1-十四烷基-3-甲基咪唑溴与BSA相互作用研究.pdf

第 卷第 期 年 月 山 东 建 筑 大 学 学 报 .收稿日期:基金项目:山东建筑大学博士科研基金项目()作者简介:耿斐()女编辑博士主要从事表面活性剂聚集行为及其与蛋白质相互作用等方面的研究:.通讯作者:./.十四烷基甲基咪唑溴与 相互作用研究耿斐(山东建筑大学 学报编辑部山东 济南)摘要:研究牛血清白蛋白()与咪唑型表面活性剂的相互作用可以补充咪唑型表面活性剂的基础数据拓宽其应用范围 选取 十四烷基甲基咪唑溴/(/)体系使用表面张力仪、电导率仪、远紫外圆二色光谱仪、荧光光谱仪及等温滴定微量热仪考察了 与 的相互作用 结果表明:低浓度的 与 以静电相互作用结合稳定了 的二级结构高浓度的 与 以疏水相互作用结合破坏了 的二级结构并最终导致其变性 与 内部空腔的色氨酸残基的主要作用方式为疏水相互作用每克 可以结合约为 的 不同温度下结合量略有差别 无论是在保护还是破坏 结构方面的能力都要优于传统的阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵()关键词:咪唑型表面活性剂牛血清白蛋白静电相互作用疏水相互作用中图分类号:.文献标识码:文章编号:()():()./(/).().:第 期 耿斐:十四烷基甲基咪唑溴与 相互作用研究 引言蛋白质是一类两性物质可以与包括表面活性剂、药物、染料以及金属离子等在内的许多种类的小分子结合 蛋白质的功能是由特定的三维空间结构决定的与小分子的相互作用会引起分子中各级结构的变化导致化学性质变化和生物活性丧失最严重的还会引起变性 牛血清白蛋白()来源丰富性质稳定在众多领域都得到了广泛的应用是人类最早研究的蛋白质之一 等研究发现表面活性剂极性头基的疏水性在稳定蛋白质方面发挥着重要作用极性头基的疏水性越强与蛋白质结合效率越高 胡晓熙等通过荧光光谱法从作用机理、结合常数及位点数、作用力类型等方面研究了全氟烷基甜菜碱与 的相互作用补充了全氟表面活性剂与蛋白质相互作用的研究数据现有报道多关注传统阴、阳离子表面活性剂与 的相互作用而结构可调、功能化的表面活性剂与蛋白质相互作用的研究虽有报道但稍显欠缺阳离子表面活性剂 十四烷基甲基咪唑溴()具有更高的表面活性研究其与 的相互作用有助于发掘长链咪唑类表面活性剂的特别之处开拓咪唑类表面活性剂的应用领域 文章通过测量/体系的表面张力值、电导率值、静态荧光、内源荧光、圆二色及相互作用焓 考察了与 相互作用过程中的热力学参数、作用方式、作用参数以及 结构的变化 实验材料、仪器与方法.实验材料 根据文献的方法合成过程为:控制温度在 范围在氮气保护的条件下甲基咪唑、过量的溴代十四烷和乙腈搅拌回流反应 之后旋转蒸发以除去过量的溴代烷烃和乙腈减压蒸馏以除去水即得到最终产物 结构式如图 所示 购自美国 公司十四 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵()分 析 纯 购 自 美 国 公司碘化钾 分析纯购自上海国药集团图 十四烷基甲基咪唑溴结构示意图.实验仪器与方法在 型表面张力仪上使用吊环法通过单测得到表面张力数值至少测量 次直到测得的误差./使用 型电导率仪测量体系的电导率 以上实验的温度分别为、使用 荧光光谱仪测量荧光:内源荧光测定固定激发波长为 于 范围内扫描/体系同步荧光测定固定激发和发射的波长差 于 范围内扫描/体系 使用 远紫外圆二色光谱仪测量时带宽为 通过仪器自带的 软件计算得到 二级结构使用 等温滴定微量热仪进行实验:注射器每次注入 表面活性剂进入装着.