ADAP2在胶质瘤患者中的预后价值及功能研究.pdf

508J Clin Neurosurg,October 2023,Vol.20,No.5D0I:10.3969/j.issn.1672-7770.2023.05.006论著ADAP2在胶质瘤患者中的预后价值及功能研究张超，王钰，邵尉,周冬瑞，侯仕强，余东，王帅，林宁【摘要】目的分析ADAP2在脑胶质瘤中的预后价值和对胶质瘤迁移和侵袭的影响,并探索其可能机制。方法应用生物信息学分析ADAP2在胶质瘤中的差异性表达及其预后价值，并探索ADAP2对胶质瘤患者的潜在致癌机制。使用胶质瘤 U87 细胞系评估 ADAP2 敲除后对细胞迁移和侵袭的影响。结果ADAP2在恶性程度更高的胶质瘤亚型中富集，与免疫和炎症过程正相关，是胶质瘤患者的独立预后因素。敲低ADAP2后胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力下降。结论ADAP2与胶质瘤的临床病理特征密切相关,通过与免疫细胞相互作用促进胶质瘤的进展,高表达 ADAP2能促进胶质瘤细胞迁移和侵袭,是胶质瘤免疫治疗和精准诊断的潜在靶点。【关键词】ADAP2；胶质瘤；免疫；预后【中图分类号】R739.41Prognostic value and function of ADAP2 in patients with glioma ZHANG Chao,WANG Yu,SHAO Wei,et al.Department of Neurosurgery,The Afiliated Chuzhou Hospital of Anhui MedicalUniversity,The First Peoples Hospital of Chuzhou,Chuzhou 239000,ChinaCorresponding author:LIN NingAbstract:Objective To analyze the prognostic value of ADAP2 in gliomas and its effect onglioma migration and invasion,and to explore its possible mechanisms.Methods Bioinformatics wasapplied to analyze the differential expression of ADAP2 in gliomas and its prognostic value,and toexplore the potential oncogenic mechanisms of ADAP2 in glioma patients.The effects of ADAP2knockdown on cell migration and invasion were assessed using the glioma U87 cell line.ResultsADAP2 was enriched in more malignant glioma subtypes,positively correlates with immune andinflammatory processes,and was an independent prognostic factor for glioma patients.Migration andinvasion of glioma cells were decreased after knockdown of ADAP2.Conclusions ADAP2 is closelyrelated to the clinicopathological features of glioma and promotes the progression and evolution of gliomaby interacting with immune cells.High expression of ADAP2 promotes the migration and invasive abilityof glioma cells,and is a potential target for glioma immunotherapy and precision diagnosis.Key words:ADAP2;glioma;immune;prognosis胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，也是人类最致命的癌症之一，具有高侵袭性和高复发率的特点。目前治疗胶质瘤的主要方式是尽可能手术切除并联合放化疗，但高级别胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）的中位生存时间仅1214 个月,其早期诊断和治疗效果仍不理想2 。因此，迫切需要了解胶质瘤恶性进展的分子机制。