BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响.pdf

Vol.43 No.9 Sept.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（9）BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响杨婧潇1，贾子尧1，吴文广1，吴向嵩2，3，张飞2，3，李怀峰2，3，朱逸荻2，3，李茂岚11.上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科，上海 200127；2.上海交通大学医学院附属新华医院普外科，上海 200092；3.上海市胆道疾病研究中心，上海 200092摘要 目的探究乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）第1325位精氨酸变为赖氨酸（R1325K突变）对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ增殖和凋亡的影响。方法使用BRCA1野生型过表达慢病毒、BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒以及阴性对照慢病毒载体构建胆囊癌细胞系 GBC-SD 和 NOZ 稳转株。细胞分为不含目的基因的对照组、BRCA1野生型组及BRCA1突变组，并通过Western blotting验证目的蛋白BRCA1的表达情况。选用针对BRCA1突变的抑制剂奥拉帕利（Olaparib）20 mol/L处理BRCA1突变组胆囊癌细胞，并根据目的蛋白的表达情况和加药与否将胆囊癌细胞系分为对照组、BRCA1野生型组、BRCA1突变组和BRCA1突变+Olaparib组。通过CCK8实验和克隆形成实验观察BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ增殖能力及克隆形成能力的影响，通过TUNEL实验观察BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ凋亡情况的影响，并通过Western blotting检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bcl-2和Bax的表达情况。使用抑制剂Olaparib处理BRCA1 R1325K突变过表达胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ，并检测BRCA1 R1325K突变引起的相应表型改变（促进增殖、增强克隆形成能力和抑制凋亡）是否能被抑制剂所逆转。结果通过CCK8实验和克隆形成实验发现：相较于对照组及BRCA1野生型组，BRCA1 R1325K突变能够促进胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ的增殖，并提高其克隆形成能力；抑制剂Olaparib处理则能够抑制BRCA1突变胆囊癌细胞系的增殖（均P0.05）。通过TUNEL和Western blotting 实验发现：相较于对照组，野生型 BRCA1 基因过表达能够诱导胆囊癌细胞系 GBC-SD 和 NOZ 的凋亡；BRCA1突变组相较于对照组和BRCA1野生型组，有抵抗凋亡的作用，且升高了凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并降低了促凋亡蛋白Bax的表达（P0.05）。结论BRCA1 R1325K突变能够促进胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ的增殖并抑制其凋亡。关键词胆囊癌；BRCA1；突变；增殖；凋亡DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.09.001 中图分类号R735.8 文献标志码AEffect of BRCA1 R1325K mutation on proliferation and apoptosis of gallbladder cancer cellsYANG Jingxiao1,JIA Ziyao1,WU Wenguang1,WU Xiangsong2,3,ZHANG Fei2,3,LI Huaifeng2,3,ZHU Yidi2,3,LI Maolan11.Department of Biliary-Pancreatic Surgery,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2.Department of General Surgery,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China;3.Shanghai Key Laboratory of Biliary Tract Disease Research,Shanghai 200092,ChinaAbstract Objective To investigate the effects of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)R1325K mutation arginine(R)to lysine(K)mutation at amino acid 1325 on the proliferation and apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ.Methods BRCA1 wild-type overexpression lentivirus,BRCA1 R1325K mutation overexpression lentivirus,and negative control lentivirus were used to construct the stable transgenic strains of gallbladder carcinoma,cell lines GBC-SD and NOZ.The cells were divided into the control group without the target gene,the BRCA1 wild-type group,and the BRCA1 R1325K mutation group.The expression of target protein was verified by Western blotting.The BRCA1 R1325K mutant gallbladder cancer cells were treated with 论著 基础研究基金项目 国家重点研发计划（2021YFE0203300）；国家自然科学基金面上项目（82073206）；上海市卫生健康委员会健康产业临床研究专项（20224Z0014）；上海市教育委员会曙光项目（20SG14）；上海市科学技术委员会基础研究项目（20JC1419100，20JC1419101，20JC1419102）；上海市申康医院发展中心临床科技创新项目（SHDC12019110）；上海市消化疾病临床医学研究中心分中心（19MC1910200）；上海交通大学医学院“双百人”项目（20181808）。