3-溴丙酮酸-胆固醇酯增强乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性研究.pdf

基础研究摘要目的：探讨 3-溴丙酮酸-胆固醇酯（3-bro-mopyruvate cholesterol ester，3-BP-Cl）增强乳腺癌对他莫昔芬（tamoxifen，TAM）敏感性作用及机制。方法：MTT 法检测药物对乳腺癌细胞活力的影响，并使用金氏公式检验3-溴丙酮酸-胆固醇酯与他莫昔芬是否具有协同抗乳腺癌作用。Calcein AM/PI 染色法检测药物对细胞的毒性作用，集落克隆形成法检测药物对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。流式细胞术检测药物诱导乳腺癌细胞的凋亡作用。Western blot检测药物对细胞己糖激酶 2、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响。结果：MTT 结果显示 3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有抑制乳腺癌作用，与他莫昔芬联用能显著抑制MCF-7 细胞生长活性（P1.15）。Calce-in AM/PI 染色结果显示两药联用组细胞死亡数量最多。集落克隆形成实验结果显示两药联用组MCF-7细胞的集落数量最少。Annexin V凋亡结果显示与单药组相比，联用组细胞凋亡数量显著升高（P99%，货号：10540-29-1）购于麦克林公司；DMEM培养液（货号：8122554）购于美国GIBCO公司；胎牛血清（货号：23010701）购于浙江天杭生物科技公司；胰酶细胞消化液（货号：BL501A）、SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒（货号：BL522A）购于白鲨生物科技公司；青霉素-链霉素-庆大霉素溶液（货号：C0223）、Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（货号：C2015M）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0010）购于上海碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI 双 染 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒（货 号：BB23051）购于贝博生物；Bcl-2单克隆抗体（货号：A0208）、HK2单克隆抗体（货号：A0094）、Bax单克隆抗体（货号：A12009）、-actin 单克隆抗体（货号：AC006）购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。Western blot电泳仪、垂直电泳槽和转移电泳槽购于美国伯乐 Bio-Rad 公司；酶标仪（伯腾仪器）、流式细胞仪（安捷伦生物公司）、化学发光成像仪（Vilber公司）、倒置荧光显微镜（徕卡公司）由蚌埠医学院科研中心提供。1.2细胞培养采用 DMEM 培养基培养 MCF-7细胞，具体培养方法同文献15。1.3MTT 法检测药物对 MCF-7 细胞活力的影响取人乳腺癌MCF-7细胞，待细胞生长趋势较好时用胰蛋白酶消化，用计数板计数后以5103细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，每孔 100 L。将 96 孔板在 37、5%CO2培养箱中培养 24 h。吸弃培养基，对照组使用新鲜培养基处理，实验组使用含药培养基处理。实验组设置如下：3-溴丙酮酸-胆固醇酯组、他莫昔芬组、他莫昔芬与3-溴丙酮酸-胆固醇酯（5 mol/L）联用组、他莫昔芬与3-溴丙酮酸-胆固醇酯（10 mol/L）联用组、他莫昔芬与3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20 mol/L）联用组，其中3-溴丙酮酸-胆固醇酯单药组浓度设置为0、5、10、20 mol/L，他莫昔芬单药组和两药联用组浓度均设置为0、5、10、20、30、40 mol/L，每个浓度设3个复孔。然后放置在细胞培养箱中培养24 h，先加入3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20 mol/L）作用6 h后，再加入他莫昔芬（30 mol/L），以加入他莫昔芬时间为实际药物作用时间，分别处理24、48、72 h。每孔加入 20 L MTT 溶液，培养箱中避光孵育4 h，弃上清，加入DMSO，37 孵育30min，多功能酶标仪测量 490 nm 波长下的吸光度（optical density，OD）值。以对照组细胞存活率为 100%计算各组细胞存活率，计算公式为（试验组 OD 值空白组 OD 值）/（对照组 OD值空白组 OD 值）100%。使用金氏公式16计算他莫昔芬与 3-溴丙酮酸-胆固醇酯的协同作用，q=E(A+B)/（EA+EBEAEB），E(A+B)为两种药物联合作用时对细胞的抑制率，EA、EB分别为 3-溴丙酮酸-胆固醇酯和他莫昔芬单独使用时对细胞的抑制率，以q1.15具有协同作用，0.85q1.15具相加作用，q0.85具有拮抗作用。1.4集落克隆形成实验考察药物对乳腺癌细胞的增殖抑制作用取对数生长期的MCF-7细胞，用胰蛋白酶消化，以 5103个细胞/孔的密度接种至 6 孔板中。贴壁过夜后分别给予他莫昔芬（10 mol/L）、3-溴丙酮酸-胆固醇酯（10 mol/L）、他莫昔芬（10 mol/L）和 3-溴丙酮酸-胆固醇酯（10 mol/L）处理，对照组用新鲜培养基。