国家自然科学基金申请书.docx

填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究： 在读（含在职）研究生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究内容相近的 项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会地址：北京市海淀区双清路83号，通讯地址：北京8610信箱。 邮政编码：100085 一、简表研究项目名称中文A型禽流感病毒致病和免疫发病机理的研究英文Studies of pathogenesis and immunity mechanism of avian influenza virus type A类别 A.自由申请 B.高技术探索 C.青年 D.地区高技术探索项目主题号 E.重大 F.重点 H.专项F申报学科名称1畜禽病理学名称2 A. 基础研究 B. 应用基础 代码1C02030606代码2B申请金额160.00万元起止年月2003年1月至2006年12月所用实验室A. 国家重点 B. 部门开放实验室编号13268609A申请者姓名中文郑世民性别A. 男出生年月1959年9月民族名称汉拼音Zheng shiminB. 女A身份证号230106590918207代码01专业技术职务名称教授学位 A. 博士 B. 硕士 C. 学士 A博士学位授予国别或 地 区国(地区)名中国A. 院士B. 博士生导师C. 博士后代码011代 码156所在单位名 称东北农业大学系（所）动物医学院单位代码15003001性 质A. 高等院校B. 科研机构C. 其它邮政编码150030隶属关系名称黑龙江省A申请者电话[phone]代码923所在地 省 (自治区、直辖市) 市(县) 区 街(路) 号项目组总人数高级中级初级博士博士生硕士生参加单位数10732姓名身份证号专业技术职务所在单位名称及代码项目中的分工签字孔宪刚230103550303095研究员、博导哈尔滨兽医研究所副主持主要成员(不含申请者)王君伟230106601027207教授、博导东北农业大学（15003001）部分实验刘忠贵230107300815041教授、博导东北农业大学（15003001）技术顾问刘胜旺620105680704207副研究员哈尔滨兽医研究所部分实验贾永清230106196207112039副教授东北农业大学（15003001）部分实验高雪丽152104197405220325讲师东北农业大学（15003001）部分实验葛 铭23070419680927041x讲师东北农业大学（15003001）部分实验姜永厚230106690403201讲师东北农业大学（15003001）部分实验杨丽萍230103540419514高级实验师东北农业大学（15003001）部分实验1研究内容和意义摘要应用免疫学和病理学新理论与新技述，通过对AIV感染雏鸡血液、免疫器官、局部粘膜免疫组织的细胞免疫、体液免疫检测及组织病理学、超微病理学、细胞因子的检查，全面系统地研究AIV感染导致鸡群严重死亡的机理及感染鸡体全身免疫、粘膜免疫和细胞因子免疫调节的变化，为禽流感的防制提供科学依据，填补该领域研究的国内外空白。主题词1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文A型禽流感病毒致病机理免疫机理英文Avian influenza virus type A/pathogenesis mechamism/immunity mechamism 简 表 填 写 要 求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字 (包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的 12月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义摘要与主题词均录入软盘。