作者简介 杨婧潇（1998），女，硕士生；电子信箱：yang_。通信作者 李茂岚，电子信箱：。Funding Information National Key Research and Development Program of China(2021YFE0203300);National Natural Science Foundation of China(82073206);Shanghai Municipal Health Commission Health Industry Clinical Research Special Project(20224Z0014);Shuguang Program of Shanghai Education Development Foundation and Shanghai Municipal Education Commission(20SG14);Basic Research Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality(20JC1419100,20JC1419101,20JC1419102);Clinical Science and Technology Innovation Project of Shanghai Shenkang Hospital Development Center(SHDC12019110);Shanghai Clinical Medical Research Center for Digestive Diseases(19MC1910200);“Two-hundred Talents”Program of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine(20181808).Corresponding Author Li Maolan,E-mail:.10712023,43（9）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)20 mol/L Olaparib,a BRCA1 mutation inhibitor.Gallbladder cancer cell lines were divided into the control group,the BRCA1 wild-type group,the BRCA1 R1325K mutation group,and the BRCA1 R1325K mutation+Olaparib group according to the target gene expression and whether or not the inhibitor was added.The effect of BRCA1 R1325K mutation on proliferation and clonogenesis ability of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ was observed by CCK8 assay and clonogenesis assay,respectively.The effect of BRCA1 R1325K mutation on apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ was observed by TUNEL assay.The expressions of apoptosis-related proteins,cleaved PARP,Bcl-2 and Bax,were detected by Western blotting.The inhibitor Olaparib was used to treat the BRCA1 R1325K mutant gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ.The phenotypic changes(promoting proliferation,enhancing clonogenesis and inhibiting apoptosis)induced by BRCA1 R1325K mutation were tested in the presence of Olaparib to determine whether the changes could be reversed by the inhibitor.Results The results of CCK8 assay and clonogenesis assay showed that BRCA1 R1325K mutation could promote the proliferation of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ,and improve their clonal formation ability,compared with the control group and the BRCA1 wild-type group.Olaparib inhibited the proliferation of gallbladder cancer cell lines overexpressing BRCA1 R1325K mutation(P0.05).Through TUNEL and Western blotting,it was found that overexpression of wild-type BRCA1 could induce the apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ,compared with the control group.Compared with the control group and the BRCA1 wild-type group,the BRCA1 R1325K mutation group had anti-apoptotic effect,in which the expression of apoptosis-inhibiting protein Bcl-2 increased and the expression of pro-apoptotic protein Bax decreased(P0.05).Conclusion BRCA1 R1325K mutation can promote the proliferation of GBC-SD and NOZ cell lines and inhibit their apoptosis.Key words gallbladder cancer;BRCA1;mutation;proliferation;apoptosis胆囊癌是一种常见的胆道恶性肿瘤，现已成为全球消化道肿瘤发病率排名第五的恶性肿瘤1。我国属胆囊癌高发地区，且近年来发病率持续上升2-3。由于胆囊癌发病隐匿，早期无特异性临床表现，但侵袭性强，进展迅速，诊断时往往已达晚期，手术切除率低，术后易出现复发和远处转移，预后较差，5年生存率仅 5%15%4-6。