对照组和给药组分别2 d换一次培养基和含药培养基，1094中国临床药理学与治疗学 2023 Oct;28(10)培养 7 d 后观察各组集落形成情况。去除培养基，用PBS洗涤2遍，用4%多聚甲醛固定0.5 h，复用PBS清洗2遍，而后加入结晶紫染液染色0.5 h，弃去染色液，倒扣在滤纸上，干燥后拍照，统计并比较组间差异。1.5Calcein AM/PI染色法测定药物对MCF-7细胞毒性作用的影响取生长良好的MCF-7细胞，以5103细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜，分别给予3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20 mol/L）、他莫昔芬（30 mol/L）、3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20mol/L）和他莫昔芬（30 mol/L）处理，对照组给予新鲜培养基处理，给药24 h后按照试剂盒说明书，加入Calcein AM/PI染色液，室温避光孵育30min后，荧光显微镜下观察红绿荧光强度（红色代表死细胞，绿色代表活细胞），评价3-溴丙酮酸-胆固醇酯及联用他莫昔芬对 MCF-7 细胞的毒性作用。1.6流式细胞仪检测药物对乳腺癌细胞凋亡水平的影响取处于指数生长期的MCF-7细胞，用胰蛋白酶消化，以3106细胞/孔的密度接种于6孔培养板。贴壁完全后，给予不同药物处理。同时设立阴性对照组，用空白培养基处理。每组设置3个复孔。处理24 h后用胰酶消化收集细胞，离心，用预冷的 PBS 清洗细胞 2 次，用 Annexin V结合液重悬细胞，后转移至流式管中，加入5 L的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate iso-mer，Annex V-FITC）和5 L的碘化丙啶（propidiumiodide，PI），避光孵育15 min后上机检测。1.7Western blot 检测药物对乳腺癌细胞内HK2、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响将MCF-7细胞接种至细胞培养皿中培养，过夜贴壁完全后分别给予3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20 mol/L）、他莫昔芬（30 mol/L）、3-溴丙酮酸-胆固醇酯（20 mol/L）和他莫昔芬（30 mol/L）处理，新鲜培养基处理组为阴性对照组。药物处理 24 h 后，收集细胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min，后低温（4）高速（12 000 r/min）离心 30 min，收集上清。用BCA蛋白定量试剂盒测定各组上清液蛋白浓度，然后用上样缓冲液调节各组蛋白浓度一致，再于 100 煮 5 min，-20 保存备用。用SDS-PAGE 凝胶试剂盒制胶，将彩色预染蛋白Marker和煮好的蛋白上样缓冲液以每孔6 L加入蛋白泳道中，电泳 100 min 分离蛋白，转移至PVDF膜上，封闭液4 封闭2 h。后用一抗（HK2、BCl-2、Bax、-actin，1:1 000）于4 条件下摇床上孵育14 h，TBST洗涤3次（10 min/次），加入二抗，4 摇床孵育2 h，TBST清洗3次（10 min/次），曝光液显影。以-actin作为内参，目的蛋白（HK2、Bcl-2、Bax）与内参蛋白条带灰度值的比值为其相对表达量，比较各处理组蛋白表达水平差异。实验独立重复3次。1.8统计学分析采用SPSS 23.0对数据进行统计学分析，计量资料均采用均数标准差（x s）表示，两组数据比较用独立样本t检验，多组样本间比较采用单因素方差分析方法，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1药物对乳腺癌细胞的抑制作用2.1.1药物对MCF-7细胞活力的影响MTT结果（Fig.1A）显示，3-溴丙酮酸-胆固醇酯和他莫昔芬对MCF-7细胞的抑制作用呈现出明显的剂量依赖性，与他莫昔芬组相比，两药连用可显著抑制MCF-7 细 胞 的 活 力（P0.05）。2.1.2药物对乳腺癌细胞集落形成的影响集落克隆形成实验结果（Fig.2）显示，3-溴丙酮酸-胆固醇酯和他莫昔芬均可以抑制MCF-7细胞的集落形成，而3-溴丙酮酸-胆固醇酯与他莫昔芬联用时抑制MCF-7细胞集落形成能力更强，克隆细胞数量最少，说明3-溴丙酮酸-胆固醇酯与他莫昔芬联用可更好地抑制MCF-7细胞增殖。1095Chin J Clin Pharmacol Ther 2023 Oct;28(10)0 5 10 20 30 401.51.00.50.0Inhibi?on ra?o%Concentra?on of TAM(mol/L)TAMTAM+3-BP-C1(5 mol/L)TAM+3-BP-C1(10 mol/L)TAM+3-BP-C1(20 mol/L)bbbbccccccccccc1.51.00.50.0Inhibi?on ra?o%24 48 72TAM(30 mol/L)3-BP-C1(20 mol/L)TAM+3-BP-C1(simultaneous)TAM+3-BP-C1(separate)Time(h)q=1.44ccbbq=1.56q=1.09q=1.10q=0.99q=1.03ABFig.1The inhibition rate of drugs on MCF-7 cells(x s,n=3)A:The inhibition rate on