APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用.pdf

第 50 卷 第 1 期2024年 1 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.1Jan.2024DOI：10.13481/j.1671587X.20240105APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用王岩,李晓慧,季瑶,崔理立,蔡玉洁（广东医科大学附属医院 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东 湛江 524001）摘要 目的目的：探讨载脂蛋白 E（APOE）基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用，为阿尔茨海默病（AD）发病机制的研究提供理论依据。方法方法：体外分离培养 APOE 基因敲除小鼠（APOE-/-）原代皮层星形胶质细胞，免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。构建人 APOE3 和 APOE4重组过表达质粒，分别转染至原代 APOE-/-星形胶质细胞中，以 APOE-/-原代细胞为对照，采用Western blotting法检测细胞中 APOE 和神经胶质酸性蛋白（GFAP）蛋白表达水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞培养上清中 APOE 水平。采用白细胞介素 1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）和补体 C1q 联合刺激转染 APOE3和转染 APOE4 的原代星形胶质细胞制备炎症模型，分为APOE3+PBS组、APOE4+PBS组、APOE3+IL-1+TNF+CC1q组和 APOE4+IL-1+TNF+C1q组，采用细胞免疫荧光染色法观察各组细胞形态表现，采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中磷脂酰肌醇蛋白聚糖 4（Gpc4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 6（Gpc6）、血小板反应蛋白 1（Thbs1）、血小板反应蛋白 2（Thbs2）、酸性分泌蛋白类似蛋白 1（Sparcl1）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、C3和 S100钙结合蛋白 B（S100B）mRNA 表达水平，微球吞噬实验检测各组细胞吞噬能力，Western blotting法检测各组细胞中 B 细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3（Caspase-3）蛋白表达水平。结果结果：与 APOE-/-组比较，转染 APOE3 和 APOE4 组细胞中APOE 和 GFAP 蛋白表达水平及细胞培养上清中 APOE 水平明显升高（P0.01）。荧光显微镜下观察，分 别 与 APOE3+PBS 组 和 APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组 和APOE4+IL-1+TNF+Cq1组星形胶质细胞突起变短，胞体变大；与APOE3+IL-1+TNF+Cq1组比较，APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组星形胶质细胞突起更短。分别与 APOE3+PBS 组和 APOE4+PBS 组比较，APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组和 APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组细胞中 Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2和 Sparcl1 mRNA 表达水平明显降低（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+Cq1组比较，APOE4+IL-1+TNF+Cq1组细胞中 Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2和 Sparcl1 mRNA 表达水平明显降低（P0.05 或 P0.01）。分 别 与 APOE3+PBS 组 和 APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+Cq1组和 APOE4+IL-1+TNF+Cq1组细胞中 GDNF mRNA 表达水平明显降低（P0.01），C3 和 S100B mRNA 表达水平明显升高（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组比较，APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组 细 胞 中 GDNF mRNA 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.05），C3和 S100B mRNA 表达水平明显升高（P0.05）。分别与 APOE3+PBS 组和 APOE4+PBS 组比较，APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组和 APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组 细 胞 吞 噬 微 珠 数 量 明 显 减 少；与 APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组比较，APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组细胞吞噬微珠数量明显减少。分别与APOE3+PBS 组 和 APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组 和 APOE4+IL-1+TNF+Cq1组细胞中 Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P0.05或 P0.01），Caspase-3蛋白表达水平明文章编号 1671587X(2024)01003309收稿日期 20230317基金项目 国家自然科学基金项目（81671181）；广东省科技厅自然科学基金项目（2022A1515010593）；广东医学院科 研基金项目（GDMUM2020011）作者简介 王岩（1984），女，甘肃省兰州市人，助理研究员，理学博士，主要从事阿尔茨海默病发病机制方面的 研究。