红葱黄酮、红葱甲素提取与测定.doc

黄酮提取方法：
1材料与方法
1.1材料①红葱。②试剂：95%乙醇；甲醇CP；三氯化铝CP；盐酸CP；氨水CP；正丁醇CP；冰乙酸CP；乙醇乙酯CP；芦丁对照品（中国生物制品检定所）。③仪器设备：紫外线分光光度计；DZF-150小型真空恒温干燥箱；离心机；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程洋葱中总黄酮提取工艺流程。
新鲜红葱-----去皮------清洗-----加水打浆------浸提-----四层纱布过滤-----真空抽虑-----黄酮提取物-------大孔吸附树脂吸附------解析-----旋转蒸发----冷冻干燥---总黄酮。（该方法为大量、高精度提取方法）
1.2.2 操作步骤
新鲜红葱，切碎，烘干，取50 g，置于大的烧杯中，加蒸馏水煮沸3 h。冷却后进行粗滤，对滤渣用上述方法进行再浸取2次，将3次滤液合并，滤液用高速离心机分离 15 min，1 500 r/min。并进行加热浓缩（加热温度在85℃左右）。浓缩冷却后加入等体积95%乙醇，放入冰箱内2 h。用高速离心机进行分离15 min，1 500 r/min。过滤得滤液滤渣，弃去滤渣。对滤液进行蒸发浓缩（加热温度在85℃左右）。待乙醇蒸发完后，将浓液置于真空干燥箱中干燥成疏松固体，粉碎得终产物。（实验室少量提取法）
1.3 总黄酮的含量测定
1.3.1 标准曲线的制备：
1.3.1.1芦丁对照品溶液的制备：精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品10mg，加80%乙醇置水浴加热溶解，冷却，定容至25mL容量瓶中，即为0.4mg/mL的芦丁对照品溶液，摇匀，备用。
1.3.1.2最大吸收波长的选择：精密吸取0.4mg的芦丁对照品溶液lmL置于25mL的容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.75mL，放置6min后，加10%硝酸铝0.75mL，放置6min，再加4%的氢氧化钠10mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15min，以空白试剂作对照，用紫外分光光度计进行全波长扫描，确定最大吸收波长。
1.3.1.3芦丁标准工作曲线的绘制：精密吸取标准品溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.75mL，放置6min后，加10%硝酸铝0.75mL，放置6min，再加4%的氢氧化钠10mL，加水至刻度，摇匀，放置15min。以第一管为空白。，在最大吸收波长处测定吸光度值，以吸光度值为横坐标，芦丁对照品溶液浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 提取物含量的测定：精密称定提取物1.5g，置索氏提取器中，加95%乙醇回流至无色（6～8 h），将提取液置于烧杯中，沸水浴加热浓缩至干，再用热水洗涤3次，将洗液移至分液漏斗中，并加无水正丁醇液萃取3~5次，10 mL/次。合并萃取液于烧杯中，沸水浴蒸干，再加95%乙醇使其溶解，并移于50 ml容量瓶中，再加95%乙醇至刻度，摇匀。精密量取10 ml于50 ml容量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀，按标准曲线的制备操作测定吸光度。
1.3.3 红葱黄酮的定性检测：①紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。②浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。③三氯化铝反应：取样品溶液10 μl点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。 ④乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。⑤盐酸镁粉反应：取乙醇提取液1 ml于试管中加镁粉，再加入浓的盐酸数滴（1次加入），在泡沫处呈紫红色。

