实验时注意.docx

骨髓间充质干细胞（BMSCs）的PERCOLL分离培养法
原代培养：
1. 取体重150~200 g的大鼠，1% 的戊巴比妥钠腹腔注射或乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼处死，75 % 的酒精浸泡消毒5 min。
2. 将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有75% 酒精的离心管或烧杯中，移入超净台。
3. 将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入10 ml DMEM完全培养基，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。
4. 将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿，加入12 ml DMEM完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用2 ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。
5. 另取干净离心管A，加入10 ml PERCOLL淋巴细胞分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破PERCOLL分离液面，用8 ml DMEM完全培养基冲洗培养皿，同样加入离心管A。
6. 2500~3000 r/min，30 min离心后，可见A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。
7. 将20 ml PBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r/min离心10 min。
8. 弃上清，重复步骤7。
9. 弃上清，加入20~30 ml（视计数情况而定，一般一只老鼠一个25 cm2培养瓶）完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。
传代、冻存 （25 cm2 培养瓶）：
1. 当细胞融合度到达90% 左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。
2. 加入0.25% 的胰酶2 ml，置于37℃培养箱中2~3 min，取出在显微镜下观察，当80~90% 的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。
3. 传代：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入10 ml培养基吹打混匀。分种于两个培养瓶中。
4. 冻存：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入1 ml冻存液吹打混匀，置于冻存管中（4℃ 30~40 min，-20℃ 1 h，80℃过夜，再移入液氮罐中）。
5. 复苏：
1) 将细胞从液氮中取出，37℃轻微摇晃，使细胞快速融化。
2) 75％ 酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，1000 r/min 5 min。
3) 弃上清，加入5 ml 完全培养基混匀细胞，接种于25 cm2 培养瓶中。
液体配置：
DMEM完全培养基：L-DMEM，10 % CS （L-DMEM+10% FBS 原代培养用）。
冻存液：10 % DMSO+20 % FBS+70 % L-DMEM

细胞换液步骤
1. 将废液缸放入超净台，开启紫外灯消毒20 min，然后开风吹5 min。
2. 清洁双手。
3. 按规范步骤进入细胞培养室（实验服，75%乙醇擦拭双手）
4. 打开细胞培养箱取出细胞，拧紧瓶盖。从冰箱取出培养基。一起放入超净台。
5. 将培养瓶内的培养基倒出，然后加入新培养基，拧紧瓶盖，放入培养箱（瓶盖要拧松）
6. 收拾超净台，培养基放回原处。