通信作者 蔡玉洁，助理研究员，硕士研究生导师（E-mail：）33第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）显升高（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+Cq1 组比较，APOE4+IL-1+TNF+Cq1 组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P0.01），Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P0.05）。结论结论：APOE4 基因型比 APOE3 诱导炎症因子能力更强，可诱导神经毒性反应性星形胶质细胞表型，增加神经毒性，影响星形胶质细胞凋亡，从而加剧神经元损伤。关键词 阿尔茨海默病；星形胶质细胞；载脂蛋白 E；基因多态性；细胞凋亡；神经毒性中图分类号 R742文献标志码 ADifferential effects of APOE polymorphism in neurotoxicity-responsive astrocytes induced by inflammatory factorWANG Yan,LI Xiaohui,JI Yao,CUI Lili,CAI Yujie（Guangdong Provincial Key Laboratory of Age-Related Cardiac and Cerebral Diseases，Affiliated Hospital，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China）ABSTRACT Objective：To discuss the differential effects of apolipoprotein E（APOE）gene polymorphism in the neurotoxicity-reactive astrocytes，and to provide the theoretical basis for the study of the pathogenesis of Alzheimers disease（AD）.Methods：The primary cortical astrocytes from the APOE-knockout mice（APOE-/-）were isolated and cultured in vitro，and the purity of the cells was identified by immunofluorescence staining.The human APOE3 and APOE4 recombinant over-expression plasmids were constructed and separately transfected into the primary APOE-/-astrocytes，and the APOE-/-primary cells were regarded as control.Western blotting method was used to detect the expression levels of APOE and glial fibrillary acidic protein（GFAP）proteins in the cells；enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method was used to detect the APOE level in the cellular culture supernatant.The inflammatory models were prepared with the primary astrocytes transfected with APOE3 and APOE4 and co-stimulated with interleukin-1（IL-1），tumor necrosis factor（TNF），and complement C1q.The cells were divided into APOE3+PBS group，APOE4+PBS group，APOE3+IL-1+TNF+C1q group，and APOE4+IL-1+TNF+C1q group.Cell immunofluorescence staining method was used to observe the morphology of the cells in various groups；real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method was used to detect the expression levels of glypican 4（Gpc4），glypican 6（Gpc6），thrombospondin 1（Thbs1），thrombospondin 2（Thbs2），SPARC-like protein 1（Sparcl1）and glial cell line derived neurotrophic factor（GDNF），C3，and S100 calcium binding protein B（S100B）mRNA in the cells in various groups；microsphere phagocytosis assay was used to detect the phagocytic capacities of the cells in various groups；Western blotting was used to detect the protein expression levels of B-cell lymphoma 2（Bcl-2），and cysteinyl aspartate specific protease-3（Caspase-3）proteins in the cells in various groups.Results：Compared with APOE-/-group，the expression levels of APOE and GFAP proteins in the cells and the APOE level in the