基金项目：安徽医科大学学科建设项目（外科学与药理学共建项目）；安徽省高校自然科学研究重大项目（KJ2021ZD0036）；安徽省高校自然科学研究重点项目（2 0 2 2 AH050769）；安徽医科大学青年自然科学基金项目（2 0 2 0 xkj080）作者单位：2 39 0 0 0 滁州，安徽医科大学附属滁州医院，滁州市第一人民医院神经外科通信作者：林宁【文献标志码】A【文章编号】16 7 2-7 7 7 0(2 0 2 3)0 5-0 50 8-0 7免疫治疗作为一种新兴的治疗策略,可以激活免疫系统攻击癌细胞，也可以通过调节T细胞活性使免疫系统产生自我耐受3。许多免疫检查点介导了胶质瘤的抑制性免疫反应，导致肿瘤免疫逃避4-1。但也有许多免疫治疗成功的案例,如 CART细胞疗法6),抗程序性细胞死亡1（programmeddeath protein1,PD-1）和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)在临床上也取得了显著疗效7-8 。此外,独特的免疫微环境和T细胞耗竭显著抑制胶质瘤的免疫治疗。ADAP2 是一个干扰素刺激基因,其编码的蛋白质具有与-微管蛋白结合的能力,增加微临床神经外科杂志2 0 2 3年第2 0 卷第5期管稳定性10 。此外,它还可以与其他抗病毒因子一起构成病毒感染第一道防线，与防御病毒入侵相关1-12 。总之,免疫治疗是一种有前途的治疗方法,但在胶质瘤治疗方面尚未得到证实。了解ADAP2在胶质瘤中的作用,可以为研究更有效的免疫治疗措施提供基础。本研究通过生物信息学分析,探索ADAP2介导胶质瘤恶性进展的可能机制,并在体外实验进一步验证对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。1资料与方法1.1数据获取和下载本研究数据来源于公共数据库。其中,随机将中国脑胶质瘤基因组图谱计划（Ch i n e s e G l i o m a G e n o m e A t l a s,CG G A）（h t t p:/cancergenome.nih.gov/)693例胶质瘤患者作为训练集,癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA)(http:/ 0 2 例胶质瘤患者作为验证集,排除生存数据和临床病理因素缺失的患者。癌症细胞系百科全书（Cancer Cell LineEncyclopedia,CCLE）数据库（https:/depmap.org/)获取ADAP2在不同细胞系中的表达水平。1.2功能富集分析采用Pearson相关性分析ADAP2 最相关的基因,根据相关系数(R0.5,P0.001)筛选目标基因上传至注释、可视化和综合发现数据库（the Database for Annotation，Vi s u a l i z a t i o nand Integrated Discovery,DAVID）（h t t p s:/d a v i d.ncifcrf.gov/），获得基因本体论（GeneOntology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析结果。1.3基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）从AmiGO2数据库（http:/amigo.geneontology.org/amigo/）下载免疫反应相关基因集，通过 Pearson 相关性分析 ADAP2与免疫之间的关系。1.4细胞培养来自武汉普诺赛生命科技有限公司提供胶质瘤细胞系U87在含10%胎牛血清（fetalbovine serum,FBS)和0.5%双抗（青霉素和链霉素）的高糖型改良Eagle培养基(Dulbeccos modified Eaglesmedium,DMEM)中培养。所有细胞均置于37 下在含5%CO,的加湿培养箱中,2 3d更换培养基。1.5细胞转染靶向ADAP2（Si-A D A P2）和SiRNA阴性对照（Si-NC)的SiRNA寡核苷酸序列购自北京擎科生物科技股份有限公司，Si-ADAP2序列为S：5-CAAUGGAUUCGAGCUAAGUAU-3,AS:5-AUA-CUUAGCUCGAAUCCAUUG-3,选定终浓度后的 Si-ADAP2和Si-NC转染到U87细胞系中,转染后50924h,收集细胞进行WesternBlot实验。1.6WesternBlot将RIPA缓冲液加人样品中提取蛋白。蛋白上样进入浓缩胶,电泳分离,转移至PVDF膜,将膜在含1.5%牛奶的TBST中室温封闭2 h 后在4下与一抗孵育过夜,Tris 盐缓冲液(Trisbuffer solution Tween,TBST)清洗膜后室温孵育二抗2h后，再次TBST清洗膜后加入显影剂显影。1.7Transwell实验通过Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力。对于迁移测定,将转染的细胞接种到上室中,在无血清DMEM中培养,同时将含有10%FBS的DMEM加人下室。对于侵袭测定，上室预涂基质胶。