Bacillus subtilis Z-5产果胶酶发酵条件的优化及其应用.pdf

张小丹，高梦迪，赵赛赛，等.Bacillus subtilis Z-5 产果胶酶发酵条件的优化及其应用 J.食品工业科技，2023，44（19）：117127.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120061ZHANG Xiaodan,GAO Mengdi,ZHAO Saisai,et al.Optimization of the Fermentation Conditions of Bacillus subtilis Z-5 ProducingPectinase and Its ApplicationJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):117127.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120061 生物工程 Bacillus subtilisZ-5 产果胶酶发酵条件的产果胶酶发酵条件的优化及其应用优化及其应用张小丹1，高梦迪1，赵赛赛1，刘可玉1，宁喜斌1,2,3,*（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估试验室（上海），上海 201306；3.国家淡水水产品加工技术研发分中心（上海），上海 201306）摘要：为进一步提高果胶酶的产量，采用响应面法优化了 Bacillus subtilis Z-5 产果胶酶的发酵培养基和发酵条件，并将优化后得到的果胶酶应用于梨汁澄清实验。通过单因素实验探究 9 个因子对 B.subtilis Z-5 产果胶酶活力的影响，然后采用 Plackett-Burman 试验设计筛选出 3 个显著影响产酶的因素：酵母粉含量、pH、培养时间；再结合响应面设计法确定了最佳的发酵条件。结果表明最佳的发酵培养基成分是果胶 10 g/L，酵母粉 7.99 g/L，MgSO47H2O 0.5 g/L；最佳的发酵条件为初始 pH5.66，发酵温度 37，培养时间 72 h，接种量为 6%（v/v），装液量 50/250 mL，底物浓度为 10 g/L；在此基础上，B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力由 879.00 U/mL 提高到1549.62 U/mL，是优化前的 1.76 倍。在梨汁澄清实验中表明果胶酶的最适添加量为 4 mL，最适酶解时间为 2.5 h，最适酶解温度为 65，最适酶解 pH 为 6.0，此时透光率最大为 79.77%，与商品酶相比，自制果胶酶是一种具有多种酶系复合酶，可作用于梨汁中含有的蛋白、淀粉等其他成分，使得梨汁更加澄清。本研究结果为果胶酶的工业化生产和应用提供了理论支撑。关键词：果胶酶，Bacillus subtilis Z-5，发酵条件优化，果汁澄清本文网刊:中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）19011711DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120061OptimizationoftheFermentationConditionsofBacillussubtilisZ-5ProducingPectinaseandItsApplicationZHANGXiaodan1，GAOMengdi1，ZHAOSaisai1，LIUKeyu1，NINGXibin1,2,3,*（1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China；2.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai 201306,China；3.National R&D Branch Center for Freshwater Aquatic Products Processing Technology(Shanghai),Shanghai 201306,China）Abstract：To further improve the yield of pectinase,the fermentation medium and fermentation conditions for pectinaseproduction by Bacillus subtilis Z-5 were optimized using the response surface methodology,and the optimized pectinasewas applied for the clarification of pear juice.Based on the single-factor experiments,the Plackett-Burman test design wasapplied to screen out three significant factors affecting enzyme production:Yeast powder content,pH and incubation time,and then combined with the response surface design method