cellular culture supernatant in transfected APOE3 and transfected APOE4 groups were increased（P0.01）.The fluorescence microscope observation results showed that compared with APOE3+PBS and APOE4+PBS groups，the astrocytic processes in APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group and APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group became shorter and the cell bodies became larger；compared with APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group，the astrocytic processes in APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were even shorter.Compared with APOE3+PBS and APOE4+PBS groups，the expression levels of Gpc4，Gpc6，Thbs1，Thbs2，and Sparcl1 mRNA in the cells in APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group and APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were significantly decreased（P0.01）；compared with APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group，the expression levels of Gpc4，Gpc6，Thbs1，34王岩，等.APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用Thbs2，and Sparcl1 mRNA in the cells in APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were significantly decreased（P0.05 or P0.01）.Compared with APOE3+PBS and APOE4+PBS groups，the expression levels of GDNF mRNA in the cells in APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group and APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were decreased（P0.01），and the expression levels of C3 and S100B mRNA were increased（P0.01）；compared with APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group，the expression level of GDNF mRNA in the cells in APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group was decreased（P0.05），and the expression levels of C3 and S100B mRNA were increased（P0.05）.Compared with APOE3+PBS group and APOE4+PBS group，the numbers of hagocytosis of microspheres in the cells in APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group and APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were significantly decreased；compared with APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group，the number of hagocytosis of microspheres in the cells in APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group was significantly decreased.Compared with APOE3+PBS group and APOE4+PBS group，the expression levels of Bcl-2 protein in the cells in APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group and APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group were decreased（P0.05 or P0.01）and the expression levels of Caspase-3 protein were significantly increased（P0.01）；compared with APOE3+IL-1+TNF+Cq1 group，the expression level of Bcl-2 protein in the cells in APOE4+IL-1+TNF+Cq1 group was decreased（P0.01），and the expression level of Caspase-3 protein was increased（P0.05）.Conclusion：The APOE4 genotype has a stronger ability to induce the inflammatory factors compared with APOE3；it can lead to a neurotoxicity-reactive astrocyte phenotype，increase the neurotoxicity，affect the astrocyte apoptosis，and aggravate the neuron damage.KEYWORDS Alzheimers disease；Astrocyte；Apolipoprotein E；Gene polymorphism；Apoptosis；Neurotoxicity阿尔茨海默病（Alzheimer s disease，AD）作为多发于老年人的以痴呆为主要症状的神经退行性疾病，是一种主要由遗传和环境等因素共同引起的复杂疾病，其主要临床特征是渐进性记忆功能减退和认知能力下降，是危害我国老年人群健康的重大疾病 1-2。