药物中间体(S)-3-氯-1-苯丙醇的生物合成.doc

抗抑郁药（R）-托莫西汀重要中间体(S)-3-氯-1-苯丙醇的生物合成
浙江大学药学院 杭虎
【摘要】研究了微生物法制备光学纯(S)-3-氯-1-苯丙醇，对实验室已有菌种进行了筛选，已选育了一株还原能力好的B5#菌种。对其还原反应的条件包括温度，底物浓度，菌种量和反应时间的影响进行了考察。最后反应的转化率达到99.8%，对映体过剩值达到100%ee
【关键词】3-氯-1-苯丙酮，(S)-3-氯-1-苯丙醇，B5#菌，不对称还原
1. 前 言
随着抑郁症困扰着越来越多的现代人，抗抑郁药物的合成业越来越受到人们的重视。3-氯-1-苯丙醇，特别是(S)-3-氯-1-苯丙醇是合成托莫西汀、氟西汀、尼索西汀等抗抑郁药物的重要中间体。目前，在国内尚无厂家能够提供3-氯-1-苯丙醇成品，可见，在以3-氯-1-苯丙酮为起始原料合成托莫西汀、氟西汀和尼索西汀合成路线中， 3-氯-1-苯丙酮还原成为3-氯-1-苯丙醇是非常重要的一步。拆分外消旋体3-氯-1-苯丙醇，可以获得(S)-3-氯-1-苯丙醇，但是拆分效率最大只有45%，生产效率不高。以3-氯-1-苯丙酮为底物采用化学法和微生物法不对称还原底物中的羰基均可以得到(S)-3-氯-1-苯丙醇。化学法不对称还原需要制备手性化学催化剂，价格昂贵，制备过程繁琐。采用微生物法不对称还原乙酰乙酸叔丁酯可以获得对映体过剩值较高的光学纯(S)-3-氯-1-苯丙醇，反应条件温和，环境友好，成本低廉，易于实现辅酶的原位再生，微生物易于大规模培养，易于工业化生产，是(S)-3-氯-1-苯丙醇的绿色合成工艺。
本文主要研究了微生物法制备光学纯(S)-3-氯-1-苯丙醇，对其还原反应的条件包括温度，底物浓度，菌种量和反应时间的影响进行了考察。最后反应的转化率达到99.8%，(S)-3-氯-1-苯丙醇对映体过剩值达到100%ee
2. 材料和方法
2.1实验材料
2.1.1菌株
实验室现有的21种菌种，分别是B1#, B2#, B3#, B4#, B5#, B6#, B7#, B8#, B9#, B10#, B11#, B12#, B13#, B14#, B15#, B16#, B17#, B18#, B19#，B20#, B21#。
2.1.2培养基
斜面培养基：每升含麦芽汁10 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，pH自然。
液体培养基：每升含葡萄糖30 g，酵母粉3 g，硫酸铵5 g，MgSO4 •7 H2O 0.25 g， K2HPO3•3 H2O 1 g，KH2 PO3 1 g，pH自然。
2.1.3.试剂与仪器
3-氯-1-苯丙酮购自公司，外消旋的3-氯-1-苯丙醇采用硼氢化钠还原3-氯-1-苯丙酮制得液相色谱仪为：安捷伦1200，安捷伦科技有限公司。手性柱色谱柱为：Daicel OD-H，Daicel 公司。
2.2实验方法
2.2.1菌体培养
从斜面挑取一环菌体接种于100 ml液体种子培养基中，置于30℃摇床(200
r/min)中培养24h得到种子液；以10％的接种量将菌体接种到100 ml液体发酵
培养基中，置于摇床中培养24 h后用于生物转化。
2.2.2转化反应
将2.2.1中获得的菌液离心分离，倾去上层清液，沉淀用去离子水洗涤两次，将菌体分散在20 ml水中，加入一定量的底物，放入30℃，200 r/min的摇床中转化36h。
2.2.3标准品制备
实验方案：用硼氢化钠在无水乙醇中还原3-氯-1-苯丙酮，反应温度在5-10℃，需要进行4个小时。然后在用乙酸中和，抽滤除去盐分，再减压浓缩，用乙醚抽提，再用无水硫酸镁干燥后转入三口烧瓶中，减压浓缩，收集馏分。
2.2.4分析方法
转化反应结束后，转化液用等体积的乙酸乙酯萃取后离心分离，采用安捷伦1200液相色谱检测乙酸乙酯萃取液中底物和两种构型产物的含量。色谱柱为手性柱DaicelOD-H(0.46m×25 cm)；流动相：正己烷/异丙醇(95/5，V/V)；紫外检测波长：240 nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/mim；进样量：5μl