红葱甲素方法
1 材料与试剂
1.1材料：新鲜红葱(60℃以下烘干3～5h，粉碎，粒度≤1mm)
1.2试剂：红葱甲素标准品 ；甲醇；四氯化碳；氯仿；石油醚；3，5-二硝基苯；甲酸；氢氧化钾；所用试剂都为分析纯。
柱层析硅胶 (100~200目)、(200~300目)、薄层层析硅胶板GF254( 20×20cm)。
Kedde’s 试剂的配制：
A：1%3 ，5 - 二硝基苯甲酸的甲醇溶液
B：10% 氢氧化钾甲醇溶液
按A:B ＝3:1 现用现配，喷雾使用。
1.3仪器： 三用紫外分析仪，HP1100 高效液相色谱仪。
2 试验方法
2.1 红葱甲素高含量粗提物的制备方法
2.1.1 浸提溶剂的选择(选择最优的浸提剂）
取新鲜红葱15g 加入圆底烧瓶中，分别用溶剂 (50% 甲醇、70% 甲醇、甲醇、95% 乙醇、水)浸泡回流提取 (60ml × 3，5h)，过滤，合并滤液，浓缩得到醇浸膏，加入等量的水，混合成悬浮液，再用氯仿30mL×3 萃取，合并氯仿液，用无水硫酸钠干燥后浓缩，得氯仿浸膏A1~A5。氯仿浸膏直接用甲醇∶水＝80∶20的混合溶剂定容至10mL，用高效液相色谱分析含量。
2.1.2 萃取溶剂的选择(选择最优的萃取剂）
取新鲜红葱600g 加入3L 圆底烧瓶中，加入石油醚浸泡回流提取 (1800mL× 3，5h)，然后用 70% 甲醇浸泡回流提取 (2500mL×3，5h)，过滤，合并提取液，浓缩至无溶剂馏分，用少量的甲醇转移出浸膏，加入等量的水，成悬浮状液体，等分为6 组，其中一组直接用氯仿萃取3 次 (20mL ×3)，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到氯仿浸膏 B1，作为对照；另外5 组分别用等量的四氯化碳、四氯化碳/石油醚＝80/20 (v/v)、四氯化碳/石油醚＝ 60/40 (v/v)，四氯化碳/石油醚＝40/60 (v/v)，四氯化碳/石油醚＝20/80 (v/v)5种溶剂系统各萃取 3次 (20ml ×3)，萃取后的甲醇 / 水悬浮液再用氯仿萃取 3 次 (20ml × 3)，干燥浓缩后，得到氯仿浸膏 B2~ B5。用高效液相色谱法分析含量.

2.2 红葱甲素高含量粗提物的制备------验证试验
300g 红葱置于3L 烧瓶内，加入石油醚回流提取(900ml ×3，6h)，再加入70% 甲醇回流提取(1800mL ×3，6h)。合并甲醇浸提液，旋转蒸发器中40℃真空浓缩。得到浓缩产物溶于 100mL甲醇，加入等量蒸馏水。用四氯化碳萃取3 次 (60mL×3)，合并四氯化碳液；甲醇/水悬浮液再用氯仿萃取3次 (80mL×3) ；合并的四氯化碳萃取液用甲醇/水＝50/50 反萃取3 次(60mL×3)，合并，甲醇/水萃取液再用氯仿萃取3次 (60ml×3)，合并氯仿萃取液，用无水硫酸钠干燥后浓缩，得到棕色粘稠状液体为氯仿浸膏。
2.3 分离纯化
浸膏与柱层析硅胶混合，添加乙醇使其充分混匀，晾干成粉状。用4倍量200～300目柱层析硅胶装柱，石油醚丙酮梯度洗脱，红葱甲素粗品约在体积分数为40％丙酮洗脱液中出现。将粗品再次拌硅胶上柱分离，以乙酸乙酯：乙醇=10：1洗脱，得到红葱甲素精制品。4℃保存备用。
2.4 红葱甲素检测方法建立
用电子天平精密称取红葱甲素对照品5 mg左右，定量配制成1 g/L溶液，等比稀释成100、10、1、0.1的溶液，进样20，测定峰面积。将峰面积积分值取常用对数作纵坐标，进样质量值取常用对数作横坐标，制作标准曲线。
2.5红葱粗提物中红葱甲素含量分析
用高效液相色谱法梯度洗脱条件检测，称取氯仿浸膏200mg左右 (精确至0.0001g)，加入10ml容量瓶中，用甲醇/水＝80/20 定容，超声振荡溶解 10min 以上，离心后10ml 进样。色谱条件：色谱柱：C18 250mm×4.6mm，内径5mm；柱温：室温；紫外检测器：0.04mV；检测波长：218nm；流速：0.8ml/min；流动相：梯度洗脱条件见表1。

根据标样的保留时间进行定性，按峰面积计算组分的相对含量。进样体积：10ml 保留时间：8.55min。
