸伸）三三个步个步骤构成构成PCR反反应的一个循的一个循环。uu此此循循环反反复复进行行，可可使使目目的的DNA得得以迅速以迅速扩增。增。uu理理论扩增增率率：2n递增增（n为循循环次次数数），2530循循环，目目标DNA可可增增加加109倍。倍。uu实际扩增增率率：()n，X为PCR的的实际扩增率，增率，平均平均约为75%。uu由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗，酶活活力力的的下下降降等等因因素素，扩增增产物物的的增增加加，逐逐渐由由指指数数形形式式变为线性性形形式式，所所以以实际上上进行行30个个循循环后后，扩增增倍倍数数一一般般可可达达106107。uu以以上上“变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为PCR一一轮循循环。PCR扩增曲增曲线PCR反应五要素反应五要素v1.引物引物（primer）v2.酶酶（Taq DNA polymerase）v3.dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）v4.模板模板（template）v5.Mg2+（magnesium）1.引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的特产物的特异性取决于引物与模板异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。引物设计的原则引物设计的原则引物长度：引物长度：15-30bp，常用为，常用为20bp左右；左右；引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至为宜，特定条件下可扩增长至10kb；引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构：避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是避免两条引物间互补，特别是3端的端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物引物3端的碱基应严格要求配对：端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；失败；引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物量引物量引物量引物量：每每每每条引物的浓度条引物的浓度条引物的浓度条引物的浓度0.1 0.50.1 0.5 MM，以最低引物量产生所需要的，以最低引物量产生所需要的，以最低引物量产生所需要的，以最低引物量产生所需要的结果为好结果为好结果为好结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会2.酶及其浓度酶及其浓度目前有两种目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：聚合酶供应：天然酶：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：基因工程酶：大肠菌合成大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U（指总反应体积（指总反应体积为为100l时）；时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。量减少。3.dNTP的质量与浓度的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：扩增效率有密切关系：dNTP呈颗粒状呈颗粒状，保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTP溶溶液液呈呈酸酸性性，使使用用时时应应配配成成高高浓浓度度后后，以以1M NaOH或或1M Tris-HCl的的缓缓冲冲液液将将其其pH调调节节到到7.07.5，小小量量分分装装，-20冰冰冻冻保保存。多次冻融会使存。多次冻融会使dNTP降解降解在在PCR反反应应中中，dNTP应应为为50200umol/L，尤尤其其是是注注意意4种种dNTP的的浓浓度度要要相相等等（等等摩摩尔尔配配制制），如如其其中中任任何何一一种种浓浓度度不不同同于于其其它它几几种种时时（偏偏高高或或偏偏低低），就就会会引引起起错错配配。浓浓度度过过低又会降低低又会降低PCR产物的产量产物的产量dNTP 能能与与Mg2+结结合合，使使游游离离的的Mg2+浓浓度度降降低低4.模板（靶基因模板（靶基因target gene）模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；成败的关键环节之一；传统传统DNA纯化方法：纯化方法：采用采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K来消化处理标来消化处理标本；本；SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合还能与蛋白质结合而沉淀；而沉淀；蛋白酶蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。反应。临床检测标本临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于接用于PCR扩增；扩增；RNA模板提取：模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止法，要防止RNase降解降解RNA5.Mg2+浓度浓度vMg2+对对PCR扩增的特异性和产量有扩增的特异性和产量有显著的影响显著的影响;v在一般的在一般的 PCR反应中，各种反应中，各种NTP浓浓度为度为200mol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mmol/L为宜为宜;vMg2+浓度过高，反应特异性降低，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，出现非特异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产聚合酶的活性，使反应产物减少。物减少。PCR 的反应流程的反应流程1.温度与时间的设置温度与时间的设置2.循环次数循环次数1、温度与时间的设置、温度与时间的设置v设置变性-退火-延伸三个温度点v标准反应中采用三温度点法三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸，v对于较短靶基因（长度100300bp）可采用二温度点法二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。变性温度与时间：变性温度与时间：v一般一般9394，1min足以使模板足以使模板变性变性若低于若低于93则需延长时间则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。活性有影响。退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：v退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的重要因素特异性的重要因素v退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度组成及其浓度，还有靶基因序列的长度v对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想作为选择最适退火温度的起点较为理想vTm（解链温度）（解链温度）4(G+C)+2(A+T)v复性温度复性温度=Tm值（值（510）在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性反应的特异性v复性时间一般为复性时间一般为3060s，足以使引物与模，足以使引物与模板之间完全结合板之间完全结合引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：延伸温度与时间延伸温度与时间：v延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间常用温度为常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。v延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min（足够）（足够）34kb的靶序列需的靶序列需34min扩增扩增10kb需延伸至需延伸至15minv延伸时间过长会导致非特异性扩增延伸时间过长会导致非特异性扩增v对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2、循环次数、循环次数v循环次数循环次数决定决定PCR扩增程度扩增程度v循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNA的浓度的浓度v循环次数：循环次数：选在选在3040次之间次之间v循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多多