根据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年全球癌症数据库7，每年胆囊癌新发病例占所有肿瘤的0.6%，死亡病例则占所有癌症死亡人口的0.9%。因此，推进对胆囊癌的相关研究，寻找新的胆囊癌标志物和治疗靶点，对于提高胆囊癌诊疗水平显得愈发重要。BRCA（breast cancer susceptibility gene）基因家族在 DNA 损伤修复中发挥着重要作用。其中，BRCA1参与激活双链断裂修复和同源重组，还可通过调控转录及细胞周期来影响 DNA 损伤修复过程8。BRCA1突变分为生殖系突变（体内所有细胞均存在突变）和体细胞突变（仅在肿瘤细胞中检测到BRCA1突变）。目前已有许多研究表明，BRCA基因家族生殖系突变与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等许多肿瘤的发生和发展密切相关9-11。其中BRCA1生殖系突变是已知的最有可能导致女性家族性乳腺癌和卵巢癌的遗传因素，且与不良预后相关12-14。BRCA1的体细胞突变发生率低于生殖系突变。也有研究15-16表明在卵巢癌等肿瘤中，体细胞突变患者发病年龄更晚，但在治疗敏感性和无进展生存时间上与生殖系突变患者无明显差异。还有的研究17-18发现，在其他一些肿瘤，BRCA1突变有促进增殖与抑制凋亡的作用。对于BRCA1突变的肿瘤，存在同源重组修复异常，而使用聚 ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂能够抑制DNA损伤修复过程，造成DNA双链断裂，继而引起修复混乱，通过“合成致死”效应达到促进肿瘤细胞凋亡的目的19-20。在此前的临床工作里，我们收治了 1 例BRCA1 R1325K（第1325位精氨酸变为赖氨酸）生殖系突变胆囊癌患者；该患者使用PARP抑制剂奥拉帕利（Olaparib）后肿瘤缩小降期，达到R0切除，成功实现了转化治疗。目前，在胆囊癌中，尚无BRCA1 R1325K突变及其作用的相关报道。基于上述基础，本研究拟进一步探索BRCA1及其R1325K突变对于胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响。1材料与方法1.1主要实验材料及仪器胆囊癌细胞系 GBC-SD和 NOZ均为本实验室保存。使用GV705载体构建添加Flag标签及嘌呤霉素抗性基因但不含有目的基因的对照过表达慢病毒载体（Vector）、BRCA1 野 生 型 过 表 达 慢 病 毒 载 体 及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒载体，并包装慢病毒（由上海吉凯生物科技有限公司完成）。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、微管1072杨婧潇，等BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（9）蛋白（-tubulin）抗体、Flag抗体、cleaved PARP抗体、Bcl-2 抗 体、Bax 抗 体（美 国 Cell Signaling Technology公司），BRCA1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），CCK8试剂盒（翊圣生物科技上海有限公司），一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（上海碧云天生物技术有限公司），Olaparib（美国MedChemExpress公司），中强度RIPA裂解液、5上样缓冲液（上海雅酶生物科技有限公司）。光学倒置显微镜（日本Nikon公司）；Leica倒置荧光显微镜DM2500徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；美国 MD SpectraMax 190 全波长酶标仪美谷分子仪器（上海）有限公司；5424R型高速冷冻离心机（德国 Eppendorf 公司）；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。1.2实验方法1.2.1BRCA1野生型和突变型胆囊癌稳转细胞系的构建选用 GBC-SD和 NOZ胆囊癌细胞系，分别用BRCA1野生型及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒颗粒感染，构建相应的胆囊癌稳转细胞系，并使用相应的阴性对照慢病毒构建对照胆囊癌稳转细胞系。具体如下：在六孔板中，每孔接种约1105个细胞，待细胞生长至约 70%融合度后，按慢病毒感染复数（MOI）为10加入BRCA1野生型或BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒载体感染，48 h后更换为含5 g/mL嘌呤霉素的培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清）进行抗性筛选，每日观察细胞生长情况，7 d后通过Western blotting验证目的蛋白BRCA1的表达情况。刮取筛选后的细胞，使用含1%PMSF的RIPA裂解液和超声破碎仪充分裂解细胞。4、14 000g离心15 min后吸取上清液，加入上样缓冲液，100 加热 10 min。使用 7.5%凝胶，上样 10 L 进行电泳（130 V，80 min），电泳结束后，冰浴下转至 PVDF膜（转膜条件：100 V，200 min）。转膜结束后使用5%脱 脂 奶 粉 封 闭 1 h，洗 净 脱 脂 奶 后 分 别 滴 加BRCA1 一抗和-tubulin 一抗（均为 1 1 000 稀释），4 孵育过夜，次日 PBST 洗膜 3 次，每次 10 min；加入辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，PBST洗膜 3 次，每次 10 min；滴加显影液于 PVDF 膜上，ChemiDoc XRS+凝胶成像系统曝光并观察条带。1.2.2CCK8 实验细胞分为对照组（Vector 组）、BRCA1 野生型组（BRCA1 wt 组）和 BRCA1 突变组（BRCA1 mut组）和BRCA1 mut+Olaparib组。将细胞消化后进行计数，吹打均匀后按1 200个/孔均匀铺于96孔板中，每孔培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清）总 量 100 L。待 细 胞 贴 壁 后，BRCA1 mut+Olaparib组更换为含20 mol/L Olaparib的新鲜全培养基，其他组更换为新鲜全培养基，并分别在细胞贴壁后0、24、48、72、96 h时，用CCK8试剂盒进行检测。具体方法为：吸净待测孔的培养基，每孔加入100 L无血清培养基和10 L CCK8检测液，37 避光孵育 2 h，用酶标仪检测 450 nm 波长处的吸光度值。每组设置5个复孔。实验数据用Graphpad Prism 9软件绘制折线图。1.2.3克隆形成实验将 Vector 组、BRCA1 wt 组、BRCA1 mut 组和 BRCA1 mut+Olaparib 组细胞消化后进行计数，轻柔吹打均匀使之分散成单个细胞，并按600 个/皿铺于 35 mm 培养皿中。