人类淋巴细胞株培养.doc

本科学生综合性实验报告

学号 姓名
学院 生命科学学院 专业、班级
实验课程名称 细胞生物学实验
教师及职称 倪娟（助理实验师）
开课学期 2011 至 2012 学年 上 学期
填报时间 2011 年 12 月 1 日

云南师范大学教务处编印
实验序号
实验四
实验名称
人类淋巴细胞株培养
实验时间
2011.11.3—11.24
实验室
生物综合实验室2
1.实验目的
（1）能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
（2）熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。
（3）熟练掌握细胞传代培养的操作方法。
（4）观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。
（5）掌握死活细胞的鉴别原理及方法。

2.实验原理、实验流程或装置示意图

实验原理：
（1）传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作
（2）清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。
（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
（4）细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。
（5）氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
（6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。但由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。
（7）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。由于许多酸性物质不易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。
一． 实验设计方案

实验流程：
一、细胞培养准备工作：
（1）洗液的配置：重铬酸钾6.3g加蒸馏水20ml加热充分溶解后冷却再加入浓硫酸100ml充分溶解再倒入洗液缸
（2）玻璃器皿清洗 干燥 酸性洗液浸泡过夜 清洗 干燥 包装 消毒灭菌 备用
（3）胶塞清洗 干燥 包装 消毒 灭菌 备用

二、培养基的配制：
配置RPMI1640培养液 加酚红通入CO2 超净台中过滤除菌 按一定比例加小牛血清、谷氨酰胺和双抗溶液

三、细胞传代培养：
超净工作台中取8ml生长培养基到自己的细胞培养瓶中 接种适量细胞悬液 旋上盖子 放入二氧化碳培养箱中平放并旋松瓶盖

四、死活细胞的鉴别：
倒置显微镜下观察 将细胞团吹散 取一定量的细胞悬液到离心管中 加入等体积台盼蓝染液混合并放置1min 用血球计数板在显微镜下进行死活细胞的计数 计算每毫升原液细胞数以及细胞存活率

3.实验设备及材料
（一）仪器：
超净工作台、干燥箱、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、显微镜、血球计数板
（二）材料：
微孔滤膜（直径25mm，孔径为0.22um）、细胞培养瓶、玻璃棒、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸 、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、各种规格的Tip 、离心管 、细胞培养瓶、滴管、人类淋巴细胞株
（三）试剂：
75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、1%酚红 、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素 、饱和NaHCO3 、L-谷氨酰胺 、三蒸水、乙醇、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制）

4.实验方法步骤及注意事项
实验步骤：
一、准备工作：
（一）清洗：
1.新玻璃器皿的清洗：
先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。
2.使用过的玻璃器皿的清洗：
（1）立即进入清水，避免干涸难洗；
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；
（3）浸酸性洗液过夜；
（4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；
（5）包装（牛皮纸或不透水纸）；
（6）高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌；备用。
（二）胶塞处理：
（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。
（2）自来水清洗10次
（3）用1%稀盐酸浸泡30min。
（4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。晾干
（5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，即可使用。
（三）塑料制品的清洗：
（1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍
（2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.
（3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次
（4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。
（5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。
（四）洗液的配置：
（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。
（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。
（五）湿热灭菌
也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。

二、培养基的配置：
（一）RPMI 1640 培养液配制：
配制50ml RPMI 1640培养液：称取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水加入转子，置于磁力搅拌器上搅拌 20 min，直到液体变为澄清为止。
（二）RPMI 1640 合成培养基配制：
（1）加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。
（2）溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。
（3）RPMI 1640生长培养基的配制：所需各组分如下表所示

40毫升
储备液浓度
终浓度
RPMI 1640培养液
35.5
—
—
谷氨酰胺
0.4
30mg/ml
0.3mg/ml
双抗
0.04
100000u/ml
100u/ml
小牛血清
4
—
10%