MCF-7 cells of TAM(5,10,20,30,40 mol/L)and 3-BP-Cl(5,10,20 mol/L);B:The inhibitory rate of treat-ments TAM(30 mol/L),3-BP-Cl(20 mol/L)and combination for 24,48,and 72 h.bP0.05,cP0.01,compared with TAM group.Tab.1The q value of 3-BP-Cl combined with TAM was calculated by Kings formula3-BP-Cl(mol/L)51020q valueTAM(5 mol/L)1.792.191.77TAM(10 mol/L)1.611.401.90TAM(20 mol/L)1.481.871.75TAM(30 mol/L)1.441.531.49TAM(40 mol/L)1.211.291.39bacd0 0 10 10cf5004003002001000Clone numberTAM(mol/L)0 10 0 103-BP-C1(mol/L)ABFig.2Effects of different drugs on cell colony formationA:The colonies of MCF-7 cells with different treatment.a:Control,b:3-BP-Cl(10 mol/L),c:TAM(10 mol/L),d:TAM(10 mol/L)+3-BP-Cl(10 mol/L).B:The quantitative of cell colonies(x s,n=3).cP0.01,compared with TAM group;fP0.01,compared with 3-BP-Cl group.2.1.3药物对乳腺癌细胞的毒性作用为进一步考察3-溴丙酮酸-胆固醇酯增强乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性作用，采用Calcein AM/PI染色法观察药物对乳腺癌细胞的毒性作用。结果（Fig.3）显示与对照组相比，3-溴丙酮酸-胆固醇酯组、他莫昔芬组红色区域均有所增加，绿色区域有所减少，说明3-溴丙酮酸-胆固醇酯、他莫昔芬均可以杀死MCF-7细胞。而3-溴丙酮酸-胆固醇酯联用他莫昔芬组红色区域最多，绿色区域几乎消失不见，说明3-溴丙酮酸-胆固醇酯联用他莫昔芬组细胞死亡数量最多。可见3-溴丙酮酸-胆固醇酯能增强他莫昔芬对MCF-7细胞的毒性作用。1096中国临床药理学与治疗学 2023 Oct;28(10)ControlCalcein AMPIMerge3-BP-CI(20 mol/L)3-BP-Cl(20 mol/L)+TAM(30 mol/L)TAM(30 mol/L)Fig.3Calcein AM/PI staining of MCF-7 cells after treatment with drugsLiving cells are green and dead cells are red,scale label=200 m.2.2药物对乳腺癌细胞凋亡的影响细胞凋亡结果（Fig.4）显示，对照组、3-溴丙酮酸-胆固醇酯组、他莫昔芬组、3-溴丙酮酸-胆固醇酯联合他莫昔芬组的凋亡率分别为（8.23 0.36）%、（11.32 0.62）%、（17.84 1.65）%、（36.56 1.31）%。与他莫昔芬、3-溴丙酮酸-胆固醇酯单用组相比，联合用药组细胞凋亡率显著升高（P0.01），表明二者合用可促进乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。403020100Apoptosis rate(%)0 0 30 30TAM(mol/L)0 20 0 203-BP-CI(mol/L)cfBControl3-BP-CI(20 mol/L)3-BP-CI(20 mol/L)+TAM(30 mol/L)TAM(mol/L)APIAnnexin V-FITC100 102 104 106 108100 102 104 106 108100 102 104 106 108100 102 104 106 108105104103102101100105104103102101100105104103102101100105104103102101100Q10.16Q490.5Q28.64Q30.74Q10.12Q488.9Q29.66Q31.36Q10.99Q481.7Q212.2Q35.14Q11.94Q461.8Q223.1Q313.2Fig.4The apoptosis of MCF-7 cells after treated with drugsA:The apoptosis of cells detected by flow cytometry;B:The quantitative of A(x s,n=3).cP0.01,compared with TAM group;fP0.01,compared with 3-BP-Cl group.2.3药物对乳腺癌细胞内HK2、Bcl-2、Bax表达的影响为探讨3-溴丙酮酸-胆固醇酯增强乳腺癌对他莫昔芬敏感性机制，采用蛋白免疫印迹法检测了HK2、Bcl-2、Bax表达情况。结果（Fig.5）显示，3-BP-Cl能降低MCF-7细胞HK2的表达，表明3-BP-Cl进入乳腺癌内能发生解离，发挥3-溴丙酮酸抑1097Chin J Clin Pharmacol Ther 2023 Oct;28(10)制HK2的作用。这应是3-BP-Cl与他莫昔芬协同抑制MCF-7的根本原因。