在发病机制上，AD 是由于神经元外毒性淀粉样蛋白寡聚体和蛋白质及过度磷酸化 Tau蛋白导致神经元内神经原纤维缠结、神经炎症、突触功能障碍和神经元丢失，最终导致认知功能下降3-5。目前已确定 AD 的致病风险基因有多种6，其 中 载 脂 蛋 白 E4（apolipoprotein E4，APOE4）是目前已知的最高危致病基因。APOE4 基因存在于约 15%的人群中，增加了 AD的发病风险，降低了 AD患者的发病年龄 7。中枢神经系统中载脂蛋白 E（apolipoprotein E，APOE）主要由星形胶质细胞分泌，并通过受体介导的内吞作用将含有 APOE 的脂蛋白颗粒递送至神经元，以支持膜稳态、突触完整性和损伤修复等8。研究9-10显示：神经慢性炎症对 AD 发病具有重要的推动作用，活化的星形胶质细胞可分泌多种炎症因子影响 AD 的病理进程。因此，研究 APOE多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用对探讨 AD 发病机制具有重要意义。本研究通过细胞实验分析 APOE基因多态性对神经毒性反应性星形胶质细胞中产生的突触生长因子、神经损伤因子、神经营养因子和细胞凋亡的影响，为 AD提供新的治疗途径。1 材料与方法 1.1 实 验 动 物实 验 动 物、主 要 试 剂 和 仪 器主 要 试 剂 和 仪 器 APOE 敲 除（APOE-/-）小鼠购自苏州赛业生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2020-0006，饲养于SPF级动物房。本研究经广东医科大学实验动物中心动物伦理委员会批准，用于繁殖乳鼠。DMEM高糖培养基、双抗、胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司，转染试剂 Liposuction LTX 和白细胞介素 1（interleukin-1，IL-1）购自美国 Thermo 公司，补 体 C1q、一 抗 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和 APOE 购自美国Abcam 公司，TRIzol购自美国 Invitrogen 公司，反转录试剂盒和 SYBR Green PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公 司，载 脂 蛋 白 E3（apolipoprotein E3，APOE3）和 APOE4 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美 国 RB 公 司，肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）、一 抗 B 细 胞 淋 巴 瘤 2（B-cell 35第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）lymphoma-2，Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水 解 酶 3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和 内 参 -actin 购 自 美 国 CST 公 司，HRP 标记的二抗购自美国 Jackson 公司，荧光微珠购自美国 Sigma公司，蛋白裂解液购自上海碧云天生物科技有限公司，ECL 试剂盒购自美国密理博公司。C600 多功能荧光分子成像系统购自美国Azure Biosystems 公司，实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪购自瑞士 Roche公司。1.2APOE/原代星形胶质细胞的提取原代星形胶质细胞的提取、分离分离、培培养和鉴定养和鉴定按照参考文献 11 中的方法，从出生13 d APOE-/-小鼠大脑中分离出原代皮层星形胶质细胞。将分离出的 APOE-/-星形胶质细胞在含有 10%灭活胎牛血清和 1%双抗的新鲜 DMEM 高糖培养基中培养 78 d，每 3 d换液 1次。待细胞长满培养瓶，180 r min1摇动 30 min，240 r min1摇动 6 h 除去小胶质细胞和少突胶质细胞。更换新鲜培养液培养，胰酶消化传代。星形胶质细胞的纯度通过细胞免疫荧光染色对细胞标记物 GFAP表达进行表征，显微镜下观察细胞形态表现。1.3质粒的构建质粒的构建、转染和转染效率转染和转染效率根据 APOE蛋白 112 位 氨 基 酸 的 差 异 构 建 APOE3（Cys112，Arg158）和 APOE4（Arg112，Arg158）过表达质粒。分别将空载质粒、APOE3和 APOE4质粒转染至原代 APOE-/-星形胶质细胞，分别为APOE-/-组、转染 APOE3 组和转染 APOE4 组，转染后 48 h 在荧光倒置显微镜下观察活细胞中增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表 达情况。收集细胞采用 Western blotting法检测转染效率。收集细胞上清，采用 ELISA 法检测各组细胞分泌至细胞外的 APOE水平。1.4神经毒性神经毒性 A1型星形胶质细胞模型建立型星形胶质细胞模型建立采用IL-1+TNF+C1q 联合刺激星形胶质细胞建立神经毒性 A1型星形胶质细胞模型：分别转染 APOE3和 APOE4过表达质粒的原代 APOE-/-星形胶质细胞培养至实验需要时间，更换为含终浓度 3 g L1 IL-1+30 g L1 TNF+400 g L1 C1q 的 新 鲜DMEM 高糖完全培养基，加入等量 PBS 缓冲液作为对照组，培养 24 h 后荧光显微镜下观察各组（APOE3+PBS 组、APOE4+PBS 组、APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 和 APOE4+IL-1+TNF+C1q组）细胞形态表现，收集各组星形胶质细胞用于后续实验。