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临床输血与检验2023年10月第25卷第5期613论著ABO不同血型在不同保存期内CD38的表达陈婷婷 赵丽坤 卓海龙 骆群解放军总医院第五医学中心输血医学科，北京 100071DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.05.006作者简介：陈婷婷，主要从事临床输血等方面研究，（E-mail）。通信作者：骆群，主要从事免疫血液学，重症疑难患者输血，治疗性单采及全血置换术等方面研究，（E-mail）。【摘要】目的 探讨ABO不同血型、不同保存期内红细胞表面CD38的表达，以明确其对多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者应用了达雷妥尤单抗后的血液选择问题。方法 选取2022年5月25日2022年6月30日全军采供血中心采集的供者血液标本，A型、B型、O型、AB型四个血型自血液采集之日起分为5个保存周期，四个血型不同保存期内的正常标本各15个，共300个标本。每一个保存周期、不同血型随机5人份混匀后为一组，分为三组标本。将含量为100 mg/5 mL的CD38单抗注射液原液用生理盐水稀释，确定了CD38单抗浓度梯度。采用标准输血技术检测，将红细胞和不同含量的CD38抗体按比例（红细胞50 L、CD38抗体25 L）加入抗人球蛋白卡中，孵育15 min，离心10 min后观察结果。结果 A型、B型、O型、AB型四个血型，红细胞与CD38单抗凝集强度一致，差异无统计学意义（P0.05）。CD38单抗浓度为256 ng时与不同保存周期的红细胞均为2+凝集，差异无统计学意义（P=0.062）。CD38单抗浓度为128 ng及64 ng时五个保存周期的红细胞凝集有减弱，差异有统计学意义（P0.05）。结论 ABO不同血型的CD38表达基本一致，无明显差异，不同保存期的红细胞对多发性骨髓瘤（MM）患者不会引起溶血的增加。【关键词】CD38单抗 ABO不同血型 多发性骨髓瘤 红细胞保存期 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1671-2587（2023）05-0613-06Expression of CD38 in Different Blood Groups during Different Preservation Periods CHEN Tingting,ZHAO Likun,ZHUO Hailong,et al.Department of Transfusion,Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital,No.8 Dongda Street,Fengtai District,Beijing 100071【Abstract】Objective To investigate the expression of CD38 on erythrocyte surface of ABO with different blood groups and different preservation periods,in order to clarify the blood selection problem of daretuzumab in m ultiple myeloma(MM)patients.Methods Donor blood samples collected from the Blood Collection and Supply Centers of the Whole Army from May 25,2022 to June 30,2022 were selected.The four blood groups of type A,B,O and AB were divided into 5 preservation cycles from the date of blood collection.There were 15 normal specimens in different preservation periods of the four blood groups,totaling 300 specimens.For each preservation cycle,5 people with different blood types were randomly mixed into a group and divided into three groups of specimens.The concentration gradient of CD38 monoclonal antibody was determined by diluting 100 mg/5 mL of CD38 monoclonal antibody with normal saline.Standard pre-transfusion tests were used for detection.Red blood cells and different levels