1株腹泻型大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验.pdf

年第 期（总第 期）畜禽业试验研究基金项目：成都市科技局重点研发支撑计划项目（）株腹泻型大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验慈丽，史纪强，李晏，曾南方，颜其贵 甘肃省甘南州迭部县动物疫病预防控制中心，甘肃 迭部 四川农业大学动物医学院，四川 成都 巨星农牧有限公司，四川 乐山 摘要四川某猪场发生 起仔猪急性腹泻死亡病例，为判明原因和找到治疗方案，对仔猪肠道内容物进行细菌分离鉴定及药敏试验。从死亡仔猪肠道内容物分离获得株大肠杆菌 ；在麦康凯平板上，菌落分别呈粉红色；检测致腹泻毒力基因，其中 、基因为阳性；药敏试验表明该菌株对氨曲南、丁胺卡那、多粘菌素、恩诺沙星、氟苯尼考、美罗培南、替卡西林、头孢噻吩、氧氟沙星 种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、多西环素、呋喃妥因、磺胺异唑、四环素、万古霉素 种药物耐药。将该菌株进行动物回归试验，从攻毒猪脾脏及肠内容物分离获得大肠杆菌，通过 和毒力基因检测证明与攻毒株一致，证明分离株对仔猪具有致病性。关键词大肠杆菌；毒力基因；药敏试验；动物回归试验 ：?引言大肠埃希菌（，）俗称大肠杆菌，是动物肠道中的正常寄居菌，在特定条件下，大肠杆菌可引起人和动物的肠道和肠外组织感染 。少部分血清型的大肠杆菌及其产生的毒素可引起猪发病，即猪大肠杆菌病 。该病主要引起猪肠道膨胀，肠系膜淋巴结充血肿大，肝、肾等组织脏器出现凝固性坏死 ，对仔猪生长发育影响重大，是影响养猪业发展的重要疫病之一 。不同日龄猪对大肠杆菌易感性不同，但仔猪对其易感性最高，因日龄的不同，仔猪的发病临床表现也不同，可分为以排黄色浆状稀粪为主的仔猪黄痢、排乳白或灰白浆糊状粪便的仔猪白痢和以胃壁等部位水肿为主的仔猪水肿病。目前，大肠杆菌病在世界各地均有报道，其发病率和死亡率在仔猪疾病中位于前列 。该病有较高的致病率和病死率，在我国多个地区时有发生，对我国的养猪业有严重的危害，可造成严重经济损失。近来，四川某地猪场发生一起以腹泻为主要特征的疫情，发病快且具有较高的死亡率，为弄清楚其病原，特进行微生物学诊断和药敏试验，以判明其病因并提供治疗药物参考。?材料与方法 材料）病料来源：四川雅安某猪场腹泻死亡仔猪。）试验动物：头断奶仔猪，临床健康、体质量相近，由巨星农牧股份有限公司提供。）主要试剂：细菌 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液（），购自上海生工生物科技有限公司；药敏纸片阿莫西林、氨苄西林、氨曲南、丁胺卡那、多西环素、多粘菌素、恩诺沙星、呋喃妥因、氟苯尼考、磺胺异唑、美罗培南、庆大霉素、四环素、替卡西林、头孢噻吩、头孢噻肟、万古霉素、氧氟沙星等 种药敏纸片，均购自杭州微生物生物试剂公司；培养基及麦康凯培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。方法 细菌分离及染色镜检用无菌棉签采集死亡仔猪肠道内容物及粪便，置于 管中，加入无菌 ，接种于麦康凯平板上，培养 ，挑取圆形、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小的粉红色小单个菌落革兰染色观察。并接种至 液体培养基扩大，振荡培养 后冷藏保存。菌液加入 甘油生理盐水，置于 保存。试验研 究 ，鉴定使用细菌 基因组提取试剂盒提取冷藏保存的菌液的基因组 ，以基因组 为模板，并以实验室已有的大肠杆菌作为阳性对照，采用表 中 扩增引物，用 经 个循环扩增后，在 琼脂糖凝胶中电泳后观察结果，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司，使用扩增引物进行测序。