此外，由Fig.5可见，他莫昔芬可促进乳腺癌细胞凋亡调节蛋白 Bax 表达，3-BP-Cl与之联合应用不仅显著增强Bax表达，同时协同抑制Bcl-2的表达，共同诱导乳腺癌细胞发生凋亡。0 0 30 30TAM(mol/L)HK2Bcl-2Bax-Ac?nHK2BaxBcl-20 20 0 203-BP-CI (mol/L)0 0 30 301.51.00.50.0Protein expression(IATarget protein:IA-Ac?n)TAM(mol/L)0 20 0 203-BP-CI (mol/L)bbbccABFig.5Effect of drugs on proteins expression of HK2,Bcl-2 and Bax in MCF-7 cellsA:The expression of HK2,Bcl-2,Bax,3-BP-Cl(20 mol/L),TAM(30 mol/L),3-BP-Cl(20 mol/L)+TAM(30 mol/L);B:The quantita-tive of the expression level of HK2,Bcl-2,Bax(x s,n=3).bP0.05,cP0.01,compared with control group.3讨论他莫昔芬是治疗ER阳性乳腺癌的常用药物，已在临床使用四十多年，显著降低了乳腺癌患者的死亡率17。但由于耐药性的产生，约有40%的乳腺癌患者他莫昔芬治疗失败18。克服他莫昔芬耐药，提高乳腺癌患者的生存率对乳腺癌的治疗具有重要的意义。能量代谢异常是肿瘤细胞的特征之一，近年有研究表明HK2在耐药细胞株中高表达，HK2高表达标示着耐药细胞的糖酵解较活跃，可为细胞增殖、迁徙提供充足的能量，同时帮助肿瘤细胞克服不利微环境而存活下去19。因此通过抑制HK2的表达可提高乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。Zhang等研究证明3-溴丙酮酸可通过抑制HK2，逆转乳腺癌对他莫昔芬的耐药性，增强乳腺癌对他莫昔芬的敏感性20。3-溴丙酮酸作为一种小分子烷基化剂，已经被证明具有广谱的抗肿瘤作用。但3-溴丙酮酸分子量小，人体内易被迅速清除，且缺乏肿瘤组织靶向能力，易在正常组织中分布积累，造成严重的不良反应21，严重限制了3-溴丙酮酸的开发应用。3-溴丙酮酸-胆固醇酯是课题组前期设计合成的一种新化合物，该化合物在肿瘤组织弱酸环境中可响应性释放出3-溴丙酮酸，实现3-溴丙酮酸肿瘤组织靶向分布，降低对正常组织的毒性作用。本课题旨在初步探讨3-溴丙酮酸-胆固醇酯增强乳腺癌对他莫昔芬的敏感性作用，为后期的研究提供实验基础。研究结果显示3-溴丙酮酸-胆固醇酯与他莫昔芬联用能协同抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并协同诱导MCF-7细胞凋亡。表明3-溴丙酮酸-胆固醇酯可增强MCF-7细胞对他莫昔芬的敏感性。Western blot结果显示3-溴丙酮酸-胆固醇酯可显著抑制HK2的表达，与他莫昔芬联用可显著增强促凋亡蛋白Bax表达，降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。表明3-溴丙酮酸-胆固醇酯同样具有抑制乳腺癌细胞HK2的作用，这应是其增加MCF-7细胞对他莫昔芬敏感性的主要机制。总之，3-溴丙酮酸-胆固醇酯具有增加乳腺癌MCF-7细胞对他莫昔芬的敏感性作用，可协同他莫昔芬发挥抗乳腺癌作用。作用机制与3-溴丙酮酸-胆固醇酯抑制细胞内HK2表达，抑制细胞能量代谢，从而诱导凋亡调节因子的表达改变，促进细胞的凋亡相关。本研究仅为乳腺癌细胞的敏感株体外实验，为3-溴丙酮酸-胆固醇酯的抗乳腺癌及增强乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性作用的初步探讨，更确切的作用及机制需要在后期的研究中进一步深入探讨。参考文献1 Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global Cancer Statis-tics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and1098中国临床药理学与治疗学 2023 Oct;28(10)mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2Turner KM,Yeo SK,Holm TM,et al.Heterogeneitywithin molecular subtypes of breast cancerJ.Am JPhysiol Cell Physiol,2021,321(2):C343-C354.3 Francis PA,Fleming GF,Lng I,et al.Adjuvant endo-crine therapy in premenopausal breast cancer:12-year results from SOFTJ.J Clin Oncol,2023,41(7):1370-1375.4Sukocheva OA,Lukina E,Friedemann M,et al.Thecrucial role of epigenetic regulation in breast canceranti-estrogen resistance:Current findings and futureperspectivesJ.Semin Cancer Biol,2022,82:35-59.5 Mishra A,Srivastava A,Pateriya A,et al.Metabolic re-programing confers tamoxifen resistance in breastcancerJ.Chem Biol Interact,2021,347:109602.6Vaupel P,Multhoff G.Revisiting the Warburg effect:historical dogma versus current understandingJ.JPhysiol,2021,599(6):1745-1757.7 杨贺淳,史道华.