2二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。流感病毒（influenza virus）在病毒分类上被列为正粘病毒属（orthomyxovirus），属RNA病毒，可根据核蛋白的抗原特异性划分为A、B、C三型，而在动物中能引起发病者，仅限于A型流感病毒。禽流感（Avian Influenza ，AI）是由A型禽流感病毒（Avian Influenza Virus Type A）引起的多种禽类和野生鸟类的一种急性、高度致死性传染病。1878年Perroncito首次报道了意大利鸡群爆发该病，被称为“鸡瘟”（Fowl pest或Fowl plague），也叫真性鸡瘟。该病被国际兽医局动物流行病组织（OIE）确定为I类烈性传染病。19世纪末至20世纪初，本病主要发生于欧洲许多国家和地区，故又叫做欧洲鸡瘟。目前，世界许多养禽国家均有该病发生或流行的报道。我国自1994年由陈伯伦等首次从广东省发病的鸡群中分离到Hg亚型的A型禽流感病毒以来，四川、宁夏、新疆等地区也分离到该病病毒。从该病发生的世界历史上看，本病属于一种毁灭性的疾病，每次严重爆发都给养禽业带来重大的经济损失，例如19831984年，美国为了扑灭宾州发生的禽流感，曾花费了6000万美元；1997年底，香港政府为扑灭该病，将境内140多万只鸡全部扑灭；巴基斯坦1998年7月以来的半年内，仅禽流感一项损失了90亿巴基斯坦卢比。目前，低致病力和中等毒力的AI已在我国十几个省或地区发生和流行，且有逐渐扩大的趋势，并潜伏着高致病力AI爆发和流行的可能威胁，禽流感警钟已鸣，亟待防范。一、禽流感病毒及其生物学特性国内外研究进展禽流感病毒（Avian Influenza Virus , AIV）属正粘病毒科（othomy-xoviridase）流感病毒属的A型流感病毒，其基因组为单股负链分节段RNA，核衣壳呈螺旋对称，外包囊膜，其上有纤突。该病毒根据其表面抗原即血凝素（Hemagglutimn , HA）和神经氨酸酶（Neuraminidare , NA）的抗原特性分为不同的亚型，迄今为止，已发现HA至少有15种，分别以H115命名，NA至少有9种，分别以N1-9命名。其中高致病性禽流感（Highly Pathogenio Avian Influenza ,HPAI）都是由H5和A7亚型引起。1.禽流感病毒的分子生物学特性AIV基因组为分节段单股RNA病毒。该病毒最显著的生物学特性是血清亚型众多，变异频繁，这与本病毒在转录和复制过程中易于发生基因重排有关，AIV抗原性的改变主要由两个方面引起，即抗原漂移（antigenic drift）和抗原转变（antigenic shift）。基因组的点突变是造成抗原漂移的分子基础，尤其是HA和NA的点突变导致较小范围的抗原性改 3变；基因组的缺乏、插入或重排导致抗原改变，造成较大范围抗原性的改变，产生新型毒株或其毒株毒力明显改变。2.禽流感病毒基因组结构及其功能 A型禽流感病毒有8个基因组片段，分别以片段1、片段2片段8分别编码基质蛋白M1、M2和非结构蛋白NS1、NS2。该病毒基因组的特点是，其8个基因片段的3和5末端具有高度保守性，即核苷酸序列相同。同时，在5末端的13个核苷酸序列和3末端的12个核苷酸序列中有些可反向互补。遗传学和生物化学实验证实，3和5末端保守的核苷酸序列是病毒转录的重要识别部位，其该区域的反向互补序列，与病毒的复制有关。8个基因片段中，片段13分别编码病毒多聚酶PB1、PB2和PA；片段4和6分别编码血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），而且这两个片段的变异比较高，不同的血清亚型其序列差异比较大，既使同一亚型其序列也不尽相同；片段5编码核蛋白（NP），为病毒的核衣壳蛋白，片段7编码基质蛋白M1和M2；片段8编码NS1和NS2两个非结构蛋白。