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第三章 氨基酸分析（amino acids）AAs

第一节 基础知识

一.概述
1. 定义:
分子中至少含一个羧基(COOH),一个氨基（-NH2）的小分子量（100－200）有机物。
是存在于动植物体内的必要物质。

2. 基本结构
e d g b a
C-¾C-¾C-¾C-¾C-¾COOH
ú ú ú ú ú
NH2 NH2 NH2 NH2

目前生物体内发现氨基酸180多种
参与蛋白组成（由蛋白质水解而得）的氨基酸20多种
都是α-氨基酸，除了:
脯氨酸 羟脯氨酸
其中20种常见氨基酸，几种不常见氨基酸
二、分类
α-氨基酸通式： –COOH、-NH2在同一个C上。不同氨基酸在于R不同

NH2
ú
H-¾C-¾R
ú
COOH

R——非极性基团
—CH3 甲基 丙氨酸 Alanine (Ala)
—CH2(CH3)2 异丙基 缬氨酸 Valine (Val)
—CH2CH(CH3)2 异丁基 亮氨酸 Leucine (Leu)
—CH(CH2CH3)CH3 丁基 异亮氨酸 Isoleucine(Ile)

CH2
NH CH2
ú
H-¾C-¾CH2 脯氨酸 Proline (Pro)
ú
COOH

—CH2— 苯丙氨酸 Phenylalanine (Phe)

—CH2CH2SCH3 蛋氨酸 Methionine (Met)
—CH2— 色氨酸 Tryptophan(Typ,Trp)
NH

R——不带电荷的极性基团
-H 甘氨酸 Glycine (Gly)
-CH2OH 丝氨酸 Serine (Ser)
-CH(OH)CH3 苏氨酸 Threonine(Thr)
-CH2SH 半胱氨酸 Cysteine (Cys)
-CH2- -OH 酪氨酸 Tyrosine (Tyr)

-CH2CONH2 天冬酰胺 Asparagine(Asn)
-CH2CH2CONH2 谷氨酰胺 Glutamine(Glu)

R-带负电荷基团
-CH2COOH 天冬氨酸 Aspartic acid （Asp）
-CH2CH2COOH 谷氨酸 Glutamic acid （Glu）

R-带正电荷基团
-CH2CH2CH2CH2NH2 赖氨酸 Lysine (Lys)
-CH2CH2CH2C(NH)NH2 精氨酸 Arginine (Arg)
---CH2---C====CH 组氨酸 Histidine (His)

NH N

CH2

不常见氨基酸

CH2—OH
NH CH2
ú
H-¾C-¾CH2 4-羟脯氨酸 Hydroxyproline(Hyp)
ú
COOH

NH2
ú
H-¾C-¾CH2CH2CH(OH)CH2NH2
ú
COOH
5-羟赖氨酸 Hydroxylysine (Hyl)

三、立体异构体
1.α-氨基酸

NH2
ú
H-¾C-¾R
ú
COOH
αC除甘氨酸外，其中αC上四个取代基不同，为手性C，手性异构体（isomers） Stereo立体，
enantiomers 对映体
2.氨基酸立体异构体分类
——按绝对构型（absolute configuration）
左旋L型，右旋D型，
与标准物——甘油醛比较而定
L-甘油醛glyceraldehyde D-甘油醛
L-丙氨酸 D-丙氨酸

3.分布
——蛋白质经温和水解后，其中α-氨基酸都是L型氨基酸
——虽然自然界中，存在有D型氨基酸
——人工合成氨基酸 DL消旋体racemate （DL等mol混合物）
四、氨基酸的酸碱性质
1.基本性质:
——酸-COOH 失H＋
——碱-NH2 得H+， 形成两性离子，两性电解质
两性解离
2.氨基酸得解离过程
以丙氨酸为例，以NaOH的滴定：

PI——iso-ionic pH (PI)
等离子点 pH
在某pH,每个氨基酸分子带正负电荷相等，分子表观净电荷为0。
PI ——iso-electric point
等电点
在某pH，每个分子呈电中性，在电场中无电泳迁移