的样品池共注入 次注入后的平衡时间均为 待基线在/的搅拌下稳定后再启动实验 搅拌热已由程序自动扣除 以上实验的温度均为 结果与讨论./体系表面张力测定了、时/体系(质量浓度 为./)的表面张力如图 所示 曲线有两个明显的拐点根据蛋白质与表面活性剂相互作用的规律可知第一个拐点表明 开始与结合此时对应的 浓度称为临界聚集浓度()由于 的存在增加的分子大都与之结合吸附在溶液表面的 没有明显增加所以表面张力数值的变化很小出现了第一个平台 的出现说明 和 的相互作用优先于胶束的形成 第二个拐点表明 与 的结合已经达到饱和 开始形成胶束达到了临界胶束浓度()中共有 个亚结构每个亚结构是由双胱氨酸键连接两个次级区域形成的而每个次级区域由 段螺旋结构组成其相互平行形成一个槽形区 山 东 建 筑 大 学 学 报 年域 绝大部分疏水残基都分布在螺旋和槽内所以次级区域有疏水内核在次级区域的顶端开口部分分布着一些非极性残基所以次级区域有极性外表 疏水尾部可以进入 非极性的内部而其亲水头基则以静电作用与 极性的残基结合由图 可知温度改变对 没有影响 已知静电相互作用受温度的影响很小 所以在 时主要以咪唑头基通过静电作用与 中的极性残基相互作用测量了不同温度下/体系(质量浓度变化)的表面张力如图 所示 不随 质量浓度的增大而变化而 随着 质量浓度的增大而升高不同温度下体系的数值见表 图 不同温度下/体系(.)表面张力图图 不同温度下/体系(质量浓度变化)表面张力图表 不同温度下/体系(质量浓度变化)值表 质量浓度/()/().即为结合到 上的 的量 以其对 质量浓度作图如图 所示 曲线随 质量浓度的增加线性增长求得直线斜率即为 结合 的量 得到每克 结合 的量分别为.()、.()及.()第 期 耿斐:十四烷基甲基咪唑溴与 相互作用研究 图 对 质量浓度作图./体系热力学参数测定了、时/体系(./)的电导率如图 所示 所得曲线双折线的折点对应着胶束的形成 反离子解离度 胶束形成后的直线斜率/胶束形成前的直线斜率反离子结合度 根据图 经过计算可知、时/体系的反离子结合度 分别为.、.和.图 /体系(.)在不同温度下的电导率图根据质量作用模型热力学参数可以由式()()表示为 ()()()()()式中和分别为胶束形成的吉布斯自由能和焓/为胶束形成的熵/()为温度 为常数取值为.不同温度下/体系的热力学参数计算结果见表 值均为负说明胶束的形成是自发的 和 均为负值说明胶束的形成是熵焓共驱过程表 不同温度下/体系(.)热力学参数表/()/()/()./体系远紫外圆二色光谱 与 的相互作用会导致 的结构发生一些变化可以通过圆二色光谱检测 二级结构的改变 在圆二色光谱上螺旋结构的特征峰表现为 及 附近的两个负槽折叠结构的特征峰表现为 附近的负槽/体 系(./)随浓度变化的远紫外圆二色光谱如图 所示 可以看出:当 的浓度较低(/)时 的二级构象几乎没有改变可能是因为 分子与 的高能位点结合稳定了其二级结构导致其构象更加紧密当的 浓 度 达 到 /时 和 处的负槽消失 说明 的二级构象被破坏图 /体系(.)远紫外圆二色光谱图/体系中 二级构象质量分数见表 低浓度(/)的 使 中 螺旋及 折叠的量显著降低破坏了 的二级结构 山 东 建 筑 大 学 学 报 年表 /体系(.)中 二级构象质量分数表 浓度/()螺旋/折叠/./体系荧光光谱./体系内源荧光光谱图 显 示 了/体 系(./)中 的内源荧光随 浓度的变化 色氨酸残基的荧光光谱对微环境的变化很敏感其峰位一般在波长为 之间变动由图 可知体系的荧光发射峰是 中色氨酸残基 的 特 征 荧 光 光 谱的 加 入(/)导致最大荧光发射峰峰值的降低色氨酸残基的最大峰峰值从 下降到 同时伴随着峰位的蓝移最大峰位置从 移到 说明色氨酸残基暴露于更加疏水的环境中此时 还没有形成胶束这种现象只能归因于 与 形 成 了 复 合 物 随 着的浓度进一步加大大于./时最大荧光发射峰峰值与峰位置几乎不再发生变化此时造成了 的变性图 /体系(.)内源荧光光谱图./体系结合参数荧光淬灭可以揭示淬灭剂对荧光物质的淬灭位置 一般来讲表面活性剂对色氨酸残基的淬灭是因为静态淬灭形成了不能发射荧光的激基缔合物 为了验证 与 的淬灭是否是静态淬灭应用 方程计算结合淬灭过程的反应速度 方程由式()表示为 ()式中、分别为不含、含有淬灭剂时的最大荧光发射峰峰值 为不含淬灭剂时荧光物质的寿命对 而言 为淬灭剂的浓度/图 为/对 浓度曲线 是曲线线性部分的斜率计算可得 为./对于动态淬灭反应反应速度 最大为./这就说明 对 的淬灭过程是静态淬灭图 /体系(.)