骨髓间充质干细胞对高转移肝癌模型的干预.doc

www.CRTER.org李天然，等. 骨髓间充质干细胞对高转移肝癌模型的干预骨髓间充质干细胞对高转移肝癌模型的干预*李天然1，杜湘珂2，宋 斌1，魏正茂2，霍天龙2 (1解放军南京军区福州总医院第一附属医院(解放军第九五医院)放射科，福建省莆田市 351100；2北京大学人民医院放射科，北京市 100044)文章亮点：1 肝癌的转移特性是影响预后的关键因素，观察骨髓间充质干细胞对肝癌转移行为的影响情况，对于提高肝癌患者的生存期具有重要的意义。实验将骨髓间充质干细胞移植入具有高转移潜能动物模型中，观察骨髓间充质干细胞对高转移潜能肝癌组织的影响。2 实验结果表明，骨髓间充质干细胞对高转移潜能肝癌动物模型干预效能随时间而变化，骨髓间充质干细胞移植后第3周对肝癌抑制效果最佳，随着时间的延长，骨髓间充质干细胞抑制效能减弱，表明骨髓间充质干细胞具有抗肿瘤的特性，但具有时间性，随着时间的延长抗肝癌的特性逐渐减弱。关键词：干细胞；骨髓干细胞；肿瘤；骨髓间充质干细胞；骨桥蛋白；骨唾液蛋白；整合素；高转移潜能肝癌细胞；动物模型；国家自然科学基金主题词：干细胞；肿瘤；间质干细胞；骨髓；肝肿瘤；模型，动物基金资助：国家自然科学基金(81271607)*；博士后基金项目(20100470172)*摘要背景：骨髓间充质干细胞具备化学趋向性和归巢作用，对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及防止复发转移具有良好的效果。目的：观察人骨髓间充质干细胞移植入动物模型对肝癌组织的影响情况及对肝癌转移潜能影响。方法：制作高转移潜能动物模型，实验组在接种肿瘤后第7日开始尾静脉注射骨髓间充质干细胞，5105/次，2次/周；对照组尾静脉注射骨髓间充质干细胞培养液，0.2 mL/次，实验开始后每4 d用测量肿瘤体积，肿瘤接种后14 d(2周)，21 d(3周)，28 d(4周)，35 d(5周)，42 d(6周)处死动物，称质量，取瘤块，称瘤质量，计算肿瘤质量抑制率。PCR检测动物模型标本转移相关因子骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素基因的表达，及肿瘤标本凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase3基因的表达。结果与结论：第3周时肿瘤的质量抑制率效果最好，随着时间的延长，肿瘤的抑制率逐渐下降。肝癌转移相关的生物学指标均呈逐渐下降趋势，代表肿瘤凋亡指标的因子呈两极分化表现，抗凋亡bcl-2因子呈逐渐下降的趋势，凋亡因子bax、caspase3呈逐渐升高的趋势。骨髓间充质干细胞对肝癌动物模型肿瘤抑制效能随时间而变化，骨髓间充质干细胞移植后第3周对肝癌抑制效果最显著，随着时间的延长，抑制效能减弱。骨髓间充质干细胞对肝癌的转移潜能具有抑制作用。Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for high-metastatic potential hepatocellular carcinoma Li Tian-ran1, Du Xiang-ke2, Song Bin1, Wei Zheng-mao2, Huo Tian-long2 (1Department of Radiology, First Affiliated Hospital, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Putian 351100, Fujian Province, China; 2Department of Radiology, Peking University Peoples Hospital, Beijing 100044, China)李天然，男，1970年生，黑龙江省富锦市人，汉族，2009年解放军医学院毕业，博士，2012年北京大学医学部博士后，副主任医师，主要从事肝癌分子影像学研究。lizhaoruixin 中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)49-08498-07修回日期：2013-09-10(201302047/DW)Li Tian-ran, M.D., Associate chief physician, Department of Radiology, First Affiliated Hospital, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Putian 351100, Fujian Province, Chinalizhaoruixin Accepted: 2013-09-10AbstractBACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have the chemotaxis and homing role that promotes immune system reconstruction, eliminate residual lesions and prevent recurrence in patients.OBJECTIVE: To observe therapeutic effect of human bone marrow mesenchymal stem cells transplantation into high-metastatic potential hepatocellular carcinoma animal models on metastatic potential of high-metastatic potential hepatocellular carcinoma. METHODS: Nude mouse models of high-metastatic potential hepatocellular carcinoma were established in vivo. In the experimental group, 5105 cells were injected via the tail vein on day 7 after tumor inoculation, twice a week. In the control group, cell culture medium, 0.2 