培养箱中培养48 h后,用2 0%甲醛和0.5%结晶紫染色。1.8统计学分析ImageJ软件用于灰度值统计，采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析，Kaplan-Meier生存曲线分析纳人研究患者之间的生存差异并进行Log-rank 检验。所有统计分析均使用R软件（版本4.0.3)进行。双侧P0.5,P0.001）。将上述基因集进行 GO 和KEGG分析。在CGGA数据库中,与ADAP2最相关的生物学过程包括炎症和免疫51050000(sAep)4000300020001000MGM0HistologyADAP26000(sAep)4.0002.000MGMpHistofogyADAP280P0.00016040200WHOWHOIIWHOIVWHO GradeTCGA12P0.00011086WHOIIWHOGradeA,B:ADAP2相关临床病理学特征和生存差异概况；C,G:不同WHO分级胶质瘤ADAP2表达水平；D,H:1p/19q不同状态ADAP2表达水平；E,I:MGMT启动子甲基化状态ADAP2表达水平；F,J:IDH突变状态ADAP2表达水平图 1ADAP2 与胶质瘤患者临床和分子病理特征的关系反应（图2 A）;A D A P2 的细胞定位在细胞质膜、外泌体等（图2 B）；分子功能与蛋白结合和信号受体活动、跨膜信号受体活性等相关（图2 C）；最相关信号通路是溶酶体,B细胞受体信号通路和吞噬体等(图2G)。T CG A 数据库中结论相似（图2 D,E,F,H)。结果表明,ADAP2可能在胶质瘤免疫过程和炎症反应中发挥重要作用,有望成为临床治疗胶质瘤的潜在免疫靶点。2.3ADAP2与胶质瘤相关的免疫反应分析在免疫原性癌细胞死亡过程中,淋巴细胞（包括NK、T 和B细胞)的激活及趋化因子和细胞因子的释放导致癌细胞凋亡或坏死13；进一步分析胶质瘤患者ADAP2激活对免疫反应的影响。CGGA和TCGA数据库中GSVA用于估计免疫反应的富集分数,CGGA数据库中富集评分与ADAP2的相关性用热图显示，ADAP2表达与大多数免疫功能呈正相关（图3A）。上述结果在TCGA数据库中得到验证（图3B），并J Clin Neurosurg,October 2023,Vol.20,No.5CGGADatabaseMesenchymal-5NeuralProneural10GradeMGMTMethylatedUnmethylatedTCGA DatabaseAlp19qCodelNoncodelIDHMutantWildtypeAge7020CGGACGGA80P0.0001604020Cldel1p/19q StatusTCGA120.00011086WHOIIWHOIVEep,1050CGGACGGA80P=0.50600Non-codelMethyMGMT StatusTCGA12P0.000186CldelNon-codelIp/19qStatusH且,本研究通过单细胞测序分析发现ADAP2在M2型巨噬细胞中高表达，提示ADAP2可能与通过免疫调节介导胶质瘤肿瘤细胞免疫逃逸。2.4ADAP2与免疫检查点和炎症活动正相关根据上述分析,本研究发现ADAP2不仅与胶质瘤患者免疫反应相关,接下来分析ADAP2与胶质瘤患者免疫检查点和肿瘤免疫微环境（tumor immunemicroenvironment,TIME）中的炎症活动的关系。选择包括 HAVCR2、PD C D 1LG 2、C D 2 0 0 R1、C D 2 7 4、TNFRSF14、PD CD 2、T IG IT 和 SIGLEC15在内的常见免疫检查点。CGGA和TCGA数据库中，ADAP2与这些抑制性免疫检查点之间显示出强烈的正相关性（图4A）,这可能是导致胶质瘤的免疫疗效不佳的原因。此外,进一步了解ADAP2相关的炎症活动,选择包含10 4个基因的7 个基因集,将基因集定义为元基因，分别代表不同类型的炎症反应14。相关性矩阵图显示ADAP2和7 个元基因GenderFemaleMaleSubtypeClassicalIVHistologyAAAAOAOAGBMOACensoralivedead80P0.00016040200Non-methyMutIDHStatusTCGA12K0.000186MethyNon-methyMGMTStatusWTMutWTIDH Status临床神经外科杂志2 0 2 3年第2 0 卷第5期簇在CGGA和TCGA数据库中的相关性，除了免疫球蛋白G（im m u n o g lo b u lin G，I g G）元基因与ADAP2呈负相关外，ADAP2与大多数炎症反应呈现出显著正相关性（图4B,C）,这可能是TIME中多种趋化因子募集的免疫细胞分泌所引起。有报道称，炎症小体释放细胞因子可以激活抑制性免疫反应15,Tregs 可以通过颗粒酶依赖性细胞死亡途径来抑制B细胞增殖，髓源性抑制细胞可通过分泌白细胞介素7（interleukin7,IL-7）损害B细胞产生抗体的能力16 ,这可能是ADAP2和IgG之间负相关性的潜在机制。