相对荧光强度对 浓度作图在静态淬灭过程中假设淬灭剂与荧光物质的 个独立且相同的结合位作用已经结合的部位之间无相互作用结合反应可由式()表示为 ()式中 与 分别为淬灭剂与荧光物质 为激基缔合物平衡常数 可由式()表示为()式中 为浓度/对式()两侧取对数并将荧光物质与激基缔合物都用其相应的最大荧光发射峰峰值表示式()可变形成式()()将/体系的 对 作图如图 所示 通过曲线的斜率与截距可以计算得到结合位点 与平衡常数 可得/第 期 耿斐:十四烷基甲基咪唑溴与 相互作用研究 体系的.、/推测在考察的浓度范围内(为 /)与 之间为疏水相互作用 根据.部分中表面张力曲线已知在 附近时与 以静电相互作用为主可知:当 浓度较小时其极性头基先以静电相互作用与 特定的结合位点作用当 浓度较大时其疏水尾链再以疏水作用与 的非极性残基部分结合图 对 浓度作图 分子中含有两个色氨酸残基一个位于 的疏水空腔内另一个位于外层 与 相互作用的结合位点 为.说明一个只与一个色氨酸残基作用 为了验证推测即在考察的浓度范围内(浓度为/)与 之间为疏水相互作用在/体系中加入 作为淬灭剂仅能与 表面的色氨酸残基反应而不能进入 内部淬灭色氨酸残基 对色氨酸残基的淬灭是动态淬灭可由式()表示为()式中 为可以被淬灭的残基占总残基的比例含有与不含有 时对 荧光强度的影响如图 所示 通过对图 中曲线的截距计算可知:不含有 时 为.含有时 为.可见随着 的加入 表面的色氨酸残基所占比例增大 表面色氨酸残基的数量不会增加所以 增大只能是由于的加入使 内部的色氨酸残基的数量降低由此可知 只能通过疏水作用与 内部的色氨酸残基作用图 浓度对 荧光强度的影响图./体系同步荧光光谱/体系(为./)的同步荧光光谱如图 所示 时的同步荧光是色氨酸残基的 随着 的加入色氨酸残基的最大发射峰峰值降低但是最大峰位置未发生变化表明 与 的相互作用没有影响色氨酸残基的微环境 当 的浓度./时 荧光光谱不再发生变化此时 发生变性这与远紫外圆二色光谱及内源荧光光谱的结果相吻合图 /体系(.)同步荧光光谱图./体系等温滴定微量热蛋白质与表面活性剂作用的等温滴定微量热控制实验包括胶束及蛋白质的稀释热已有实验证明蛋白质的稀释热可以忽略 扣除控制实验之后/及/体系(均为./)的等温滴定微量热曲线如图 所示 两体系曲线的变化趋势类似可以按反应进程将曲线划分为 部分第一进程()的高能位点与表面活性剂分子结合 的热稳定性增强 此阶段作用焓随着表面活性剂浓度的增大逐渐减小说明随着相互作用 上特定的高能位点逐渐减少根据.及.山 东 建 筑 大 学 学 报 年部分分析此时表面活性剂的极性头基先通过静电作用与 带负电荷的氨基酸残基作用尾链再通过疏水作用与 的疏水氨基酸残基作用 第二进程()表面活性剂开始形成胶束热量急剧减小至零图 /及/体系热流曲线图 结论通过上述研究得到以下结论:()咪唑型表面活性剂 与 的相互作用与其浓度有着密切的关系 当 浓度较低时作用方式为静电相互作用 的加入稳定了 的二级结构当 浓度较大时作用方式为疏水相互作用 的加入破坏了 的二级结构并最终导致其变性()与 内部空腔里的色氨酸残基的作用方式为疏水相互作用对色氨酸残基的淬灭是导致 内源荧光改变的原因()通过计算可知每克 可以结合的的量约为 不同温度下的结合量略有差别()对比/、/体系作用焓可知在破坏 的二级结构方面 要强于传统的阳离子表面活性剂 参考文献:惠蒙蒙张晨龙杨许召等.酰基氨基酸型表面活性剂与牛血清蛋白相互作用研究.日用化学工业():.耿斐.咪唑类表面活性剂与 乳球蛋白相互作用研究.山东建筑大学学报():.邹昆郭万首邓雅文等.从生物信息与网络药理角度认识姜黄素治疗膝骨关节炎的分子机制.中国组织工程研究():.颜雨萌.胆盐理化性质及其对脂质消化的影响机制研究进展.中国油脂():.高俊杰魏恺莹陈达.茜素绿蛋白质()三元络合物瑞利散射光谱研究.沈阳理工大学学报():.倪睿.离子液体和低共熔溶剂磁性固相萃取用于染料及蛋白质的分离分析研究.长沙:湖南大学.陈思宇杨雪杨灵玲等.与瓜类褪绿黄化病毒 蛋白互作的寄主因子的筛选.华北农学报():.:.:.胡晓熙王芸文丰等.全氟两性表面活性剂与蛋白质相互作用研究.广西师范大学学报(自然科学版)():.():.:.():.()():.():.():.王守业徐小龙刘清亮等.荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用.化学进展 ():.:.:.(学科责编:朱志鹍)