调控肿瘤糖代谢重编程改善肿瘤耐药的小分子抑制剂研究进展J.中国临床药理学与治疗学,2021,26(7):836-840.8 Patra KC,Wang Q,Bhaskar PT,et al.Hexokinase 2 isrequired for tumor initiation and maintenance and itssystemic deletion is therapeutic in mouse models ofcancerJ.Cancer Cell,2013,24(2):213-228.9 Wang J,Tao M,Wang T,et al.Knockdown of hexoki-nase 2(HK2)inhibits breast cancer cell proliferationand reduces their resistance to fluorouracilJ.ChinJ Cell Mol Immunol,2021,37(8):722-727.10Liu X,Miao W,Huang M,et al.Elevated hexokinase IIexpression confers acquired resistance to 4-hydroxy-tamoxifen in breast cancer cellsJ.Mol Cell Pro-teomics,2019,18(11):2273-2284.11Roy S,Dukic T,Bhandary B,et 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tamoxifen(TAM).METH-ODS:MTT assay and Calcein AM/PI staining wereused to detect the effect of drugs on the viabilityof breast cancer cells.Kims formula was used todetect synergistic anti-breast cancer effect of cho-lesterol 3-bromopyruvate and tamoxifen.The inhib-itory effect of drugs on proliferation of breast can-cer cells was detected by colony-forming assay.Flow cytometry was used to detect the apoptosisof breast cancer cells.Western blot assay was usedto detect the expression of hexokinase 2,Bcl-2 andBax proteins.RESULTS:MTT results showed thatcombination 3-BP-Cl and TAM could significantly in-hibit the activity of MCF-7 cells(P1.15).Calcein AM/PIstaining showed that the number of dead cells wasthe highest in the combination group.Colony-form-ing assay showed that the combination group hadstronger inhibitory effect on the proliferation ofMCF-7 cells than that of single drug groups.Annex-inV flow cytometry results showed that,the cellapoptosis in the combination group was significant-ly increased(P0.01).Western blot results showedthat 3-BP-Cl inhibited the expressions of hexoktoki-nase 2 and Bcl-2,and enhanced the expression ofBax in MCF-7 cells.CONCLUSION:3-BP-Cl could in-crease the sensitivity of breast cancer cells totamoxifen,and synergically inhibit the proliferationof breast cancer cells.The mechanism is possiblyrelated to its effects of inhibiting the expression ofHK2/Bcl-2,and enhancing the expression of Bax.KEYWOEDS3-bromopyruvate cholesterol ester;tamoxifen;breast cancer;drug resistance1100