本研究的结果显示，ADAP2和抑制性免疫检查点由于肿瘤细胞和免疫细胞相互作用而上调，从而介导胶质瘤的抑制性免疫反应。2.5ADAP2是胶质瘤患者总生存期的独立预后因素为了探索ADAP2在胶质瘤患者中的预后价值，本研究基于CGGA和 TCGA数据库进行了Kaplan-CGGA(BP)Inflammatory responseImmuneresponseInnate immuneresponsePositive regulation oftumornecrosisfactorproductionPositive regulationofinterleukin-6productionSignal transductionInflammatory responseImmune responseInnate immune responseSignal transductionnecrosisfactorproductionPositive regulationof tumorDefense response tovirus511Meier和Cox回归分析。在CGGA数据库中，与ADAP2表达较低的患者(中位生存期:1112 d)相比，ADAP2高表达患者（中位生存期:6 7 9 d）总生存期显著缩短（图5A）。此外，ADAP2的预后价值在TCGA数据库中得到验证（图5B）。在已知的条件中,Cox回归分析显示ADAP2是胶质瘤患者独立预后因素。2.6敲低ADAP2后对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响本研究进一步进行了体外实验验证ADAP2在胶质瘤中的作用,采用胶质瘤细胞系U87进行实验,将ADAP2敲低后继续培养48 h。从CCLE数据库获取ADAP2在正常人星形胶质细胞系和胶质瘤细胞系中的表达水平（图6 B），W e s t e r n Blo t 验证ADAP2敲除效率（图6 A），敲低ADAP2后胶质瘤细胞迁移能力显著下降（图6 C,D),穿过小室的细胞数量也被明显抑制（图6 E,F）。T r a n s w e ll实验显示,胶质瘤细胞系U87在ADAP2敲低后显著抑制了胶质瘤细胞的迁移和侵袭。CGGA(CC)PlasmamembraneCountExtracellularexosome-Integral component ofmembrane8090-log10(pvaluc)10152025-log 10(P-value)TCGA(BP)020253035404550-log 10(P-value)CGGA(KEGG)CGGA(MF)ProtcinbindingCountF50100F150200250Extermal sideof plasmamembrane-logl0(pvalue)LysosomeMembrane raff0152025303540-log 10(P-value)TCGA(CC)PlasmamembraneCountExtracllularexosome6080100120140160-log10(pvalue)CountSignaling receptoractivity100Transmembrane signaling200receptoractivity300-400Cytokinereceptoractivity-logl0(pvaluc)4Identical protein bindingL10MHCclassllproteincomplex bindingProtcin bindingCountSignaling receptoractivityrloo200300Extemal sideofplasmamembrane400500Cell surface-log1o(pvalue)20ExtracellularregionMembrane0202530354045-log 10(P-value)-log 10(Pvalue)9.51010.5111151212.5KEGG PathwaysLysosomeFegammaR-mediated phagocytosis.mieslinalinaunenerworkTorigA productionfellreceptorognalnepaclmiPhagosome246810-log 10(P-value)TCGA(MF)Transmembrane signalingreceptoractivityIdentical protein bindingMHCclass II receptoractivits-MHCclassllproteincomplex binding0101520-log 10(P-value)TCGA(KEGG)-log 10(Pvalue)7516171819KEGGPathwaysIntestinal immunenetworkforIgA productionPhagosomeAllograftrejectionGrafi-versus-hostdiseaseHematopoietic cell lincageCell adhesionmolecules(CAMs)Count200400600800-log10(pvaluc)10HA,B,C:GO分析CGGA数据库中ADAP2主要的生物学功能、细胞定位和分子功能；D,E,F:GO分析TCGA数据库中ADAP2主要的生物学功能、细胞定位和分子功能；G,H:KECG分析ADAP2相关的信号通路图2 ADAP2与胶质瘤的免疫过程和炎症反应密切相关512A,B：热图显示ADAP2表达情况和免疫反应富集评分;结果按ADAP2表达升序排列。