of CD38 antibodies were added to anti-human globulin card in proportion(50 L for red blood cells and 25 L for CD38 antibodies),incubated for 15 min,and centrifuged for 10 min to observe the results.Results The monoanticoagulant strength of red blood cells was consistent with that of CD38 for blood groups A,B,O and AB,and there was no statistical significance(P0.05).The concentration of CD38 monoclonal antibody of the four blood groups ranged from 200 g to 256 g,and the red blood cells of different preservation periods all showed 2+agglutination,with no statistical significance(P=0.062).When the concentration of CD38 mab was 128 ng and 64 ng,erythrocyte agglutination was weakened in five preservation cycles,and the difference was statistically significant(P0.05).Conclusion The expression of CD38 in different ABO blood groups is basically the same without significant difference.Red blood cells with different storage periods will not increase hemolysis in patients with m ultiple myeloma.【Key words】CD38 monoclonal antibody ABO different blood types Multiple myeloma Erythrocyte retention period近年来，单克隆抗体（MAB）治疗已成为恶性血液病研究领域的一个重要领域。其中应用于多发性骨髓瘤（muLtiple myeloma，MM）的达雷妥尤单抗注射液（兆珂）（CD38单抗）是一种人源化的IgG1-型单抗，与人骨髓瘤细胞表面CD38分子结合，介导等一系列免疫机制1-3。CD38在各种造血和 J Clin Transfus Lab Med,October.2023,Vol 25,No.5614非造血干细胞表面低表达，在浆细胞表面高表达，尤其在几乎所有骨髓瘤细胞上高表达。因此CD38已成为多发性骨髓瘤（MM）患者的重要治疗靶点4-6。抗CD38单抗可以与红细胞表面的抗原相互结合，使这些抗体可以干扰直接抗球蛋白试验（DAT）和间接抗球蛋白试验（IAT）、不规则抗体筛选、交叉配血相容性试验等7。MM患者在使用抗CD38单抗治疗期间输注异体血，异体血红细胞表面的CD38抗原会与抗CD38单抗结合8。是否会发生溶血性输血反应？跟血型和供者红细胞保存时长是否有关？还未见报道。多年前只报道过一例MM患者输注异体血发生迟发性溶血反应，认定为“自身免疫性溶血反应”9。国内输血实验室证实与专家意见是经过含有CD38单抗血样与人源抗-E的对比试验，所有CD38单抗及抗-E在抗人球凝胶卡中均呈1+2+的凝集10。1+2+的凝集是否和CD38单抗的浓度有关系？是否受血型的影响？均未见报道。因此，本文就ABO不同血型和不同保存期内红细胞表面CD38的表达做一分析，探究分析其CD38表达是否存在差异。明确不同血型、不同保存期两种因素是否会影响MM患者的血液输注。资料与方法1 材料 选取2022年5月25日2022年6月30日全军采供血中心采集的供者血液标本，献血者均为1855周岁健康人群，均符合献血指标，获医院伦理委员会审批且已签署献血者知情同意书。自血液采集之日起第一周、第二周、第三周、第四周、第五周。四个血型不同保存期内的正常标本各15个，共300个标本。2 仪器与试剂 DG Gel Coombs 抗人球蛋白检测卡（微住凝胶法）（Diagnostic Grifols，S.A）（批号22024.01.1 有效期2023-01）、KA-2200 型离心机（日本久保田）、DG-THERM微柱孵育器（Diagnostic Grifols，S.A）、DG-SPIN卡式离心机（Diagnostic Grifols，S.A）、加样枪（校准日期：2022.04）、兆珂达雷妥尤单抗注射液（规格：100 mg/5 mL/瓶、进口药品注册证号S20190029）、DG Gel Sol低离子液（Diagnostic Grifols，S.A）（批号22002 有效期2023-06）、氯化钠注射液（石家庄四药）（规格：1000 mL：9 g 批号：2202231704 有效期：2024.02.22）。