2.2.5 数据处理方法
产物对映体过剩值的计算：

式中，CR：R型产物的浓度；CS：S型产物的浓度
摩尔转化率的计算：

式中，Ms：底物的分子量：Mp：产物的分子量；q：反应初始时底物的质量；P：反应结束时产物的质量。
3结果和讨论
3.1检测方法的建立
分别对底物标准品以及产物的标准品进行检测，得到了如下的结果。
3.1.1底物标准品的检测

图3.1 底物标准品液相色谱图
如图3.1所示，3.837min为溶剂乙酸乙酯峰，7.462min为底物3-氯-1-苯丙酮峰，其余为杂峰，分析得 可能为乙酸乙酯中的一些杂质。
3.1.2产物标准品的检测

图3.2 产物标准品液相色谱图
如图3.2所示，3，843min为溶剂乙酸乙酯峰，7.822min为底物3-氯-1-苯丙酮峰，10.626min为(R)-3-氯-l-苯丙醇峰，12.001min为(S)-3-氯-l-苯丙醇峰，其余为杂峰。由此可见，用化学合成的方法还原3-氯-l-苯丙酮存在着如下的几个问题：产物为消旋品，不能得到单一构型的某一种产物。反应不彻底，底物未完全转化。杂峰很多说明化学发法副产物较多，得到的成品不纯。
3.2菌种的筛选
将培养好的21种酵母细胞分别用于还原3-氯-l-苯丙酮的反应。将2.8g酵母细胞分散在20 ml水中，底物3-氯-l-苯丙酮的初始浓度为0.04g/ml，置于30℃，200 r/min的摇床中反应36h。反应结束后用适量的乙酸乙酯萃取底物和产物，用高效液相色谱检测含量。
菌种
构型
转化率( % )
ee值( % )
B1
S
50.15
24.02
B2
S
65.75
35.75
B3
R
80.28
40.28
B4
S
25.03
25.03
B5
S
74.54
100
B6
R
22.90
22.90
B7
R
33.76
33.76
B8
S
32.56
28.91
B9
R
16.78
63.13
B10
S
54.30
10.58
B11
R
13.09
56.42
B12
S
17.97
70.47
B13
S
40.44
48.24
B14
R
26.89
67.90
B15
S
13.97
75.08
B16
S
34.83
72.80
B17
S
21.91
21.91
B18
R
36.51
36.51
B19
S
22.80
22.80
B20
S
29.27
29.27
B21
S
14.54
10.55
由于酵母细胞中分别将底物还原成R型和S型产物的酶含量不同，所得产物的构型、转化率和对映体过剩值也不同。结果表明，B5#还原底物得到的S构型的产物对映体过剩值最高，且还原转化率较高。
3.3底物浓度对转化反应的影响
由于受反应体积和微生物本身酶量的限制，不同的第五浓度对反应的转化率及对映体过剩值都会有一定的影响，因此本实验考察了底物浓度对转化反应的影响。分别取培养好的B5#湿菌体洗涤后分散在20mL水中，生物量为0.14g/mL。5瓶反应体系中底物浓度分别为0.010g/mL、0.015g/mL、0.020g/mL、0.025g/mL、0.030g/mL，置于30℃，200 r/min的摇床中反应36h，结果如表所示
底物浓度( g/mL )
转化率( % )
ee值( % )
0.010
75.6
100
0.015
79.5
100
0.020
53.1
98.5
0.025
47.2
98.1
0.030
35.4
97.8
由表可见，反应的转化率随底物浓度的增加而迅速下降，转化率不高的原因可能是由于底物浓度过高对微生物存在毒害作用，对羰基还原酶的活力存在抑制作用。
3.4时间对转化反应的影响
分别取培养好的B5#菌体洗涤后分散在20ml水中，生物量为0.14g/mL。5瓶反应体系中底物浓度为0.015g/mL，置于30℃，200 r/min的摇床中分别反应12h，24h，36h，48h，60h，HPLC检测转化率及对映体过剩值，结果如下表：
反应时间( h )
转化率( % )
ee值( % )
12
20.1
97.3
24
50.9
99.3
36
78.7
100
48
72.4
100
60
69.8
100
反应36h时，转化率已接近最大值，继续延长反应时间，转化率没有大的变化，其原因可能是一定量的产物对还原过程存在抑制作用。根据以上实验数据，可以确定最适反应时间为36h。产物(R)-3-氯-l-苯丙醇的对映体过剩值随反应时间的变化不大，均为接近100％ee。
3.5温度对转化反应的影响
本实验考察了温度对转化反应的影响。分别取培养好的B5#湿菌体洗涤后分散在20ml水中，生物量为0.14g/mL。5瓶反应体系中底物浓度为0.015/mL，置于200 r/min的摇床中反应36h，温度分别控制为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，HPLC检测转化率及对映体过剩值，结果如下表：
温度对转化反应的影响
反应温度( ℃ )
转化率( % )
ee值( % )
20
40.1
100
25
60.9
100
30
77.3
100
35
29.8
100
40
5.8
100
当转化温度升高到35℃时转化率明显下降，其主要原因是较高的温度可使羰基还原酶失活速率加快，由此得出反应的最适温度为30℃。在实验的各种温度条件下产物的对映体过剩值均为100％ee。
3.6辅助底物对转化反应的影响
微生物法还原都需要辅酶(coenzymes or cofacters)的参与，以进行化学当量的还原或氧化，可逆地催化还原酮(或醛)羰基。大多数的氧化还原所需的辅酶是NADH(辅酶I)或NADPH(辅酶II)。由于酶催化的氧化还原反应需要价格昂贵的辅酶，往往需要高代价使其再生循环，这样利用全细胞进行反应显得更加方便实用。微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、所有必需的辅酶和再生途径，这样辅酶循环可由细胞自动完成。进行不对称还原反应时也可以加入少量廉价的碳源(如蔗糖和葡萄糖)作为辅助底物实现辅酶的再生。由于辅酶在生物转化的过程中其着十分重要的作用，因此，本实验考察了两种辅酶对转化反应的影响。
3.6.1葡萄糖对转化反应的影响
分别取培养好的B5#湿菌体洗涤后分散在20mL水中，生物量为0.14g/mL。5瓶反应体系中底物浓度为0.015/mL，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h，葡萄糖浓度分别控制为0.02 g/mL，0.04 g/mL，0.06 g/mL，0.08 g/mL，0.10 g/mL，HPLC检测转化率及对映体过剩值，结果如表
葡萄糖对转化反应的影响
葡萄糖浓度( g/mL )
转化率( % )
ee值( % )
0.02
92.0
100
0.04
95.9
100
0.06
94.3
100
0.08
90.7
100
0.10
88.9
100
加入葡萄糖对反应的转化率有明显的提高，考察葡萄糖添加量可得，当葡萄糖浓度为0.04g/mL时，转化率最高。在实验的各种温度条件下产物的对映体过剩值均为100％ee。3.6.2乙醇对转化反应的影响
分别取培养好的B5#湿菌体洗涤后分散在20mL水中，生物量为0.14g/mL。5瓶反应体系中底物浓度为0.040/mL，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h，乙醇的体积分数分别控制为2.50%，5.00%，7.50%，10.0%，12.50%，，HPLC检测转化率及对映体过剩值，结果如表:
乙醇对转化反应的影响
乙醇体积分数( % )
转化率( % )
ee值( % )
2.50
94.7
100
5.00
99.8
100
7.50
93.6
100
10.0
93.0
100
12.5
92.6
100