to determine the optimal fermentation conditions.The resultsshowed that the optimal fermentation medium composition was 10 g/L pectin,7.99 g/L yeast powder and 0.5 g/LMgSO47H2O,the optimal fermentation conditions were initial pH5.66,fermentation temperature 37,incubation time 收稿日期：20221208 作者简介：张小丹（1997），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：ZXD。*通信作者：宁喜斌（1964），男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No.192023 年 10 月Science and Technology of Food IndustryOct.2023 72 h,inoculum 6%(v/v),liquid volume 50/250 mL and substrate concentration 10 g/L.On the basis of this,the enzymaticactivity of pectinase produced by B.subtilis Z-5 was increased from 879.00 U/mL to 1549.62 U/mL,which was 1.76 timeshigher than the unoptimised one.In pear juice clarification experiments,it was shown that the optimum addition ofpectinase was 4 mL,the optimum enzymatic time was 2.5 h,the optimum enzymatic temperature was 65 and theoptimum enzymatic pH was 6.0，the maximum light transmission rate was 79.77%.Compared with the commercial enzyme,the homemade pectinase is a compound enzyme with multiple enzyme systems,which can act on other components such asprotein and starch contained in the pear juice,making the pear juice more clarified.The results of this study have providedtheoretical support for the industrial production and application of pectinase.Keywords：pectinase；Bacillus subtilis Z-5；optimization of fermentation conditions；fruit juice clarification 果胶是一种复杂的、高分子量的酸性结构多糖，作为相邻细胞间的胶结物质，广泛存在于植物中层和初级细胞壁中1，能够保持植物组织的结构完整性和凝聚力2。果胶酶是一组参与果胶聚合物解聚的酶3，根据最适 pH 的不同，可被分为酸性果胶酶和碱性果胶酶4，已广泛应用于果汁澄清、纺织工业、葡萄酒生产工业、蔬菜废物处理、制浆和造纸工艺、植物纤维的脱胶、油提取过程以及茶和咖啡发酵等领域，据报道酸性果胶酶可显著地澄清果汁，其原理是利用果胶酶水解果汁中的果胶物质，提高果汁的出汁率，降低粘度，提高稳定性，减少化学试剂的用量，保留了果汁的营养成分，提高品质，因此果胶酶澄清果汁，具有快速、简便、效果好等特点，在生产过程中具有重要的应用价值5。然而果胶酶在澄清处理时，用量过高，酶蛋白自身会使果汁浑浊，澄清效果不好而且造成资源浪费；用量低时，酶不足以使果胶分解完全，澄清效果不明显，所以其用量是一个关键的影响因素6。随着我国果汁果酒业的迅猛发展，国内对果胶酶的需求量也呈上升趋势7。开发活力高，稳定性好，专一性强的果胶酶制剂是对果胶酶研究的必然要求89。在大多数商业应用中，已经使用了真菌果胶酶，但与真菌来源的果胶酶相比，细菌产的果胶酶具有额外的优势，酶的产生可以在更短的时间内实现，芽孢杆菌菌株是果胶酶的有效来源2。为了更高效地提高果胶酶的产量，不仅要求有一株生长特性良好的菌株，培养条件的优化是微生物实现大批量工业化生产必不可少的环节之一，而不同的培养条件及培养基配比与微生物代谢产物的产量密切相关10。目前国内外学者通过优化培养基成分及培养条件来提高微生物生产果胶酶的产量，如白兰芳等11筛选出一株产果胶酶的细菌 Bacillus stubtilis JLSP-13，通过响应面优化发酵条件后果胶酶活达到 37.6 U/mL；Gupta等12通过响应面优化枯草芽孢杆菌产果胶酶的发酵培养基，其果胶酶产量提高了 2 倍；廖敏等13通过单因素实验和正交试验优化假单胞菌 B41 产果胶酶的培养基及发酵条件，其酶活达 739 U/mL；刘均珠等14从高效酒饼粉中筛选出一株产果胶酶的菌株纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，以百香果皮为发酵原材料进行单因素试验和正交试验优化培养条件，其酶活达到121.46 U/mL，提高了 1.49 倍。