3.病毒基因编码蛋白的结构与功能 蛋白质是流感病毒粒子的主要组成成分（70%75%），具有重要的功能，如病毒基因复制所需酶，感染细胞时与受体结合的纤突以及维持病毒形态的基质膜都是由蛋白质组成的。随着生物技术的不断发展，对蛋白质结构和功能的研究不断深入，目前对流感病毒HA和NA的三维结构研究最多，了解的也最清楚，其受体结合位点及抗原决定簇的结构与位置也已掌握。这些成绩，要归功于定点突变技术、X线晶体衍射技术和反向基因遗传技术的广泛应用。现在对大多数禽流感病毒蛋白质的功能已经掌握。我们确信，随着研究的不断深入与技术手段的不断改进和提高，流感病毒蛋白质的其它功能将会不断确定。4.A型流感病毒的分子生物学 动物的种类不同，其感染A型流感病毒后临床表现各异，即使来自于不同A型流感病毒分离株的同一亚型，对同一动物的致病性也存在很大差异。一般来说，哺乳类动物感染A型流感病毒后，病毒主要在呼吸道上皮细胞增殖，故临床表现主要以局部呼吸道症状为主；而禽类感染A型流感病毒后，其临床症状与病毒毒力密切相关，如非致病力毒株或低致病力毒株，病毒只在局部粘膜（如消化道、呼吸道）上皮细胞内增殖，故不表现或只表现轻微的临床症状；如果感染高致病力毒株，病毒常常侵入全身各器官组织，引起严重的临床症状，甚至造成大批死亡。 A型流感病毒感染动物有机体后，首先依赖HA吸附于宿主细胞膜表面的受体上，然后经过蛋白酶的作用，将HA切割为HA1和HA2，从而完成病毒的脱壳过程。HA对蛋白酶的敏感性与病毒的致病力密切相关，HA对蛋白酶的敏感性越高，其病毒的致病力也越强。故HA的可切割性是流感病毒毒力强弱的主要决定因素。 Wood等（1993）和Some等（1996）分别研究了H5和H7亚型AIV血凝素裂解位点的氨基酸序列，分析了氨基酸组成与病毒致病力的关系，结果发现高致病力毒株比低致病力毒株，其裂解位点有较多（3-4个）碱性氨基酸插入，所有低致病力的病毒分离株，其裂解位点均无碱性氨基酸。并且，同为高致病性的H5和H7亚型AIV，其裂解位点的氨基酸序列有也不完全一致。 Veg等研究了H7亚型各病毒分离株和定点诱变的突变株H4裂解位点的氨基酸序列，结果发现蛋白内切酶能识别的最短氨基酸序列为RXK/RR（X代表任意一种氨基酸）。Walker等对A/Turky/1378/85(H5N8)及其诱变株HA裂解位点的氨基酸序列研究时发现，在酶切位点附近有糖基化结构存在时，酶切的最大限度（10%）需要5个连续碱性氨31基酸碱基的插入；位于HA1酶切位点上游的脯氨酸（P）其活性非常重要，如被置换，HA的可裂解性下降，病毒活力减弱，HA1末端的精氨酸是蛋白内切酶识别特异氨基酸部位，如该氨基酸发生置换，HA则不能裂解。Horimoto等对AIV血凝素裂解活性与病毒毒力的相关性研究发现，裂解位点碱性氨基酸的缺失或被非碱性氨基酸置换，可降低病毒毒力和在MDCK细胞上的蚀斑形成能力。同时还证明具有HA裂解活性的蛋白内切酶能增强AIV感染细胞的能力，提高细胞和动物有机体对AIV的易感性。另外，一些外源性（如胰蛋白酶、纤维蛋白酶等）的识别精氨酸残基的蛋白内切酶也将HA裂解为HA1和HA2，从而使低致病力AIV的感染性增强，金黄色葡萄球菌也能分泌一种可裂解流感病毒HA的蛋白酶。小鼠实验证实，当流感病毒与金黄色葡萄球菌混合感染时可导致肺脏大面积病变，提示禽类即使感染低致病力AIV时，如并发其它细菌混合感染，有可能使AIV的致病性增强。总之，HA基因及其产物是流感病毒致病力的主要决定因素，而NA、M、PA、PB1、PB2、NP以及NS等对维持病毒毒力起一定作用。5A型流感病毒对宿主的特异性 自然条件下流感病毒对感染宿主有一定的特异性 ，依此可将病毒分为不同的群，如人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒等。