加入乙醇对反应的转化率有明显的提高，考察乙醇添加量可得，当乙醇体积分数为5%时，转化率最高。在实验的各种温度条件下产物的对映体过剩值均为100％ee。
比较葡萄糖与乙醇对转化反应的影响来看，两者都对反应的转化率有明显的高且产物的对映体过剩值均为100%。但是比较而言，一醇对反应转化率提高的更加明显，其原因可能为乙醇不仅起着辅酶再生的作用，而且对于底物有一定的溶解作用，使其转化率提高较多。 3.7产品的分离纯化
从微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品中含有发酵过程中产生的杂质以及没有反应完全的底物，需要对其进行分离纯化。以酵母B5#还原3-氯-l-苯丙酮得到(S)-3-氯-l-苯丙醇的转化液为原料，采用有机溶剂萃取和硅胶柱层析相结合的方法分离纯化(S-3-氯-l-苯丙醇。
小 结
本研究以3-氯-l-苯丙酮为底物，用微生物转化法不对称还原底物制备了(S)-3-氯-l-苯丙醇，通过对实验室保藏菌种进行筛选，并对还原条件及分离纯化工艺进行优化，得到了高转化率、高纯度且对映体构型单一的产物。
( 1 ) 对3-氯-l-苯丙酮还原能力菌种的筛选及还原条件的优化
酿酒酵母B5#可将3-氯-l-苯丙酮还原为(S)-3-氯-l-苯丙醇。采用初始自然pH的液体培养基培养的酵母细胞用于3-氯-l-苯丙酮的不对称还原，得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇对映体过剩值可以达到100％ee。反应转化率随底物浓度的提高而迅速下降，以0.04g/mL葡萄糖为辅助底物，反应温度为30℃，反应时间为36h，底物浓度为0.015g/mL，生物转化转化率及对映体过剩值可分别达到99.8％和1 00％ee。
( 2 ) 从微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品的分离纯化
用硅胶柱层析法对微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品进行分离纯化，确定最佳洗脱条件为：石油醚/丙酮=50：1(V/V)，上样量为4.8 mg/mL硅胶，流速为1.5mL/min，径高比为1:12。分离纯化后产品(S)-3-氯-l-苯丙醇的纯度为98.2％，对映体过剩值为100%。

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