mL per mouse, was injected by the tail vein. After the start of the experiment, tumor volume was measured every 4 days. After tumor inoculation for 14 days, 21 days, 28 days, 35 days, 42 days, animal models were sacrificed, and then tumor mass and body mass were recorded to calculate the inhibition rate. PCR was employed to detect osteopontin, bone sialoprotein, and integrin mRNA3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083expression, as well as bcl-2, bax, caspase3 mRNA expression.RESULTS AND CONCLUSION: The inhibition rate of tumor mass showed the best results in week 3. As time went on, the tumor inhibition rate was gradually decreased. Metastasis-related biological factors showed a gradual down-regulated trend, indicating the polarization of tumor apoptotic indexes, that is, anti-apoptotic factor, bcl-2, showed a decreasing trend, while apoptotic factors, bax and caspase3, appeared to have a gradually increased trend. These findings suggest that human bone marrow mesenchymal stem cells effects to inhibit high-metastatic potential hepatocellular carcinoma animal models appear to vary with time. After human bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for 3 weeks, the inhibition performance on high-metastatic potential hepatocellular carcinoma is the best, and then it weakens with time. Human bone marrow mesenchymal stem cells are found to inhibit the metastatic potential of hepatocellular carcinoma.Subject headings: stem cells; tumor; mesenchymal stem cells; bone morrow; liver neoplasms; models, animalFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81271607*; Postdoctoral Foundation, No. 20100470172*Li TR, Du XK, Song B, Wei ZM, Huo TL. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for high-metastatic potential hepatocellular carcinoma. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(49):8498-8504.8503ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，居中国癌症死亡的第2位，转移复发已成为进一步延长肝癌患者生存期、提高远期疗效的瓶颈问题，也是最终攻克肝癌的关键。手术切除目前仍是治疗的最有效手段，但术后复发转移率高居不下，即使临床上公认预后较好的小肝癌，其5年术后复发率也达到了40%-50%1。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，研究发现，骨髓干细胞是肝干细胞主要的肝外来源2-4，所以提取患者的骨髓干细胞移植到患者的肝脏组织中，特定环境下可分化为肝组织和干细胞从而参加肝脏的修复与重建。骨髓间充质干细胞与肝脏组织中的多种细胞成分关系密切，可向肝脏内的卵圆细胞，成纤维细胞，肌成纤维细胞分化，具有修复受损肝脏组织的作用5。通过对接受自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化，证实干细胞移植是一种有效的新方法6。骨髓间充质干细胞具备化学趋向性和归巢作用，对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及防止复发转移具有良好的效果7。干细胞治疗肝癌用于临床中日益显现出无毒、有效的优势，具备化学趋向性和归巢作用，对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及防止复发转移具有良好的效果8。肝癌的转移特性是影响预后的关键因素，观察骨髓间充质干细胞对肝癌转移行为的影响情况，对于提高肝癌患者的生存期具有重要的意义。在小鼠实验中，干细胞移植对肝癌根治性切除术后的复发和转移显示出一定的抑制作用，并且随着人源细胞嵌合率的增加，抗肿瘤效应也相应得到提高9。实验将骨髓间充质干细胞移植入具有高转移潜能动物模型中，观察骨髓间充质干细胞对高转移潜能肝癌组织的影响。1 材料和方法 Materials and methods设计：动物实验，造模观察。时间及地点：于2010年5月至2012年5月在北京大学人民医院妇科重点实验室完成。