本实验前期以果胶为唯一碳源，通过透明圈法和 DNS 法从上海海洋大学橘子园的土壤中筛选出一株高产、有良好热稳定性和酸碱耐受性的产果胶酶的野生型菌株 Z-5。通过鉴定确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。在研究影响果胶酶酶活力的单因素的基础上，本研究通过 Plackett-Burman 设计、Box-Behnken 试验及响应面分析对显著影响的因素进行优化，简化工艺，降低生产成本，以期为工业上果胶酶的生产打下基础。然后将果胶酶应用于澄清梨汁的试验中，以透光率为指标，通过对澄清效果的单因素探究，以期为果汁产品开发提供理论依据和技术支持。1材料与方法 1.1材料与仪器实验菌株由实验室前期筛选到的 Bacillussubtilis Z-5 菌株，保藏于80 冰箱；安徽砀山酥梨、金盖酥储存于阴凉地方，避免阳光直射；商品果胶酶粉购自夏盛食品公司，称取 0.1 g 商品果胶酶粉，用 pH6 的柠檬酸一水-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至 100 mL；葡萄糖、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉均购自上海生工生物工程公司；氯化钠、K2HPO43H2O、KH2PO4、pH6 的柠檬酸一水-磷酸氢二钠缓冲溶液、DNS 等其他试剂均为分析纯；种子培养基（g/L）：蛋白胨 10，牛肉粉 3，氯化钠 5，pH7.5，121 灭菌30 min；发酵培养基（g/L）：葡萄糖 10，酵母粉 5，蛋白胨 5，KH2PO4 3，K2HPO4.3H2O 9，pH6，121 灭菌30 min。UV-1800PC 紫外可见分光光度计上海美普达仪器有限公司；TGL-16G 台式高速离心机上海安亭科学仪器厂；DSX-280B 自动手提式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；THZ300 恒温培养摇床上海一恒科学仪器有限公司；pH730 台式 pH 精密测试仪德国 WTW。1.2实验方法 1.2.1 果胶酶酶活力的测定果胶酶酶活力的测定方法采用 DNS 法，根据文献 1521 并进行适当修改。制备粗酶液：取培养物于 4，10000 r/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。果胶酶活力的测定：采用 DNS 法，取 5 mL 10 g/L的果胶溶液于比色管中，50 水浴预热 5 min，加入4 mL pH6.0 的缓冲溶液，再加入 1 mL 稀释后的酶液，于 50 水浴反应 30 min；取反应液的 1/5 即 2 mL加入另一比色管中，加 2 mL 蒸馏水，再加入 5 mL 118 食品工业科技2023 年 10 月DNS，沸水浴加热 5 min，立即冷却，最后定容到25 mL。于 540 nm 处测 OD 值。对照组将稀释后的酶液沸水浴灭活 10 min，其余条件和实验组相同。果胶酶酶活力的定义：在一定条件下，1 mL 酶液 1 min 分解果胶产生 1 g 半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U/mL）。酶活力计算公式：用测得的 OD540 nm值带入标准曲线中计算出葡萄糖的量（G（mg），再转换成半乳糖醛酸的量（W（mg）。果胶酶酶活力(U/mL)=G194/1801000N5/T；式中：G194/1801000 表示半乳糖醛酸的量（W）15,17,2021；N 表示酶液的稀释倍数；5 表示取了反应液的 1/5；T 表示反应时间（min）。1.2.2 葡萄糖标准曲线在前期实验研究的基础上，确定了葡萄糖标准曲线，其线性回归方程为 y=0.6572x0.1099（y：吸光值；x：葡萄糖含量），R2=0.9993，表明线性拟合程度良好，可用于计算果胶酶酶活力。1.2.3 发酵培养基和发酵条件的单因素 1.2.3.1 碳源对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响在基础发酵培养基中分别添加 10 g/L 的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、果胶、蔗糖、果糖、麦芽糖作为碳源，37，160 r/min 培养 72 h 后测不同碳源对果胶酶酶活力的影响。得到最佳碳源后，设置不同浓度的碳源（6、8、10、12、14、16 g/L），其他条件及添加量不变，测不同浓度的碳源条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.2 氮源对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响在确定了最佳碳源及添加量的基础上分别添加5 g/L 的酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、蛋白胨加酵母粉、NH4Cl 作为氮源，37，160 r/min 培养72 h，测量不同氮源对果胶酶酶活力的影响。