3 方法3.1 收集不同血型不同保存周期的红细胞 收集2022年5月25日2022年6月30日全军采供血中心采集的供者血液标本，将A型、B型、O型、AB型四个血型的红细胞分别按照第一保存周期、第二保存周期、第三保存周期、第四保存周期、第五保存周期来分类，每个保存周期四个血型分别15个标本，共300个标本。每一个保存周期的每一个血型15个标本中每5个标本混匀为一组，随机分为三组标本。3.2 处理红细胞 每个标本分别用移液器吸取100 L压积红细胞混匀为一组。用低离子液配置成1%的红细胞悬液（用移液器吸取10 L混合好的压积红细胞与990 L的低离子液混匀配置成1%的红细胞浓度）。3.3 确定CD38单抗的浓度梯度 有文献报道患者抗CD38单抗浓度大于0.25 g/L时能被检测到11。所以我们经过多次试验将含量规格100 mg/5 mL的达雷妥尤单抗注射液原液用生理盐水稀释为以下几个浓度梯度：200 g/mL、2 048 ng/mL、1 024 ng/mL、512 ng/mL、256 ng/mL、128 ng/mL、64 ng/mL、32 ng/mL、16 ng/mL。3.4 按照配血规程操作 分别将确定好的CD38单抗的梯度标记在抗人球蛋白卡上12。将配置好的1%的红细胞悬液取50 L加入抗人球蛋白卡中，每个梯度的CD38单抗各取25 L加入对应的红细胞中。孵育15 min，离心10 min，观察结果。4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。以评分的形式进行统计分析，将凝集结果2+设定为2分，1+设定为1分，设定为0.5分，阴性设定为0分。表5为不同血型在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计，A、B、O、AB四个血型每个血型共计15组标本。表6为不同保存周期在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计，五个保存周期，每个周期3组标本，共计15组标本。用秩和检验采用Kruskal-Wallis法。P0.05表示差异有统计学意义。结 果1 A型、B型、O型、AB型的四个血型在CD38单抗不同浓度时凝集数据统计，见表1表4。2 不同血型在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计。见表5。CD38单抗浓度为512 ng/mL200 g/mL时凝集均为2+，结果一致不做统计分析。CD38单抗浓度为256 ng/mL时凝集强度为1+2+，A型总分为29临床输血与检验2023年10月第25卷第5期615表1 A型红细胞不同保存期内红细胞CD38表达 保存周期标本组别CD38 单抗浓度梯度（/mL）200 g2 048 ng1 024 ng512 ng256 ng128 ng64 ng32 ng16 ng第1周期12+2+2+2+2+2+2+1+1+22+2+2+2+2+2+2+1+1+32+2+2+2+2+2+1+00第2周期12+2+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+2+1+00第3周期12+2+2+2+2+1+00022+2+2+2+2+1+00032+2+2+2+2+1+000第4周期12+2+2+2+2+1+00022+2+2+2+2+1+00032+2+2+2+2+1+000第5周期12+2+2+2+2+1+00022+2+2+2+2+00032+2+2+2+1+000注：2+为2+凝集，1+为1+凝集，为弱凝集，0为阴性。表2 B型红细胞不同保存期内红细胞CD38表达保存周期标本组别CD38 单抗浓度梯度（/mL）200 g2 048 ng1 024 ng512 ng256 ng128 ng64 ng32 ng第1周期12+2+2+2+2+2+1+22+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+1+第2周期12+2+2+2+2+2+1+022+2+2+2+2+2+1+032+2+2+2+2+2+1+第3周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+1+00第4周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+1+00第5周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+1+0032+2+2+2+1+00注：2+为2+凝集，1+为1+凝集，为弱凝集，0为阴性。