之后再用饱和NaHCO3 调节pH至6.8-8.0（酚红在低pH值时呈现黄色,在高pH值时呈现红色,但在pH6.6至8.0间会呈现橙色）。
三、细胞传代培养：超净工作台中操作
每小组用一个培养瓶配制40ml的生长培养基 每人取8ml培养基到自己的细胞培养瓶内 向细胞培养瓶内接种700-850ul的人淋巴细胞株原液细胞悬浮液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖（根据细胞的数量看细胞培养瓶是否平放或直立放置 ）
隔两三天后观察细胞生长状况。

四、死活细胞鉴别：
（1）取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。
（2）取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。
（3）低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。
（4）计算每毫升原液细胞数以及细胞存活率。

注意事项：
（1）在配置强洗液时操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。
（2）使用移液枪时要注意往下按时按的程度，规范操作。
（3）整个实验过程中都要注意精确的称量物体和所需的溶液。传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
（4）接种时一定要将细胞吹散，使细胞悬液尽可能的均匀。
（5）往血球计数板滴液注意不要有气泡，也不能滴太多，否则会使盖片浮起而使细胞计数不准。
（6）注意血球计数板在显微镜上的操作，注意光圈和亮度的调节，以便能更好的找到格子，进行细胞计数。
（7）进行计数时要清楚的区分死活细胞，注意不要将细胞数重了数多了，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。还要应进行多次计算，取平均值。
（8）注意区分染料颗粒和死细胞。

5.实验数据处理方法
计算经过传代培养的人体淋巴细胞的细胞悬液中所含的细胞数量一般以细胞数/毫升表示。
计算：
每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1 X 1 X 1=0.1 mm3 ，
1ml = 1000 mm3 。每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400 =1/4000mm3 =1/4000,000ml
每毫升原液细胞数 = 4大格细胞总数/4 × 10000 × 稀释倍数
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/ 细胞总数

6.参考文献
马丹炜，王万军 . 2010 . 细胞生物学实验教程 . 北京：科学出版社
安利国 . 2004 . 细胞生物学实验教程 . 北京：科学出版社
翟中和，王喜忠，丁明孝 . 2007 . 细胞生物学 . 北京：高等教育出版社

二．实验报告
1． 实验现象与结果
（一）经过3天的培养之后，细胞培养液的颜色变化不大，是透明略黄的，可隐约看到细小圆形白色颗粒悬浮在培养液中，即为细胞团。
（二）培养一周后，将培养瓶取出，可看到培养液还是澄清透亮，淡黄色。将培养瓶置于倒置显微镜上观察，可看到细胞颗粒的浮动。
（三）显微镜下用血球计数板计数，活细胞较透亮，死细胞被染色，注意与染料颗粒区分。将计数结果记入下表内
大格子

细胞数
第一个
第二个
第三个
第四个
合计
活细胞
A
12
7
8
9
36
B
10
7
6
9
32
平均

11
7
7
9
34
死细胞
A
6
1
4
2
13
B
4
1
4
2
11
平均

5
1
4
2
12

每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1 X 1 X 1=0.1 mm3 ，
1ml = 1000 mm3 。每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400 =1/4000mm3 =1/4000,000ml

根据表内数据计算：
每毫升原液细胞数 = 4大格细胞总数/4 × 10000 × 稀释倍数
=46÷4 × 10000 × 2
=230,000(个/ml)
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/ 细胞总数
=34÷46×100%
=73.91%

2． 对实验现象、实验结果的分析及其结论

（1）经过培养后，培养液颜色由淡红变黄，说明细胞在生长过程中产生的代谢产物为酸性物质。次级代谢产物积累。细胞存活率为73.91%细胞生长处于衰亡期的过程。
（2）细胞生长必须得从培养液中获取养分。当细胞数目增多，培养液中的营养成分缺乏时，细胞间竞争激烈，部分细胞死亡。
（3）用台盼蓝染液进行染色，由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，而不会染色。而死细胞被染色，由此进行死活细胞的鉴别，并便于计数。

3． 实验总结

教师评语及评分：

签名： 年 月 日