确定最佳氮源后，设置不同浓度的氮源（0.5、1、3、5、7、9、10 g/L），测不同浓度氮源条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.3 金属离子对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响确定了最佳碳源和最佳氮源的基础上，添加 0.3 g/L 的不同金属离子（Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+、Mn2+），37，160 r/min培养 72 h，测定不同金属离子对果胶酶酶活力的影响。确定最佳金属离子之后，设置不同的浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L），测定不同浓度金属离子条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.4 发酵初始 pH 对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响在最佳碳源、氮源和金属离子的基础上，将发酵液的初始 pH 设置成 4、5、6、7、8，37，160 r/min 培养 72 h，测定不同 pH 条件下的果胶酶酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.5 发酵温度对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响在碳源、氮源、金属离子和初始 pH 都确定好的基础上，设置不同的发酵温度（28、31、34、37、40、43），160 r/min 培养 72 h，测定不同发酵温度条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.6 培养时间对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响在上述确定好的碳源、氮源、金属离子、初始 pH 和发酵温度的基础上，设置不同的发酵时间（12、24、36、48、60、72、84、96 h），160 r/min，测定不同发酵时间条件下的酶活力，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.7 接种量对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响确定了碳源、氮源、金属离子、初始 pH、培养温度、发酵时间之后，将种子液分别以 2%、4%、6%、8%、10%、12%（v/v）的接种量接入发酵瓶中（50/250 mL），160 r/min，测定不同接种量对酶活力的影响，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.8 装液量对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响确定好上述 7 个因素的最佳结果后，设置不同的装液量（30、40、50、60、70、80/250 mL），测定不同装液量对果胶酶酶活力的影响，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.3.9 底物浓度对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响确定好 8 个最佳因素及保持其他条件不变的情况下，设置不同的底物浓度（4、6、8、10、12、14 g/L），测定不同的底物浓度对果胶酶酶活力的影响，将酶活力最大值定义为 100%，计算相对酶活力。1.2.4 响应面试验设计 1.2.4.1 Plackett-Burman 试验设计如表 1 所示，采用 P-B 试验对 9 个单因素进行探究，每个因素分别设置高、低两个水平，并设置虚拟因素 J 用来考察试验误差，以果胶酶酶活力为响应值，筛选出 3 个显著影响因素。表 1 Plackett-Burman 设计变量Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design编号因素水平低水平（1）高水平（+1）A果胶（g/L）810B酵母粉（g/L）57CMgSO47H2O（g/L）0.40.5D初始pH67E发酵温度（）3743F培养时间（h）4872G接种量（%）46H装液量（mL）4050I底物浓度（g/L）810J虚拟因素1+1第 44 卷 第 19 期张小丹，等：Bacillus subtilis Z-5 产果胶酶发酵条件的优化及其应用 119 1.2.4.2 Box-Behnken 试验设计P-B 试验筛选出的 3 个显著因素分别是酵母粉、pH、培养时间。如表 2 所示，采用 Box-Behnken 设计法（BBD）设置3 因素 3 水平试验，以酵母粉、pH、培养时间为自变量，以果胶酶活力为响应值。表 2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments编号因素水平10+1A酵母粉（g/L）579BpH567C培养时间（h）607284 1.2.5 果胶酶澄清梨汁的应用 1.2.5.1 澄清度的测定以蒸馏水作对照，在 660 nm处测梨汁的透光率，以透光率 T（%）表示梨汁的澄清度16。