材料：实验动物：健康24只Balb/c裸鼠，14-17 g，SPF级，6周龄，雌雄各半，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK(京) 2009-0017。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。实验用细胞株：人骨髓间充质干细胞，由赛业(广州)生物科技有限公司提供；人高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-H)，由上海复旦大学肝癌研究所提供。实验试剂、仪器与设备：无菌0.9%氯化钠，无水乙醇，注射器，医用净化工作台，多用可调照明放大镜，奥豪斯电子精密天平，电子数显卡尺，日本TE2000 NIKON倒置显微镜，均购于北京科普尔科技发展有限公司。方法：高转移潜能肝癌动物实验模型的制作：取正常传代培养的高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-H)，按常规制成单细胞悬液(细胞浓度为2108 L-1)，无菌条件下取0.8 mL细胞悬浊液，接种于裸鼠上下肢腋部皮下。分组及干预：将动物随机分为骨髓间充质干细胞组和对照组，每组12只，称体质量标号。骨髓间充质干细胞组在接种肿瘤后第7日开始尾静脉注射骨髓间充质干细胞5105/次，1周2次，连续6周。对照组相同时间和频率尾静脉注射骨髓间充质干细胞培养液0.2 mL/次。实验开始后每4 d用卡尺测一次皮下肿瘤体积，于肿瘤接种后分为14 d(2周)、21 d(3周)、27 d(4周)、37 d(5周)、41 d(6周)处死动物，剖取瘤块并称瘤质量和体质量，计算肿瘤质量抑制率。骨髓间充质干细胞干预效果判定标准：Q-Real time-PCR检测高转移肝癌动物模型标本骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素5亚单位基因和bcl-2、bax、caspase3基因的表达检测。引物设计序列：引物序列来自GenBank数据库，由赛业(广州)生物科技公司合成。以人肌动蛋白-Actin作为内参照物(Internal control)：Forward primer：5 GCA GAA GGA GAT CAC AGC CCT 3Reverse primer：5GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA 3人骨桥蛋白(osteopontin，OPN)：Forward primer：5TCA CCA GTC TGA TGA GTC TCA C 3Reverse primer：5CAG GTC TGC GAA ACT TCT TAG AT 3人骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)：Forward primer：5GAA TGG CCT GTG CTT TCT CAA 3Reverse primer：5TCG GAT GAG TCA CTA CTG CCC 3整合素5亚单位(integrin 5 subunit，alpha-V)：Forward primer：5CCT CAG ACG CTG CGT GGA GC 3Reverse primer：5AGG GCT GAG CTT CGG AGC GA 3bcl-2抗凋亡基因：Sense primer: 5- ATC CAG GAT AAC GGA GGC -3Antisense primer: 5- CAG CCA GGA GAA ATC AAA C -3bcl-2相关X蛋白(bax)基因：Sense primer: 5- GAC CCG GTG CCT CAG GAT GC -3Antisense primer: 5- GTC TGT GTC CAC GGC GGC AA -3半胱天冬酶3(caspase3)：Sense primer: 5- CAT GGA AGC GAA TCA ATG GAC T -3Antisense primer: 5- CTG TAC CAG ACC GAG ATG TCA -3步骤包括：肿瘤标本RNA提取应用，RevertAid M-MLV RT反应系统和Oligo(dT)合成cDNA，然后经特异性引物聚合酶链反应(PCR)扩增相应的cDNA。PCR条件：预变性95 ，5 min；变性94 ，30 s，退火58 ，30 s，延伸72 ，30 s，共30个循环，最后72 ，10 min。PCR产物电泳并经凝胶电泳处理系统扫描半定量分析。 主要观察指标：肿瘤质量抑制率、动物模型标本转移相关因子骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素基因的表达，及肿瘤标本凋亡相关因子bcl-2、bax、caspase3基因的表达。统计学分析：数据采用SPSS16.0统计软件处理，实验结果采用t 检验进行分析，以=0.05为检验水准。 2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 纳入Balb/c裸鼠24只，均分为骨髓间充质干细胞组和对照组进行实验观察，造模过程中未出现动物死亡，按照实验观察时间点处死动物，均进入结果分析。2.2 骨髓间充质干细胞对人高转移肝癌细胞(MHCC97-H)裸鼠移植瘤作用 根据体外标本肿瘤组织质量计算骨髓间充质干细胞干预后的肿瘤质量抑制率，第2周抑制率为26.62%，第3周抑制率为52.00%；第4周抑制率为38.20%，第5周抑制率为31.98%；第6周抑制率为30.23%。见图1。肿瘤质量抑制率(%)555045403530252 3 4 5 6t/周注：第3周时肿瘤的抑制率效果最好，随着时间的延长，肿瘤的质量抑制率逐渐下降。图1 连续注射骨髓间充质干细胞干预MHCC97-H肿瘤模型后不同时间肿瘤质量抑制率变化曲线Figure 1 Inhibition rate of tumor mass with time in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells2.3 Real time-PCR检测结果 高转移肝癌动物模型(MHCC97-H)骨髓间充质干细胞干预前后肿瘤标本骨桥蛋白、骨唾液蛋白、整合素a及干预后抗凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax、caspase3基因的表达检测结果，见图2-7。