表3 O型红细胞不同保存期内红细胞CD38表达保存周期标本组别CD38 单抗浓度梯度（/mL）200 g2 048 ng1 024 ng512 ng256 ng128 ng64 ng32 ng第1周期12+2+2+2+2+2+22+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+第2周期12+2+2+2+2+2+1+22+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+1+第3周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+1+00 J Clin Transfus Lab Med,October.2023,Vol 25,No.5616表4 AB型红细胞不同保存期内红细胞CD38表达保存周期标本组别CD38 单抗浓度梯度（/mL）200 g2 048 ng1 024 ng512 ng256 ng128 ng64 ng32 ng第1周期12+2+2+2+2+2+1+22+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+1+第2周期12+2+2+2+2+2+1+22+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+1+第3周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+1+00第4周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+1+0032+2+2+2+2+1+00第5周期12+2+2+2+2+00022+2+2+2+2+00032+2+2+2+2+000注：2+为2+凝集，1+为1+凝集，为弱凝集，0为阴性。表5 不同血型在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计（s）血型CD38单抗浓度梯度（ng/mL）256 12864A型（n=15）29208B型（n=15）28206O型（n=15）30217AB型（n=15）29 17.56统计量H=2.107H=0.964H=0.276P值P=0.55P=0.81P=0.96续表3 保存周期标本组别CD38 单抗浓度梯度（/mL）200 g2 048 ng1 024 ng512 ng256 ng128 ng64 ng32 ng第4周期12+2+2+2+2+1+0022+2+2+2+2+2+1+32+2+2+2+2+2+1+0第5周期12+2+2+2+2+00022+2+2+2+2+00032+2+2+2+2+000注：2+为2+凝集，1+为1+凝集，为弱凝集，0为阴性。分，B型总分为28分，O型总分为30分，AB型总分为29分，四个血型凝集差异无统计学意义（Kruskal-Wallis H=2.107，P=0.55）。CD38单抗含量为128 ng/mL时A型总分为20分，B型总分为20分，O型总分为21分，AB型总分为17.5分，四个血型凝集差异无统计学意义，（Kruskal-Wallis H=0.964，P=0.81）。CD38单抗含量为64 ng/mL时A型总分为8分，B型总分为6分，O型总分为7分，AB型总分为6分，四个血型凝集差异无统计学意义，（Kruskal-Wallis H=0.276，P=0.96）。A型、B型、O型、AB型四个血型的红细胞与不同浓度梯度的CD38单抗凝集强度凝集基本一致，凝集趋于稳定的态势，说明A型、B型、O型、AB型四个血型的CD38表达基本一致，无差异。3 不同保存期在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计见表6。当CD38单抗浓度为512 ng/mL200 g/mL时凝集均为2+，结果一致不做统计分析。当CD38单抗浓度为256 ng/mL时，第一保存周期总分为24分、第二保存周期总分为24分、第三保存周期总分为23分、第临床输血与检验2023年10月第25卷第5期617表6 不同保存周期在CD38单抗不同浓度时凝集数据积分统计（s）不同保存期CD38 单抗浓度梯度（ng/mL）25612864第一周期（n=15）242413第二周期（n=15）242412第三周期（n=15）23 11.5 0第四周期（n=15）2414 2第五周期（n=15）21 4 0统计量H=8.955H=51.128H=50.147P值P=0.62P0.05P0.05四保存周期总分为24分，第五保存周期总分为21分，五个保存周期的红细胞与CD38单抗凝集差异无统计学意义，（Kruskal-Wallis H=8.955，P=0.62）。当CD38单抗浓度为128 ng/mL时，第一保存周期总分为24分、第二保存周期总分为24分、第三保存周期总分为11.5分、第四保存周期总分为14分，第五保存周期总分为4分，五个保存周期的红细胞与CD38单抗凝集差异有统计学意义，（Kruskal-Wallis H=51.128，P0.05）。当CD38单抗浓度为64 ng/mL时，第一保存周期总分为13分、第二保存周期总分为12分、第三保存周期总分为0分、第四保存周期总分2分、第五保存周期总分为0分，五个保存周期的红细胞与CD38单抗凝集差异有统计学意义，（Kruskal-Wallis H=50.147，P0.05）。讨 论抗体是免疫系统用来保护人体免受细菌和病毒等外来入侵者袭击的蛋白质序列和结构，它们可以分为五个主要的亚型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。