1.2.5.2 果胶物质的定性检测参考 GB/T 18963-2012浓缩苹果汁进行测定并进行适当修改。取经过澄清过后的梨汁 2 mL，加入 4 mL 体积分数为95%酸性乙醇（含 10 mL/L 浓 HCl）混匀，放置 20 min，如有凝胶或者絮状物出现，则梨汁中含有果胶为阳性。反之，则为阴性16。1.2.5.3 酶的添加量对梨汁澄清度的影响向含 4 mL梨汁的试管中分别加入 0、0.5、1、2、3、4、5、6/4 mL粗酶液，混匀，于 60 反应 2 h，然后沸水浴 2 min终止反应，设置 3 组平行实验，660 nm 处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。1.2.5.4 酶解时间对梨汁澄清度的影响向含 4 mL梨汁的试管中加入 4 mL 粗酶液，混匀，于 60 分别反应 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，然后沸水浴 2 min 终止反应，并设置 3 组平行实验，在660 nm 处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。1.2.5.5 酶解温度对梨汁澄清度的影响向含 4 mL梨汁的试管中加入 4 mL 粗酶液，混匀，分别于 45、50、55、60、65、70 反 应 2.5 h，然 后 沸 水 浴2 min 终止反应，并设置 3 组平行实验，在 660 nm 处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。1.2.5.6 酶解 pH 对梨汁澄清度的影响将 7 份梨汁分别调节 pH 为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，再分别取 4 mL 梨汁于试管中加入 4 mL 酶液，混匀于 60 反应 2.5 h 后沸水浴 2 min 终止反应，设置3 组平行实验，660 nm 处测透光率。商品果胶酶粉处理方法参考粗酶液处理方法。1.3数据处理单因素实验数据用 Origin 处理，P-B 试验用Minitab17 处理，BBD 试验用 Design-Expert 8.0.6处理。2结果与分析 2.1单因素实验结果 2.1.1 最佳碳源的确定如图 1（a）所示，不同碳源对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响不同。果胶、淀粉、葡萄糖作为碳源时，B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力普遍较高，其中果胶尤为明显，淀粉次之，葡萄糖第三。而麦芽糖、果糖、蔗糖和乳糖对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力相对较低。所以选择果胶作为 B.subtilis Z-5 产果胶酶的最佳碳源，可能是因为果胶可以被 B.subtilis Z-5 菌株分解利用，在生长前期促进菌株的生长繁殖，后期有利于产酶。图 1（b）展示的是果胶浓度对 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响，其中当果胶浓度为 10 g/L 时，菌株产果胶酶酶活力最高，因此选择 10 g/L 的果胶作为发酵培养基的唯一碳源。果胶(g/L)468101214161830405060708090100相对酶活(%)aaabcd(b)麦芽糖果糖果胶蔗糖乳糖淀粉葡萄糖050100相对酶活(%)碳源deaefbc(a)图 1 不同碳源（a）及最佳碳源浓度（b）对酶活力的影响Fig.1 Effects of different carbon sources(a)and optimalcarbon source concentration(b)on enzyme activity注：不同字母之间表示差异显著（P0.05）；图 2图 9 同。2.1.2 最佳氮源的确定图 2（a）所示不同的氮源种类对菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的影响。其中无机氮源 NH4Cl 和尿素产果胶酶的酶活力较低，有机氮源相对来说产果胶酶酶活力较高，其中酵母粉最为突出。说明酵母粉更适合 B.subtilis Z-5 菌株的生长，是菌株产果胶酶氮架结构的营养物来源。图 2（b）展示的是不同酵母粉浓度对菌株 B.subtilis Z-5 产果 120 食品工业科技2023 年 10 月胶酶酶活力的影响，从图中可以看出当酵母粉浓度为 7 g/L 时，菌株产果胶酶的相对酶活力最高，所以选择 7 g/L 的酵母粉作为最佳氮源。