2-CT14121086420干预前干预后2 3 4 5 t/周注：骨髓间充质干细胞干预后骨桥蛋白表达明显下降，且随着时间延长进一步降低，5周时有所上升。图2 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本骨桥蛋白表达情况Figure 2 Osteopontin gene expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells2.4 骨髓间充质干细胞干预后MHCC97-H动物模型转移相关因子与凋亡基因表达的相关性分析骨唾液蛋白、整合素表达与抗凋亡因子bcl-2呈明显正相关(P 0.05)，与促凋亡因子bax、caspase3呈明显负相关(P 0.05)。见图10。结果表明，经骨髓间充质干细胞干预后，肿瘤转移与凋亡存在一定的相关性。141210864202-CT干预前干预后2 3 4 5 t/周注：骨髓间充质干细胞干预后骨唾液蛋白基因表达明显下降，且随着时间延长进一步降低。图3 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本骨唾液蛋白基因表达情况Figure 3 Sialoprotein gene expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells2-CT14121086420干预前干预后2 3 4 5 注：骨髓间充质干细胞干预后整合素基因表达明显下降，且随着时间延长进一步降低。t/周图4 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本整合素基因表达情况Figure 4 Integrin gene expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells2.5 骨髓间充质干细胞干预后MHCC97-H动物模型凋亡基因与肿瘤抑制率表达的相关性分析 肿瘤质量抑制率与抗凋亡因子bcl-2、促凋亡因子bax、caspase3因子无明显相关性(P 0.05)，与转移相关因子骨桥蛋白基因表达呈明显正相关(P 0.05)，见图11，12。结果表明，骨髓间充质干细胞对肿瘤抑制作用与肿瘤转移潜能的变化存在一定的相关性。1.21.00.80.60.40.202-CT干预前 2 3 4 5 t(干预后)/周注：骨髓间充质干细胞干预后，bcl-2抗凋亡基因表达明显呈下降趋势。图5 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本bcl-2基因表达情况Figure 5 bcl-2 expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells2-CT图6 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本bax基因表达情况Figure 6 bax expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells4.03.53.02.52.01.51.00.50干预前 2 3 4 5 t(干预后)周注：骨髓间充质干细胞干预后，bax凋亡基因表达明显呈上升趋势。2-CT543210注：骨髓间充质干细胞干预后，caspase3凋亡基因表达明显呈上升趋势。图7 骨髓间充质干细胞干预前后MHCC97-H动物模型肿瘤标本caspase3基因表达情况Figure 7 caspase3 expression in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells干预前 2 3 4 5 t(干预后)/周543210bax r=-0.803，P=0.016图8 骨髓间充质干细胞干预后MHCC97-H动物模型转移相关因子整合素与凋亡因子相关性分析Figure 8 Correlation analysis between integrin and apoptotic factors in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells凋亡因子Caspase3 r=-0.902，P=0.001bcl-2 r=0.908，P=0.002整合素1 2 3 4 5 6注：与抗凋亡因子bcl-2呈明显正相关(P 0.05)，与促凋亡因子bax、caspase3呈明显负相关(P 0.05)。543210bax r=-0.779，P=0.0231 2 3 4 图9 骨髓间充质干细胞干预后MHCC97-H动物模型转移相关因子骨唾液与凋亡因子相关性分析Figure 9 Correlation analysis between sialoprotein and apoptotic factors in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cellsCaspase3 r=-0.910，P=0.002bcl-2 r=0.890，P=0.003凋亡因子骨唾液蛋白注：与抗凋亡因子bcl-2呈明显正相关(P 0.05)，与促凋亡因子bax、caspase3呈明显负相关(P 0.05)。骨桥蛋白凋亡因子54321025 30 35 40 45 50 55caspase3 r=-0.144，P=0.733bax r=-0.087，P=0.838bcl-2 r=-0.095，P=0.824凋亡因子肿瘤抑制率注：无明显相关性(P 0.05)。图11 骨髓间充质干细胞干预后MHCC97-H动物模型肿瘤抑制率与抗凋亡因子bcl-2、促凋亡因子bax、caspase3因子相关性分析Figure 11 Correlation analysis of tumor inhibition rate and apoptosis factors and anti-apoptotic factors in MHCC97-H animal models undergoing continuous injection of bone marrow mesenchymal stem cells整合素 r=-0.411，P=0.312骨桥蛋白 r=-0.521，P=0.18525 30 35 40 45 50 55 骨唾液酸蛋白 r=-0.7