1.5RT-qPCR 法检测各组细胞中突触生长因子法检测各组细胞中突触生长因子、胶质细胞源性神经营养因子胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、）、C3 和和 S100 钙结合蛋钙结合蛋白白 B（S100 calcium binding protein B，S100B）mRNA 表 达 水 平表 达 水 平 细 胞 分 组 见“1.4”。采 用TRIzol 提取细胞总 RNA，使用反转录试剂盒反转录合成 cDNA。采用 RT-qPCR 法，通过 Roche 96荧光定量 PCR 仪和 SYBR Green PCR 试剂盒检测各 组 星 形 胶 质 细 胞 中 磷 脂 酰 肌 醇 蛋 白 聚 糖 4（glypican 4，Gpc4）、磷 脂 酰 肌 醇 蛋 白 聚 糖 6（glypican 6，Gpc6）、SPARC 样 蛋 白 1（SPARC like protein 1，Sparcl1）、血 小 板 反 应 蛋 白 1（thrombospondin 1，Thbs1）、血 小 板 反 应 蛋 白 2（thrombospondin 2，Thbs2）、GDNF、C3 和S100B mRNA 表达水平。引物由上海生工生物工程 有 限 公 司 合 成，以 GAPDH 作 为 内 参，采 用2Ct法计算目的基因 mRNA 表达水平，实验重复3次。引物序列见表 1。1.6ELISA 法检测各组细胞培养上清中法检测各组细胞培养上清中 APOE 水水平平 收 集 各 组 细 胞 的 培 养 上 清，采 用 APOE ELISA 检测试剂盒，按照试剂盒说明书中的方法表表 1RT-qPCR引物序列引物序列TabTab.1 1Primer sequences of RTPrimer sequences of RT-qPCRqPCRPrimerGpc4Gpc6Sparcl1Thbs1Thbs2GDNFC3S100BGAPDHSequence(53)F:CTCAAGTCGAAAAGTTGCTCGGR:TGGTCACCGTTGATCTCATAGAF:TCCGGGCTGTGATTCTTCCTR:CCTTGGCACCGTAAGCCTGF:GGCAATCCCGACAAGTACAAGR:TGTAGCGTCTTCCGGTGTCAF:CCTGCCAGGGAAGCAACAAR:ACAGTCTATGTAGAGTTGAGCCCF:CTGGGCATAGGGCCAAGAGR:GTCTTCCGGTTAATGTTGCTGATF:TTCCTGGCTGTTACGTTAAGCR:GCCATTTGCATCAATCAAGCAF:GCAGAGACCCTACGGGTGAR:GGTGGCATCTTCGGTCGTGF:TGGTTGCCCTCATTGATGTCTR:CCCATCCCCATCTTCGTCCF:AAGAGGGATGCTGCCCTTACR:TACGGCCAAATCCGTTCACA36王岩，等.APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用检 测 星 形 胶 质 细 胞 分 泌 的 APOE 水 平，实 验 重复 3次。1.7Western blotting 法检测各组细胞中法检测各组细胞中 APOE、GFAP、Bcl-2 和和 Caspase-3 蛋白表达水平蛋白表达水平各组细胞处理后加入蛋白裂解液裂解离心收集总蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%牛奶封闭后加入APOE、GFAP、Bcl-2、Caspase-3 和-actin 抗体，4 孵育过夜，分别加入 HRP标记的二抗稀释液室温孵育 1 h；采用 ECL 化学发光显色试剂盒进行检测，使用 C600 多功能荧光分子成像系统曝光并拍照。采用 Quantity One 软件分析各蛋白条带灰度值，以-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/-actin 蛋白条带灰度值，实验重复 3次。1.8荧光微珠吞噬实验检测各组细胞吞噬能力荧光微珠吞噬实验检测各组细胞吞噬能力将荧光微珠以终浓度 0.01%（V/V）添加至新鲜的 DMEM 完全培养基中，充分混匀，置于37 细胞培养箱孵育 1 h，随后加入各组处理的星形胶质细胞中，置于 37 细胞培养箱孵育 3 h。用PBS 缓冲液洗涤 3 次洗去多余的荧光微珠，4%多聚甲醛固定，倒置荧光显微镜下观察，计数细胞吞噬微珠数量，代表星形胶质细胞的吞噬能力。1.9 统 计 学 分 析统 计 学 分 析 采 用 GraphPad Prism 5.0 和Quantity One 统计软件进行统计学分析。各组细胞培养上清中 APOE水平，各组细胞中 Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2、Sparcl1、GDNF、C3 和 S100B mRNA 表 达 水 平，各 组 细 胞 中 APOE、GFAP、Bcl-2 和 Caspase-3 蛋白表达水平，均以 xs 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用 SNK-q检验。以 P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1星形胶质细胞的纯化和鉴定星形胶质细胞的纯化和鉴定对 APOE-/-小鼠的星形胶质细胞进行提取纯化。培养 21 d 后，荧光显微镜下观察：星形胶质细胞表现出明显的形态特征，形状不规则，边界清晰，细胞体形态丰满扁平，细胞相互连接。免疫荧光染色法检测细胞中GFAP蛋白呈阳性表达。见图 1。2.2转染转染 APOE3 和和 APOE4 过表达质粒后各组细过表达质粒后各组细胞中胞中 APOE和和 GFAP蛋白表达水平及细胞培养上清蛋白表达水平及细胞培养上清中中 APOE 水平水平 EGFP-N1-APOE3 和 EGFP-N1-APOE4 质粒转染至 APOE-/-星形胶质细胞中，结果显示：与 APOE-/-组比较，转染 APOE3组和转染 APOE4 组细胞中 APOE 和 GFAP 蛋白表达水平明显升高（P0.01），细胞培养上清中 APOE 水平明显升高（P0.05）。见图 2。2.3炎症因子刺激后各组星形胶质细胞形态表炎症因子刺激后各组星形胶质细胞形态表现现荧光显微镜观察显示：分别与 APOE3+PBS组 和 APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+C1q组和 APOE4+IL-1+TNF+C1q组星形胶 质 细 胞 突 起 变 短，胞 体 变 大；与 APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 比 较，APOE4+IL-1+TNF+C1q组星形胶质细胞突起更短。