酵母粉(g/L)0020406080100相对酶活(%)(b)050100相对酶活(%)氮源(a)蛋白胨酵母粉大豆蛋白胨NH4Cl尿素蛋白胨+酵母粉abcdefabcdefg24681012图 2 不同氮源（a）及最佳氮源浓度（b）对酶活力的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources(a)and optimalnitrogen source concentration(b)on enzyme activity 2.1.3 最佳金属离子的确定不同的金属离子对菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的效果不同，如图 3（a）所示，Mg2+、Fe2+实验组的相对酶活力（%）显著大于对照组，说明 Mg2+、Fe2+对 B.subtilis Z-5 产果胶酶活力有显著促进作用，可能是 Mg2+、Fe2+与酶结合后改变了酶的空间结构，稳定了酶蛋白活性的构象，进而提高酶活；Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+实验组的相对酶活力（%）显著小于对照组，说明Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+会抑制菌株产果胶酶的酶活力，可能是由于 Cu2+、Ca2+、Ba2+、Hg2+、Zn2+、K+、Fe3+破坏了该酶的三维构象，使其更易发生失活的现象。其中 Mg2+促进作用最为明显，所以选择 MgSO47H2O 作为最佳金属离子。由图 3（b）可知当 MgSO47H2O 浓度为 0.5 g/L 时，产果胶酶酶活力最大。2.1.4 最佳初始 pH 的确定如图 4 所示，不同的发酵初始 pH 对菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力有一定的影响。过酸或过碱都会影响微生物的生长繁殖，进而影响产酶机制。当初始 pH 为 6 时，菌株产果胶酶酶活力最大，所以选择 pH6 为菌株 B.subtilisZ-5 产果胶酶的最佳初始 pH。34567890255075100相对酶活(%)pHabcdd图 4 不同初始 pH 对酶活力的影响Fig.4 Effects of different initial pH on enzyme activity 2.1.5 最佳发酵温度的确定温度可以影响微生物的生长，进而影响菌株发酵产酶。图 5 所示为发酵温度对 B.subtilis Z-5 菌株产果胶酶酶活力的影响，随着温度的增加，酶活力也增加，当温度为 37 时，酶活力达到最大值，当温度再增加时，酶活力开始下降，所以选择 37 作为 B.subtilis Z-5 菌株产果胶酶最佳的发酵温度。050150100相对酶活(%)金属离子(a)对照Cu2+Ca2+Mg2+Fe2+Ba2+Hg2+Zn2+Mn2+K+Fe3+cabcdefeefeffggMgSO47H2O(g/L)05075100相对酶活(%)(b)abcbbccd0.10.20.30.40.50.60.7图 3 不同金属离子（a）及最适金属离子浓度（b）对酶活力的影响Fig.3 Effects of different metal ions(a)and optimum metal ionconcentration(b)on enzyme activity 第 44 卷 第 19 期张小丹，等：Bacillus subtilis Z-5 产果胶酶发酵条件的优化及其应用 121 相对酶活(%)温度()2831343740434620406080100abcdef图 5 不同发酵温度对酶活力的影响Fig.5 Effects of different fermentation temperatures onenzyme activity 2.1.6 最佳培养时间的确定时间也是影响微生物生长的重要因素之一，如图 6 所示，刚开始培养基中营养物质充足，随着时间的增长，微生物繁殖很快，因而菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶能力增加，直到 72 h时，菌体数量达到最大值，此时菌株产酶能力也达到最大值。72 h 后，营养物质逐渐被消耗，代谢产物增多，菌株的生长受到抑制，此时菌株产果胶酶的酶活力开始下降，所以选择 72 h 为 B.subtilis Z-5 产果胶酶的最佳培养时间。时间(h)相对酶活(%)010001224364860728496255075abbcdefg图 6 不同发酵时间对酶活力的影响Fig.6 Effect of different fermentation time on enzyme activity 2.1.7 最佳接种量的确定由图 7 可知，不同接种量对菌株产果胶酶能力不同，随着接种量的增加，菌株产果胶酶的能力先增加后下降，当接种量在 2%4%（v/v）时，接种量较低，菌体数量较少，所以产酶能力较弱；当接种量为 6%（v/v）时，产酶能力达到最大值；当接种量继续增加，培养基中的营养物质被大量消耗，且氧气容量不足，导致菌株产酶能力下降。因此，将 6%（v/v）确定为菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶的最佳接种量。2.1.8 最佳装液量的确定由图 8 可知，当装液量为 50/250 mL 时，菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶能力最强；当装液量较高时，溶氧量不足，影响了菌株的生长，进而影响菌株的产酶能力；当装液量较低时，营养物质可能不足以维持菌株的生长繁殖，因此也影响了菌株的产酶能力。所以选择 50/250 mL 作为菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶的最佳装液量。装液量(mL)相对酶活(%)251005075304050607080aabbccd图 8 不同装液量对酶活力的影响Fig.8 Effect of different loading amount on enzyme activity 2.1.9 最佳底物浓度的确定底物浓度也是影响菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶能力的重要因素之一。