五、反应
UV Vis——20种α氨基酸
——可见区 无吸收
——<220 nm，有紫外吸收
——220－300 nm， 酪、苯丙、色氨酸有吸收

（－）α氨基酸参加的反应
1.与亚硝酸
NH2 OH
1 1
R-CH-COOH + HNO2→R-CH-COOH + N2↑+ H2O

气量法测AAs的基础
2.与酰化试剂反应：弱碱条件下 氨基被酰（胺）化
著名 丹（磺）酰氯（Dansyl Chloride）AAs荧光衍生试剂

产物——有UV吸收
——有荧光λex=340nm
λem=455nm
3.烃基化反应
2，4二硝基氟苯 FDNB + AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
Sanger反应,用于鉴定氨基酸 方程式

荧光胺（Fluorescamine）+ AAs→→→产物λex=390nm
λem=475nm

邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)反应
一种重要荧光衍生化反应
OPA + AAs →→→ 产物
λex=340nm
λem=455nm

4. 与醛反应，形成西佛碱:
R-CHO + NH2-RCH-COOH → R-CH=N-RCH-COOH + H2O
固定化酶，或标记Ag Ab 时所用的方法

5.脱氨基反应——酶催化反应
AAs氧化酶
AAs + O2 →→→→→→→ Oxoacid酮酸 + H2O2 + NH3

α-羧基参与的反应,分析化学中应用不多

（二）α-氨基与α-羧基共同参与的反应
1.与茚三酮反应(Ninhydrin)
分析化学最常用氨基酸衍生方法
水合茚三酮 + AAs →→ 还原茚三酮 +AAs被分解→→
兰紫色产物 570nm 测A.
有紫外吸收

2.成肽反应 Peptide
以后详细讲

第二节 氨基酸分析

氨基酸分析――分离分析方法

——原因：氨基酸种类多
结构较相似
不经分离，难以直接分析，
现有直接分析方法，如酶、免疫分析法测定氨基酸选择性不够
——分离方法——高分辨分离技术：色谱、电泳

按分离方法，分为四部分：
——纸、薄层色谱
——电泳
——气相色谱
——高效液相色谱

一、纸色谱，薄层色谱法
色谱——固定相：纸色谱
薄层色谱——平面（板）液相色谱
——流动相

1.固定相
纸色谱－滤纸
薄层色谱－硅胶、氧化铝、纤维素粉——铺板，制板

2.流动相
多元流动相：水、丁醇、HAc，丙酮、酚，NH3……
根据不同要求：流动相具有不同组成，不同配比

3.分析方法
①试样预处理
采用阳离子交换柱、萃取、渗析——沉淀蛋白
去除干扰物：蛋白、盐、碳氢化合物

② 选择溶剂系统
多种组合配比
常用 ⑴ 丁醇－醋酸－水（12：3：5）
⑵ 酚－水（160g：40ml）
分离方式：
——一维色谱分离
——二维色谱分离，为获得高分辨率

③ 点样 展开
溶剂前沿
氨基酸

X Y

点样原点

RF=X/Y 比移值——保留值——保留时间

一维色谱分离

二维色谱分离
借用图
横坐标：酚－水
纵坐标：丁醇－HAc－水
分离效率高

④ 定位：
最常用：
茚三酮 ninhydrin 兰紫色产物
其它：
Sanger反应
2，4二硝基氟苯 FDNB + AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
丹酰氯AAs——有荧光λex=340nm
λem=455nm常用于分离前衍生化

⑤应用
定性：利用RF，在三个不同的溶剂系统下，确证
半定量：重现性不好
定量：扫描 挖点

二、电泳法
1.支持物：纸、纤维素膜、硅胶
2.缓冲液体系：常见pH2.0 pH5.3
3. 分析方法：
——一维电泳
——二维电泳－色谱分离

三、气相色谱法 （Gas Liquid Chromatography）
1.试样的衍生化
——问题提出：GC要求 样品可气化， AAs难气化
——衍生化方法：
　·　试剂：常用三甲基硅烷(Trimethylsilyl TMS对AAs衍生
　·　方法：
N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)
＋ AAs + ACN 150℃ 2小时 无水条件