表 扩增引物引物名称引物序列扩增片段大小 退火温度 大肠杆菌毒力基因的检测根据参考文献 推荐的方法，合成对应引物，引物序列、目的片段大小见表 。以 节提取的基因组 为模板，使用 经 个循环扩增后，在 琼脂糖凝胶中电泳后观察结果。表 的毒力基因扩增引物毒力因子引物序列扩增大小 退火温度 （）药敏试验用纸片法（）对分离菌进行药物敏感性试验，用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径，参照美国临床与实验室标准化协会（，）文件（）判定结果。动物回归试验 攻毒菌株制备经过至少两代复苏培养、活力恢复的目标菌株接种到 肉汤中，、培养 至对数生长期，使用比浊管测试并调节菌液浓度到 ，作为攻毒菌液。攻毒菌液现配现用。动物试验分组将 头仔猪分成 组，攻毒组 头，编号为 口服灌喂 碳酸氢钠溶液，后灌服接种攻毒菌液 并肌内注射 。对照组，编号为 ，口服灌喂 碳酸氢钠溶液，后灌服 溶液并肌内注射 。临床观察攻毒后连续观察 ，观察仔猪的排便情况、饮食情况及精神状态并记录仔猪发病时间和死亡情况。剖检观察对死亡仔猪进行剖检，并记录剖解症状，剖检后对各组织脏器以及肠道内容物进行细菌分离鉴定。?结果 细菌分离及染色镜检病死仔猪肠内容物接种于麦康凯培养基上，培养 ，可见光滑、湿润、粉红色小菌落，直径 （图 ）。挑取单菌落，进行革兰染色，镜检可见形态均一，两端钝圆、革兰氏阴性、中等大小的杆状细菌（图 ），初步鉴定为肠杆菌科的细菌。年第 期（总第 期）畜禽业试验研究（）麦康凯平板划线（）革兰染色镜检图 分离株麦康凯平板划线及革兰染色镜检（）鉴定对细菌 进行 扩增，产物经 凝胶琼脂电泳，该菌株在 左右处有清晰条带，与预期条带大小相符（图 ）。测序结果用 软件进行相似性比较，结果发现分离株 与 中 公 布 的 大 肠 杆 菌（）的 序列同源性达到 以上，确定分离的细菌为大肠杆菌。；阳性对照；阴性对照。图 分离株 基因的 电泳 大肠杆菌毒力基因的检测结果显示，在 种常见致病性大肠杆菌相关毒力基因中，共检测出 、这 个毒力基因（图 ），证明该分离株为致病性大肠杆菌。；、分离株；、阴性对照。图 分离株毒力基因检测 药敏试验采用药敏纸片法对分离到的大肠杆菌进行 种常用抗菌药物的药敏性检测，结果该细菌对 种药物耐药，对 种药物中介，对 种药物敏感，具体检测结果如表 所示。表 药敏试验结果药物抑菌圈直径判断标准 耐药中介敏感抑菌圈直径 敏感性阿莫西林 氨苄西林 氨曲南 丁胺卡那 多西环素 多粘菌素 恩诺沙星 呋喃妥因 氟苯尼考 磺胺异唑 美罗培南 庆大霉素 四环素 替卡西林 试验研 究 ，续表药物抑菌圈直径判断标准 耐药中介敏感抑菌圈直径 敏感性头孢噻吩 头孢噻肟 万古霉素 氧氟沙星 注：代表敏感，代表耐药，代表中介。动物回归试验 临床观察攻毒后 ，攻毒组仔猪运动稍有减少，嗜睡，但刺激反应正常，被毛粗糙，采食正常，粪便稀软但成形，肛周及会阴部未见粪污；对照组仔猪一切正常。攻毒后 ，攻毒组仔猪运动稍有减少，嗜睡，刺激反应减弱，被毛粗糙，采食减少，出现拉稀症状，粪便糊状不成形，无粪水分离现象，肛周粪污明显；对照组仔猪一切正常。攻毒后 ，攻毒组仔猪不活跃，能站立但出现斜倚，瘦弱，食欲明显减退，出现血便情况，肛周粪污明显（图 ）；对照组仔猪一切正常。攻毒后 ，攻毒组仔猪死亡；对照组仔猪一切正常。图 肛周粪污明显 剖检观察对死亡仔猪进行剖检，腹腔内有大量腹腔积液；小肠扩张、肠壁变薄、严重水肿出血（图 ），肠系膜淋巴结肿大、充血（图 ）。图 感染仔猪的病理解剖病变 组织细菌分离分离死亡仔猪病变脾脏及肠内容物中的病原菌，染色镜检结果与原分离菌形态一致。?讨论在饲养环境变化、感染了其他免疫抑制性疾病或腹泻性疾病后，仔猪易发生大肠杆菌病。本试验在猪场前期对常见病毒性腹泻病原筛查均为阴性的基础上，根据发病死亡仔猪的临床症状，怀疑该猪场猪感染了大肠杆菌。引起腹泻的大肠杆菌主要类型是产肠毒素型大肠杆菌（，）和肠致病型大肠杆菌（，），会引起新生仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻，会引起断奶仔猪腹泻 。