右侧的柱形图和折线图显示了相关分析的R值和P值P=-log10(p-value)CGGADatabaseCD200R1PDCD1LG2ADAP2HAVCR2CD20OR1TCGADatabaseJ Clin Neurosurg,October 2023,Vol.20,No.5CGGADatabaseExpressionofADAP2ImmuneresponseT cell activation involved in immune responseB cell activation involved in immune responseCytokine production involved in immune responseImmune response to tumor cellNatural killer cell activation involved in immune responseMyeloid cell activation involved in immune responseActivationofimmuneresponseCell activation involved in immmune responseLymphocyte activation involved in immune responseTCGADatabaseExpressionof ADAP2ImmuneresponseT cell activation involved in immune responseBcell activation involved in immune responseCytokine production involved in immuneresponseImmune response to tumor cellNatural killer cell activation involved in immune responseMyeloid cell activation involved in immune responseActivationofimmuneresponseCell activation involved in immune responseLymphocyte activation involved in immuneresponse图3ADAP2与免疫反应的相关性分析CGGADatabaseR(pearson)0CD21CD274R(Pearson)00.51R(Pearson)00.51TCGADatabaseADAP2ADAP2HCKHCKIFNIFNLCKLCK1gG1gGMHC.IMHC.IMHC.IIMHC.ISTAT1STAT1B人A:ADAP2与抑制性免疫检查点之间的Pearson相关性分析，带的宽度代表R值（P0.05）；B,C:A D A P2 和炎症反应元基因簇相关性矩阵，左下角显示相关系数趋势，双色渐变和扇形尺寸代表相关性，红色为正相关，绿色为负相关，使用Pearson相关分析进行检验图4ADAP2与免疫检查点和炎症反应的相关性CGGADatabase1.00ADAP2EXPStrata-HighExp+LowExp0.750.500.25P0.0001010002.0003.00040005000Survival(Days)Number at risk329126541431328179962330Cumulativenumberof events183214226228228一0126155164166166CGGA和TCGA数据库中ADAP2差异性表达的预后分析图5月胶质瘤患者 ADAP2表达的Kaplan-Meier 生存曲线3讨 论TIME作为癌症研究重点,TIME中的重要成分T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)产生的干扰素（interferon,IFN-）可激活细胞毒性反1.0010.750.500.25P0.00010100020003 000400050006000Survival(Days)Number at risk3024718611130163269710Cumulativenumberofevents1031181201231231230374753 545656B应并抑制肿瘤进展17 。