2.分析方法：
毛细管 GC 可用一个色谱柱
其他常规GC, 需用两个色谱柱，可分离常见AAs
检测器：电子捕获检测器
　　　　火焰离子化检测器，使用较多（通用型检测器）

四、高效液相色谱法
　　　　　　　　　　分离分析法
　　　　　　　　色谱分离 　检测
　　　柱前衍生化 　　　柱后衍生化
1.检测问题
HPLC检测器：紫外、荧光、电化学
紫外：AAs末端吸收，<220nm，可用，但灵敏度低
荧光：AAs无荧光
电化学：干扰、稳定性

需进行衍生化
①　衍生化分类(derivation)
⑴按不同的衍生化试剂
常用：
——茚三酮
——邻苯二甲醛（OPA）
——丹酰氯 FMDC
⑵按分离前后顺序
——柱前衍生 pre-column
——柱后衍生 post-column
⑶按衍生操作
在线衍生on－line 可用于柱前或柱后衍生
脱线衍生off－line 多用于柱前衍生

介绍具体衍生化方法及特点
②　茚三酮(ninhydrin)最成熟的方法
(1)过程
茚三酮 汇合 加热 100℃ 570nm测A　

(2)特点
Ø 成熟常用
Ø 可见检测，紫外也可
Ø 只能柱后衍生
Ø 灵敏度10-9mol 10uL 10-4mol/L

③OPA
(1)过程
OPA+AAs→pH9-10 快速反应1－2min 荧光产物 340
455nm
(2)特点
Ø 可柱前衍生 可柱后衍生
Ø 产物不稳定，1－2min后降解，只能在线衍生
Ø 需自动反应装置，否则重现性不好
Ø 灵敏度高 pmol(10-12)-fmol(10-15)
Ø 只有伯氨氨基酸可衍生，（羟）脯氨酸不可

CH2—OH
NH CH2
ú
H-¾C-¾CH2 4-羟脯氨酸 Hydroxyproline(Hyp)
ú
COOH

④丹酰氯
(1)一般柱前衍生。但试剂产物对色谱柱寿命有影响
条件：60℃ 10min
(2)可紫外 可荧光， pmol(10-12) 水平灵敏度

⑤FITC 异硫氰酸荧光素
⑴过程：
FITC+丙酮+AAs+pH9.2 混合，避光放置过夜
⑵特点
Ø 只能柱前脱线衍生
Ø 灵敏度较高，比OPA高，激光荧光,amol 10-18mol
Ø 毛细管电泳中常用
2.色谱分离
按柱前衍生 柱后衍生
分离AAs衍生物 分离AAs
分离对象不同
① 分离AAs
色谱柱－离子交换色谱柱－填充阳离子交换树脂
强酸型－SO3H
洗脱剂－缓冲液+盐(柠檬酸钠)
原理－
□－SO3H→ 碱处理→ □-SO3Na + AAH+ pH=2-3
→ □-SO3 AAH+ + Na+
逐渐提高pH 和Na. 不同AAH+ 洗脱下来,梯度洗脱
由此原理生产氨基酸分析仪
检测
采用在线柱后衍生化方法,主要有两种:
⑴茚三酮 p374 结果见 p378
⑵ OPA
② 分离AAs衍生物,如OPA,
提前衍生,反应1分钟.
色谱柱:碳18反相色谱柱;
洗脱剂Buffer+甲醇,四氢呋喃,梯度洗脱.
检测:340nm 455nm
4. 定量分析:
AAs标准品,工作曲线,
试样 定量

五.用途
1. 氨基酸分析,药品,食品,饲料，临床
2. 蛋白质分析

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