红葱乙素提取
红葱乙素提取方法参考山鬼中延胡索乙素提取方法；也可参考：山乌龟中延胡索乙素的提取和含量测定.巫玲玲 蒋伟哲 黄兴振 施晓霞 吕聪 许崇摇 邱卓.广西医学。2011,109~112
黄酮、红葱甲素和红葱乙素体外抑菌试验
1试验材料、仪器与试剂
1.1试验材料
实验提取的黄酮、红葱甲素和红葱乙素浓缩并冷冻干燥,密封备用。
使用菌株：大肠杆菌(Escherichia.coli)；霉菌（molds）；黄瓜枯死病菌
1.2仪器和试剂
电热恒温培养箱；恒温培养振荡器；高压蒸汽灭菌锅；精密电子天平；直尺；琼脂粉；蔗糖；酵母粉；氯化钠；培养皿；试管；蛋白胨；滤纸片；纱布；马铃薯；三角瓶；烧杯；量筒；容量瓶；牛皮纸
2试验方法
2.1试验菌株的选择
大肠杆菌(Escherichia.coli)；霉菌（molds）；黄瓜枯死病菌
2.2PDA(马铃薯葡萄糖培养基)的制备
黄瓜枯死病菌和霉菌培养基（PDA）配方：称取去皮马铃薯20g/L，葡萄糖2g/L，琼脂2g/L，将马铃薯切成小块，放入锅中，加水500mL，煮沸30min。用纱布滤去马铃薯残渣。将滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化，用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦加入葡萄糖。待其溶解后。加入适量的水并定容至500mL将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。注意其量为试管高的1/5。灭菌后制成斜面或者三角瓶则不超过1/2三角瓶容积。在管口或瓶口塞上棉塞以便过滤空气。防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发。将试管用线绳和牛皮纸包扎好。置于高压蒸汽灭菌锅0.103MPa，121℃，灭菌20min。待试管培养基冷至50℃左右搁置斜面，斜面长度应不超过试管总长的一半，37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。
大肠杆菌培养基：LB培养基，其配方：蛋白胨10g/L 酵母粉5g/L 氯化钠10g/L琼脂粉7.5g/L，pH值7.0。置于高压蒸汽灭菌锅0.103MPa，121℃，灭菌20min。
(注：液体培养基不加琼脂粉）
2.3试验器皿的准备
抗菌试验的步骤需用无菌操作，应用的试管平皿吸管等与细菌接触的器皿均
需经过高压灭菌后应用。
2.4菌种活化
将菌种在平板或者斜面上传代三次，37℃培养24h，得到长势良好的菌种。
2.5菌悬液的制备
无菌条件下，用接种环从斜面上挑菌到10mL无菌生理盐水中（作对照）再用接种环从斜面上挑菌到培养基中，37℃培养至菌悬液所含活菌量在1×107~1×108CFU/mL，OD值0.6左右。
2.6各药液的制备及处理
为保证不混入杂菌，需对各药液及药瓶高压蒸汽灭菌，对于不耐高温的药品进行过滤膜除菌。
2.7滤纸片的制备及处理
用打孔器将滤纸打孔，得直径为6mm圆形滤纸片，置于三角瓶中，塞上棉塞，灭菌后浸泡于各药液中，2h后用无菌镊子夹出，在瓶口沥去多余药液，即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置，按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。
2.8摇合法接种培养
吸取适量的菌悬液至无菌培养皿中，倒入冷却至40℃左右的培养基，盖好后在无菌台上轻轻摇匀，顺时针3次，逆时针3次。之后静置待冷却凝固，贴入滤纸片，37℃倒置培养24h以上，观察有无抑菌圈，用卡尺测量抑菌圈直径。
2.9供试菌种最低抑菌浓度(MIC)的测定（药品浓度梯度设计）
取6支试管分别加入2mL液体培养基，加2mL药液于第1支试管中，混匀
后取出，2mL加入第2支试管中，然后依次取出2mL移入下一管，到第6管时弃去2mL。再在这6支试管中分别加入0.1mL培养好的菌液。另取第7支试管不加菌作为空白对照。37e℃恒温培养24h，观察记录澄清不长细菌的最高稀释度即最低药物浓度为最低抑菌浓度(Mlc)环。