CD38单抗是一种能与CD38结合的IgGlk人源化单克隆抗体13。它可以有效地与细胞表面的CD38分子结合，通过多种机制清除肿瘤细胞，用于治疗MM等多种血液系统疾病6，14。CD38是一种包括多发性骨髓瘤在内的造血细胞和其他细胞类型组织表达的跨膜糖蛋白（48 kDa），包括多发性骨髓瘤细胞和其他细胞及组织。CD38具有多种功能，例如受体介导的粘附、细胞信号传导以及环化酶、水解酶的活性调节3，15。本文研究了不同血型不同保存期内红细胞表面CD38的表达情况。从CD38单抗与不同血型的红细胞的凝集强度来看，结果显示A型、B型、O型、AB型四个血型的红细胞表面的CD38表达基本一致，无差异。随着红细胞保存期的延长与CD38单抗结合没有进行性增强，说明输注不同保存期的红细胞对患者发生溶血性输血反应并没有影响。由于抗CD38单抗药物在治疗MM患者的同时会结合到患者红细胞表面，而红细胞表面有不同程度表达的CD38抗原分子3，7。据DE VOOGHT等报道，CD38抗原与CD38单抗的结合不影响患者ABO和RhD血型鉴定6，14。但是关于不同血型的溶血程度没有相关报道。虽然患者血浆中的CD38单抗会导致间接抗球蛋白试验（IAT）与所有试剂红细胞和供者红细胞凝集，但与患者自身红细胞的反应性并不一致，反应通常会出现阴性，直接抗球蛋白试验（DAT）也是如此。这表明，CD38高水平的患者红细胞可能从机体中清除或受到抗CD38单抗介导的抗原下降，表明输注导致了抗CD38单抗，体内红细胞上CD38结合位点的完全饱和，这也解释了为什么迄今为止，在使用CD38单抗治疗的患者中尚未报道相关免疫介导严重的溶血临床表现16。也有报道表明输入CD38单抗后会引起轻微的溶血导致血红蛋白量的轻度降低，下降约Hb 10 g/L左右17-18。在临床使用CD38单抗后，采用任何基于抗球蛋白试剂的检测方法，均能观察到红细胞意外抗体引起凝集反应。最常见的为CD38单抗对间接抗球蛋白试验（IAT）的干扰，干扰的主要机制为：CD38单抗与红细胞表面上的CD38分子结合，且该反应在CD38单抗停用后可持续6个月10。由于在浆细胞疾病治疗的过程中越来越多地使用单克隆抗体，面临输血的风险也会随之增加。本文我们不仅证实了不同血型红细胞表面表达的CD38抗原无差别，ABO血型与CD38表达没有统计学相关性。还研究了红细胞不同保存期内和CD38单抗结合的情况，证实了年轻红细胞与近保存期末的红细胞在与CD38单抗药物结合时，凝集强度没有随着红细胞的保存期而增加，当CD38单抗浓度为64 ng/mL和128 ng/mL时，各保存期红细胞有统计学意义，证实MM患者输注异体血不受红细胞的保存时长所影响，不会 J Clin Transfus Lab Med,October.2023,Vol 25,No.5618增加溶血反应。但保存期超过3周的红细胞用于检测抗CD38抗体，显示效价明显降低，提示保存期间红细胞表面CD38抗原的减弱。结合临床，MM患者在使用CD38单抗后，可以引起轻微的溶血导致血红蛋白量的轻度降低，但并不会引起严重的自体溶血或异体输血后的溶血反应10，17。综上所述，不同血型红细胞表面表达的CD38抗原无差别，具体数量还待研究。下一步我们将相对定量测定红细胞上CD38抗原减弱程度，进一步明确MM患者不宜输注新鲜采集的红细胞制品，对CD38单抗治疗的MM患者输血中的血液选择提供一定参考意义，更好的提供安全有效的血液。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参 考 文 献 1 V E L L I Q U E T T E R W,A E S C H L I M A N N J,KIRKEGAARD J,et al.Monoclonal anti-CD47 interference in red cell and platelet testingJ.Transfusion,2019,59(2):730-737.2 DU C H,SUI W J,HUANG H T,et al.Effect of clinical application of anti-CD38 and anti-CD47 monoclonal antibodies on blood group detection and transfusion therapy and treatmentJ.Leuk Res,2022,122:106953.3 LIN P,OWENS R,TRICOT G,et al.Flow cytometric immunophenotypic analysis of 306 cases of m uLtiple myelomaJ.Am J Clin Pathol,2004,121(4):482-488.4 WANG S F,XU L,FENG J N,et al.Prevalence and incidence of m uLtiple myeloma in urban area in China:a national pop uLation-based analysisJ.Front Oncol,2020,9:1513.5 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