已发现TIME在胶质瘤的TCGA DatabaseADAP2EXPStrata-HighExp+LowExp发生发展中起重要作用,并且已经在临床上取得了不错的效果18 。ADAP2作为一种微管相关蛋白，影响细胞运动、分裂和囊泡运输等过程19 ,在促进宫颈瘤细胞增殖和骨肉瘤转移中发挥作用2 0-1 研究表明,胶质瘤间充质亚型与肿瘤相关小胶质细胞的增加有关2 。在胶质瘤中,小胶质细胞是最丰富的细胞类型之一,与疾病进展高度相关2 3。此外，肿瘤相关小胶质细胞和肿瘤浸润中性粒细胞也会影响化疗和免疫治疗的疗效2 4。肿瘤组织中的小胶质细胞大多具有M2表型和功能,表明肿瘤组织中存在促进小胶质细胞向M2极化的特殊微环境2 5。肿瘤相关的小胶质细胞在肿瘤恶化和转移中扮演着关键的生物学功能2 6 。例如,肿瘤细胞产生的代谢物可以导致小胶质细胞极化，从而产生多种细胞因子临床神经外科杂志2 0 2 3年第2 0 卷第5期ADAP2GAPDH5132.0TheexpressionofADAP2 innormal and glioma cell lines(I+NdL)8ol1.5-44 kDa1.00.5-36 kDa0WTsi-NCsi-ADAP2NHAHTDDH4300U87MGA172*200-1000400300200100-si-NCSi-ADAP2A：W e s t e r n Blo t 检测ADAP2敲除效率；B,ADAP2在CCLE数据库中正常和胶质瘤细胞系中的表达水平；C,D:Transwell细胞迁移实验检测ADAP2敲除后细胞迁移能力；E,F:Transwell细胞侵袭实验检测ADAP2敲除后细胞侵袭能力和血管生成诱导因子，促进肿瘤的进展和侵袭2 7 。另外，已经有研究发现,IL-8可帮助癌细胞通过小胶质细胞诱导的血管生成逃避免疫反应2 8 。此外,癌症干细胞还可以通过M2小胶质细胞分泌多种细胞因子来促进抑制性免疫反应2 9 。转化生长因子(transforming growth factor,TGF-)1 和 IL-10 则通过抑制T细胞增殖来促进肿瘤细胞的免疫逃逸30 树突状细胞也可以通过促进Treg 细胞增殖和降低CD8*T 细胞的细胞毒性来诱导肿瘤细胞转移31。在本研究中,ADAP2在胶质瘤中表达上调,可能是胶质瘤患者潜在预后标志物。GO和 GSVA分析结果显示,ADAP2与免疫和炎症反应正相关,对靶向胶质瘤治疗的潜在通路进行了预测。此外，体外实验使用胶质瘤U87细胞系敲低ADAP2后,可以发现胶质瘤细胞迁移和侵袭能力被显著抑制。这些发现为ADAP2 的侵袭和转移提供了新的见解。尽管本研究发现,ADAP2可以通过调节细胞迁移和侵袭影响胶质瘤患者进展,可作为胶质瘤患者潜在治疗途径。本研究仍存在一些局限性,但可为下一步探索ADAP2对胶质瘤的机制实验奠定基础。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。参考 文 献1伊凯凯,战琦，王晓光，等.PTRF/Cavin-1作为外泌体标志物在si-NC*水0si-NC图6 Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力胶质瘤诊断和治疗中的研究进展J.临床神经外科杂志，2022,19(5):511-514.2Cloughesy TF,Cavenee WK,Mischel PS.Glioblastoma:frommolecular pathology to targeted treatment J.Annu Rev Pathol,2014,9(9):1-25.3Long GV,Atkinson V,Lo S,et al.Combination nivolumab andipilimumab or nivolumab alone in melanoma brain metastases:amulticentre randomised phase 2 study J.Lancet Oncol,2018,19(5):672-681.4Zhang H,Cui BQ,Zhou YL,et al.B2M overexpression correlateswith malignancy and immune signatures in human gliomas J.SciRep,2021,11(1):5045.5Zhang H,Dai ZY,Wu WT,et al.Regulatory mechanisms ofimmune checkpoints PD-LI and CTLA-4 in cancerJ.J Exp ClinCancer Res,2021,40(1):184.6Wang HX,Xu T,Huang QL,et al.Immunotherapy for malignantglioma:current status and future directions J.Trends PharmacolSci,2020,41(2):123-138.7Sadeqi Nezhad 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