待细胞贴壁后，BRCA1 mut+Olaparib 组更换为含 20 mol/L Olaparib的新鲜全培养基，其他组更换为新鲜全培养基。每3日更换1次对应的新鲜全培养基，每日光学倒置显微镜下观察细胞的增殖情况。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，吸净培养基，每皿用 PBS 洗 2 遍后加入4%多聚甲醛，固定30 min后用结晶紫染色，洗净结晶紫后拍照，光学倒置显微镜下计数大于10个细胞的克隆数并用Graphpad Prism 9软件绘制柱状图。1.2.4TUNEL 实验检测细胞凋亡使用 Vector 组、BRCA1 wt 组、BRCA1 mut 组和 BRCA1 mut+Olaparib组细胞制作细胞爬片。制作完成后，用PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛固定30 min后，PBS清洗1次，加入含 0.3%Triton-X 的 PBS 室温孵育 5 min，PBS 清洗 2次。按照试剂盒所示比例配置检测液（TdT酶荧光检测液=1 9），每片细胞爬片滴加25 L检测液，4 摇床避光孵育过夜，次日PBS清洗3次，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂进行封片。封片后37 避光孵育45 min，于荧光显微镜下观察，分别拍摄DAPI染色图像（曝光时间20 ms）和TUNEL染色图像（曝光时间400 ms），并使用Image J软件进行合并。计算凋亡细胞比例并用Graphpad Prism 9软件绘制柱状图。1.2.5Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达刮取细胞，分别置于1.5 mL离心管中，洗净残余培养基，加入 100 L 含 1%PMSF 的 RIPA 裂解液，吹匀后，用超声破碎仪充分裂解细胞。4、14 000g离10732023,43（9）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)心15 min后吸取上清液，加入上样缓冲液，100 加热10 min。使用 10%电泳凝胶，上样 10 L 进行电泳（130 V，65 min）。电泳结束后，冰浴下转至PVDF膜（转膜条件：100 V，100 min），转膜结束后使用5%脱脂牛奶封闭1 h。洗净后分别滴加cleaved PARP一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗和GAPDH一抗（均为1 1 000稀释），4 孵育过夜，次日 PBST 洗膜 3 次，每次10 min；之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再次PBST洗膜3次，每次10 min；之后滴加显影液于PVDF膜上，ChemiDoc XRS+凝胶成像系统曝光并观察条带。再用Image J软件进行灰度分析，并用Graphpad Prism 9软件对相对蛋白表达量进行统计作图。1.3统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。定量资料用x s 表示。组间比较采用独立样本 t 检验。P0.05），而BRCA1 mut组的细胞增殖能力较Vector组明显增强（均P0.05）；但在加入 20 mol/L Olaparib（适用于 BRCA1/2 突变的靶向药）处理 96 h 之后，BRCA1 mut 组 GBC-SD 和 NOZ细胞的增殖能力均受到了显著抑制（均P0.05）。2.3BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞克隆形成能力的影响如图 3AD 所示，克隆形成实验结果提示：与Vector组相比，过表达野生型 BRCA1 基因对胆囊癌GBC-SDGBC-SDVectorBRCA1 wtBRCA1 mutVectorBRCA1 wtBRCA1 mutVectorBRCA1 wtBRCA1 mutVectorBRCA1 wtBRCA1 mutNOZNOZ86420Relative expressionRelative expression543210ABBRCA1BRCA1220 000220 000-Tubulin55 00055 000-TubulinNote：A.Western blotting was used to detect BRCA1 protein expression in GBC-SD cell line.B.Western blotting was used to detect BRCA1 protein expression in NOZ cell line.P=0.000,P=0.003,P=0.001.图1BRCA1野生型及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒感染后胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ中BRCA1蛋白的表达情况Fig 1Expression of BRCA1 protein in gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ after BRCA1 wild-type and BRCA1 R1325K mutation overexpression lentivirus infection1074杨婧潇，等BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（9）GBC-SD 和 NOZ 细胞的克隆形成能力无明显影响；但BRCA1 mut组相较于Vector组和BRCA1 wt组，胆囊癌细胞的克隆形成能力均明显提高（P0.05）；在加入 20 mol/L Olaparib后，BRCA1 mut组胆囊癌细胞的克隆形成能力显著下降（P0.05）。3212448Relative cell viabilityRelative cell viability72960Time/h244872960Time/h54321GBC-SDABNOZVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibNote：A.Proliferation curves of GBC-SD cell line.B.Proliferation curves of NOZ cell line.P=0.002,P=0.000,P=0.001.