引起断奶仔猪腹泻的 会携带菌毛 （）或者 并产生黏附素从而更好地定植于肠道，定植后会在肠道产生一种或多种肠毒素，例如热稳定型毒素 （，）、热稳定型毒素 （，）和热不稳定型毒素（，）。本试验通过毒力基因的筛查，确定所感染大肠杆菌含有的毒力基因为 、，该 种毒力基因均是 常携带的毒力基因，分离株携带全部 种腹泻毒力基因，证明其毒力强，这可能是该猪场出现数十头仔猪腹泻死亡的原因。因此对分离株进行动物回归试验，确定其对仔猪能致腹泻死亡，判定该猪场仔猪腹泻死亡的病因为感染含有多腹泻毒力基因的 。药敏试验结果表明，从该猪场分离出来的菌株对阿莫西林、氨苄西林、多西环素、呋喃妥因、磺胺异唑、四环素、万古霉素等表现出不同程度耐药，可能是由于该猪场使用抗生素不规范、不科学、未轮换用药，或该猪场所感染的大肠杆菌菌种本身就是耐药菌。而耐药性细菌感染数量的上升已经严重威胁公众的身体健康，感染的发病率和致死率均很高 。年第 期（总第 期）畜禽业试验研究?结论本试验从四川雅安某猪场腹泻仔猪肠内容物分离获得了 株产肠毒素型大肠杆菌，确定了其能致仔猪腹泻死亡，并通过药敏试验确定其对氨曲南、丁胺卡那、多粘菌素、恩诺沙星、氟苯尼考、美罗培南、替卡西林、头孢噻吩、氧氟沙星 中药物敏感。本试验诊断出了该猪场腹泻的病因，并为后续该猪场仔猪腹泻病用药防控提供了参考。参考文献：陈西风，何涛 中草药饲料添加剂在牛羊养殖业中的应用 中国动物保健，（）：祖立闯，谢金文，姚春阳，等 一例白猪致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 养猪，（）：杨莉，余波，徐景峨，等 猪大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 上海畜牧兽医通讯，（）：何金娇，毛雪飞，孙国鹏，等 猪源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析 家畜生态学报，（）：魏恒，王韦华，李娟娟，等 陕西关中地区猪大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测 陕西农业科学，（）：，（）：，：，（）：，（）：葛晨玲，石大丽，胡文，等 广西猪源产肠毒素大肠杆菌毒力因子及多重耐药性分析 中国畜牧兽医，（）：作者简介：慈丽（），女，甘肃迭部人，硕士，兽医师，从事预防兽医工作。（上接第 页），：，（）：，：，（）：郭伟娜，赵霞，路振香 兔源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析 中国兽医杂志，（）：，（）：，（）：饶秋华，刘洋，周伦江，等 福建省产毒素多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及致病性研究 中国预防兽医学报，（）：，（）：郭伟娜，胡明静，赵霞，等 猪源多杀性巴氏杆菌的分离及毒力基因检测 安徽科技学院学报，（）：方超，李润成，魏榕，等 猪源荚膜血清 型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、毒力基因检测与致病性研究 中国预防兽医学报，（）：赵猛，马凯茹，王守政，等 牦牛源 型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验 动物医学进展，（）：徐志媛，李杰峰，孙艳玲，等 一株猪源多杀性巴氏杆菌的分离及耐药性分析 畜牧兽医科技信息，（）：李红婕，董紫凡，车勇良，等 猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及 基因遗传进化分析 中国畜牧兽医，（）：作者简介：其美拉姆（），女，西藏洛隆人，本科，助理兽医师，从事预防兽医工作。陈弟诗（），男，四川雅安人，博士，高级兽医师，从事动物疫病防控和兽医科研与应用推广工作。