见图 3。2.4各组星形胶质细胞中突触生长因子各组星形胶质细胞中突触生长因子 mRNA 表表达水平达水平分别与 APOE3+PBS 组和 APOE4+PBS组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 和APOE4+IL-1+TNF+C1q 组 星 形 胶 质 细 胞 中Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2 和 Sparcl1 mRNA 表达水平明显降低（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+C1q 组比较，APOE4+IL-1+TNF+C1q组星形胶质细胞中 Gpc4、Gpc6、Thbs1、Thbs2和Sparcl1 mRNA 表达水平明显降低（P0.05或 P0.01）。见图 4。2.5 各 组 星 形 胶 质 细 胞 中各 组 星 形 胶 质 细 胞 中 GDNF、C3 和和 S100B mRNA 表 达 水 平表 达 水 平 分 别 与 APOE3+PBS 组 和APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+C1q 组和 APOE4+IL-1+TNF+C1q 组星形胶质细胞中 GDNF mRNA表达水平明显降低（P0.01），C3 和 S100B mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 比 较，A：Morphology of APOE-/-astrocytes under fluorescence microscope after purification；B：Positive expression of GFAP protein in cells（immunofluorescence staining）.图图 1星形胶质细胞的纯化和鉴定星形胶质细胞的纯化和鉴定（Bar=50 m）Fig.1 Purification and identification of astrocytes（Bar=50 m）37第 50 卷 第 1 期 2024 年 1 月吉林大学学报（医学版）APOE4+IL-1+TNF+C1q 组 星 形 胶 质 细 胞 中GDNF mRNA 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.05），C3 和 S100B mRNA 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05）。见图 5。2.6各组星形胶质细胞吞噬微珠数量各组星形胶质细胞吞噬微珠数量荧光微珠吞 噬 实 验 结 果 显 示：分 别 与 APOE3+PBS 组 和APOE4+PBS 组比较，APOE3+IL-1+TNF+C1q组和 APOE4+IL-1+TNF+C1q组星形胶质细胞吞噬微珠数量明显减少；与 APOE3+IL-1+TNF+C1q 组比较，APOE4+IL-1+TNF+C1q组星形胶质细胞吞噬微珠数量明显减少。见图 6。2.7各组星形胶质细胞中各组星形胶质细胞中 Bcl-2 和和 Caspase-3 蛋白蛋白表 达 水 平表 达 水 平 分 别 与 APOE3+PBS 组 和 APOE4+PBS 组 比 较，APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 和APOE4+IL-1+TNF+C1q 组 星 形 胶 质 细 胞 中Bcl-2 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.05 或 P0.01），Caspase-3 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.01）；与 APOE3+IL-1+TNF+C1q 组 比 较，APOE4+IL-1+TNF+C1q 组 星 形 胶 质 细 胞 中Bcl-2 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.01），Caspase-3 蛋 白 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05）。见图 7。3 讨 论 世 界 卫 生 组 织（World Health Organization，WHO）数据12显示：2019 年 AD 患 者 人 数 为5 500 万，预计至 2050 年将增至 1.39 亿。AD 患者的临床特征主要包括认知衰退、运动障碍和生活自理能力严重下降，给家庭和整个社会造成沉重的负担。因此，AD 的致病机制和药物研发一直是研究热点。研究13显示：神经胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）产生神经炎症并随着 AD 的退行性进展而加重。神 经 毒 性 反 应 性 星 形 胶 质 细 胞（A1 型）获得毒性功能，同时丧失神经营养功能。星形胶质细胞功能障碍导致细胞因子和炎症介质释放增加、神经变性、谷氨酸摄取减少和神经元突触丧失，并最终导致 AD 认知缺陷14。神经毒性反应性星形胶质细胞是反应性星形胶质细胞的一个亚A：Electrophoregram of expression of APOE and GFAP proteins；B，C：Histograms of expression of APOE and GFAP proteins；D：Level of APOE in cell culture supernatant.Lane 1：APOE-/-group；Lane 2：Transfected APOE3 group；Lane 3：Transfected APOE4 group.*P0.01 compared with APOE-/-group.图图 2Western blotting法和法和 ELISA法检测各组细胞中法检测各组细胞中 APOE和和 GFAP蛋白表达水平及细胞培养上清中蛋白表达水平及细胞培养上清中 APOE水平水平Fig.2 Expression levels of APOE and GFAP proteins and level of APOE in cell culture supernatant detected by Western blotting and ELISA methodsA：APOE3+PBS group