如图 9 所示，随着底物果胶浓度的增加，菌株产果胶 接种量(%)相对酶活(%)251005075024681012aaabbccd图 7 不同接种量对酶活力的影响Fig.7 Effect of different inoculum amount on enzyme activity 果胶浓度(g/L)相对酶活(%)10024681012146080abaaabbc图 9 不同的底物浓度对酶活力的影响Fig.9 Effects of different substrate concentrations on enzymeactivity 122 食品工业科技2023 年 10 月酶酶活力增大；当底物果胶浓度为 10 g/L 时，菌株产果胶酶酶活力值最大；当果胶浓度增加至大于10 g/L 后，酶活力开始降低，所以选择果胶浓度为10 g/L 作为菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶的最佳底物浓度。2.2Plackett-Burman 试验设计结果P-B 试验主要是用来评估 9 个单因素对菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶酶活力的显著性，表 3 为 P-B试验的设计和结果。表 4 是对 9 个单因素进行了主效应分析，三个显著因素分别是酵母粉浓度、初始pH、培养时间，P 值分别是 0.017、0.047、0.037 均小于 0.05。选择显著的三个因素进行 BBD 试验。表 3 Plackett-Burman 试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiment试验号ABCDEFGHIJ酶活力（U/mL）11111111111468.6221111111111783.6231111111111479.55411111111111084.97511111111111348.04611111111111011.85711111111111002.97811111111111069.2591111111111456.32101111111111694.791111111111111408.861211111111111030.98 表 4 Plackett-Burman 设计的因素水平及主效应分析Table 4 Factor levels and main effects analysis of Plackett-Burman design编号因素水平T值P值显著性排序低（1）高（+1）A果胶（g/L）8107.030.0907B酵母粉（g/L）5737.360.0171CMgSO47H2O（g/L）0.40.54.310.1459D初始pH6713.530.0473E发酵温度（）37430.590.65910F培养时间（h）487217.10 0.0372G接种量（%）467.120.0896H装液量（mL）40509.420.0674I底物浓度（g/L）8105.440.1168J虚拟因素1+18.070.0795注：P0.05为显著。2.3响应面设计和结果分析 2.3.1 Box-Behnken 试验设计结果与回归模型方差分析由 P-B 试验筛选出的酵母粉、初始 pH 和培养时间 3 个显著因素之后，利用 BBD 试验对 3 个显著因素做进一步分析。BBD 试验设计表及结果如表 5所示，且对试验结果进行多元回归分析，模型的二次回归方程如下：Y=1452.5982.17A100.06B+50.40C13.65AB+4.65AC+41.20BC403.07A2152.92B2199.87C2式中：Y 代表果胶酶酶活力（U/mL）；A、B、C 分别代表酵母粉（g/L）、初始 pH、培养时间（h）。表 5 Box-Behnken 试验设计与结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment试验号A酵母粉（g/L）B初始pHC培养时间（h）酶活力（U/mL）19660719.3932275841214.56376721443.023476721449.85659772698.713367760903.2047776721463.522876721458.05695660880.40561055721067.21175601194.2971276721448.489139572917.5543145684970.617159684828.19111677841087.699175772902.955 如表 6 所示，A、B、C、BC、A2、B2、C2对 Y 的影响极显著（P0.01），AB 对 Y 影响显著（P0.05），且模型的 F=1271.53，P0.05，失拟项不显著，说明模型拟合较好。R2=0.9994，线性关系明显，校正确定系数 R2Adj=0.9986，说明模型可以解释 99.86%的试验结果，信噪比=95.7454，说明试验精准度高。预测确定系数 R2pred=0.9934 与校正确定系数 R2Adj=0.9986 接近，说明试验预测值在可信区间内。因此，此模型可以用来预测和分析菌株 B.subtilis Z-5 产果胶酶发酵条件的优化。表 6 回归模型的方差分