图2BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ增殖能力的影响Fig 2Effects of BRCA1 R1325K mutation on proliferation of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+Olaparib2001501005004003002001000Colony numbersColony numbersGBC-SDGBC-SDNOZNOZVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibABCDVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibNote：A.The representative pictures of colony assay in GBC-SD cell line.B.The representative pictures of colony assay in NOZ cell line.C.The statistical graph of colony numbers for GBC-SD cell line.D.The statistical graph of colony numbers for NOZ cell line.P=0.015,P=0.008,P=0.000,P=0.001.图3BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ克隆形成能力的影响Fig 3Effects of BRCA1 R1325K mutation on colony formation ability of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ10752023,43（9）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)2.4BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞凋亡的影响根据文献21报道，BRCA1的高表达在某些肿瘤中可促进凋亡，而其突变则能产生抑制凋亡的作用，故我们用TUNEL实验对胆囊癌细胞GBC-SD和NOZ的凋亡情况进行了检测。如图4AD所示，Vector组胆囊癌细胞未见明显凋亡，在过表达野生型BRCA1VectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibGBC-SDGBC-SDNOZNOZABDC0.60.40.200.60.40.20Ratio of cell apoptosisRatio of cell apoptosis50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 mDAPITUNELMergedDAPITUNELMergedNote：A.The representative pictures of TUNEL assay in GBC-SD cell line.B.The representative pictures of TUNEL assay in NOZ cell line.C.The statistical graph of apoptosis ratio for GBC-SD cell line.D.The statistical graph of apoptosis ratio for NOZ cell line.P=0.001,P=0.000.图4BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ凋亡的影响Fig 4Effects of BRCA1 R1325K mutation on apoptosis of gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ1076杨婧潇，等BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（9）后，可观察到细胞出现部分凋亡，而过表达BRCA1 R1325K 突变则未见细胞凋亡，表明过表达野生型BRCA1可以促使胆囊癌细胞系发生凋亡，而突变型BRCA1无此效应。但在加入20 mol/L Olaparib处理后，BRCA1 mut组重新出现凋亡现象。进 一 步，我 们 用 Western blotting 对 于 BRCA1 R1325K突变前后的凋亡相关蛋白的表达情况进行了检测。如图5A和B所示，相较于BRCA1野生型，过表达突变型 BRCA1 后，cleaved PARP 及促凋亡蛋白Bax的表达量降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量升高，提示BRCA1 R1325K突变后的胆囊癌细胞有一定的抗凋亡能力。而加入 20 mol/L Olaparib 处理后，Bcl-2的表达量则降低，并且 cleaved PARP及 Bax的表达量升高。综上所述，初步认为，野生型BRCA1的 过 表 达 会 促 使 胆 囊 癌 细 胞 发 生 凋 亡，BRCA1 R1325K突变则能够产生抗凋亡的作用。54321043210Relative expressionRelative expressionVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibcPARPBcl-2BaxcPARPBcl-2BaxBcl-2BaxGAPDHBcl-2BaxGAPDH26 00020 00037 00026 00020 00037 000VectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibVectorBRCA1 wtBRCA1 mutBRCA1 mut+OlaparibGBC-SDABNOZcPARPcPARP89 00089 000Note：A.Effects of BRCA1 R1325K mutation on expression of apoptosis-related proteins in GBC-SD cell line.B.Effects of BRCA1 R1325K mutation on expression of apoptosis-related proteins in NOZ cell line.cPARPcleaved PARP.P=0.000,P=0.004,P=0.002,P=0.009.图5BRCA1 R1325K突变对胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ凋亡相关蛋白表达情况的影响Fig 5Effects of BRCA1 R1325K mutation on expression of apoptosis-related proteins in gallbladder cancer cell lines GBC-SD and NOZ10772023,43（9）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.9 Sept.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)3讨论作为胆道系统最常见的恶性肿瘤，胆囊癌起病隐匿，手术依然是其主要的治疗手段。但胆囊癌早期临床症状不典型，多数患者就诊时即已失去手术切除的机会，局部进展、转移性或复发患者只能进行化学治疗（化疗）及其他综合治疗，目前大多难有令人满意的疗效和预后。靶向药物和免疫治疗通过各种机制起到抑制和杀伤肿瘤的作用，其中分子靶向治疗具有特异性强、