但流感病毒的种属特异性并不十分严格，已发现流感病毒在不同种属动物间可传播，如禽流感病毒H1N1亚型和人流感病毒H3N2亚型毒株均可从猪体分离到；H1N1亚型流感病毒也可感染人。郭元吉对人甲型流感病毒在我国动物中的分布进行了调查研究，结果从北京的鸡血清中检测到H1N1抗体；从丹东的鸭中检测到Hsw1N1和H1N1以及H2N2抗体；从上海的鸭中分离到H6N4亚型AIV；从广西的鸭中分离出H6N8、H2N3亚型病毒，从野鸟中分离到H10N9、H6N5等11个亚型病毒。后来又从吉林患呼吸道疾病的马中分离到与AIV相似的H3N8亚型流感病毒；1997年香港禽流感H5N1亚型从感染禽开始，随后波及到人，先后有18人感染发病并致6人死亡，引起全世界恐慌。Banks等（1998）报道，从一患结膜炎的妇女体内分离到一株与AIV同源性很高的H7N7亚型流感病毒，郭元吉等（1999）从香港人体内首次分离到H9N2亚型AIV。 流感病毒对宿主的特异性受多种因素的影响，每个基因片段的产物都可能起一定的作用。但HA是宿主特异性的主要决定因素。目前已知的15个HA亚型都可以从禽类中分离到，以前从人体分离到的主要是H1、H2和H3，最近几年来才从人体内分离到H5、H7和H9流感病毒。猪体内分离到的主要是H1和H3，马流感病毒常见的是H3和H7亚型。为什么会出现这种情况，其根本原因还不清楚。 流感病毒的NA对宿主特异性也有一定影响。目前NA亚型在禽类中都能分离到，但在哺乳动物NA亚型有一定的分布，如人流感和猪流感病毒分为N1和N2，马流感病毒主要为N7和N8。A型流感病毒的其它产物（如PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、MS1、MS2等）对宿主特异性的决定也起一定的作用。总之，流感病毒对宿主的特异性是以HA为主的多种基因产物综合作用的结果，是一个十分复杂的尚未明了的问题。二、禽流感免疫防御研究的现状及存在的问题 禽流感是多种禽类和鸟类的一种I型烈性传染病。自1878年首次在意大利鸡群中暴发以来，已在美洲、欧洲、亚洲、非洲、澳大利亚、意大利等世界上许多养禽国家和地区发现有该病流行或暴发。由于AIV血清型众多，变异性极强，即抗原性常常发生漂移和转变，这就为其防制带来很大的困难。目前对禽流感的预防主要靠疫苗免疫，世界上开发研制的禽流感疫苗主要有灭活全病毒苗、亚单位疫苗、重组活载体疫苗和核酸疫苗等，有些疫苗在美国和墨西哥AI大暴发后防止疫情扩散和蔓延中发挥了一定的作用。但高效、安全、实用的禽流感疫苗的研制仍然是世界养禽业关注的焦点。下面就几种主要禽流感疫苗的优缺点作一简介。1 灭活全病毒疫苗灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，再辅以佐剂而成。其特点是安全性好，抗原组分齐全，免疫原性较强，不出现毒力返强和变异危险，能够经受同亚型AIV的攻击。缺点是：抗原量由注射剂量决定，因此必须注射比活疫苗高出数倍的毒量，另外还需要佐剂，增加了其成本；其次，灭活疫苗必须每个动物免疫接种，需要大量人力，并且禽易产生应激反应，从而造成生产性能降低，同时由于防疫人员的流动和对禽的直接接触，易造成疫病扩散；第三，灭活全病毒疫苗接种动物AI血清学检测呈阳性，不能与自然感染相区别，影响AI疫情监测和防制措施的制定。 我国已研制出针对HPN2亚型的AIV灭活油乳剂疫苗并投入商品化生产，已在许多省（市）推广使用。2 亚单位疫苗亚单位疫苗是由提取AIV具有免疫原性的HA蛋白，辅以佐剂而成。特点是：安全性好，能刺激机体产生足够的免疫力。缺点是：免疫保护持续时间短，且成本高。3 重组活载体疫苗 重组活载体疫苗是利用对禽类致病性很弱的疫苗病毒或禽痘病毒作载体，构建表达HA的重组病毒，因此重组病毒作为疫苗，它可在动物体内复制并不断表达出HA蛋白，从而诱导禽类产生针对AIV的免疫保护力。是一种很有发展前途的疫苗。4 核酸疫苗 核酸疫苗（Nucleic acid vaccine），又称基因疫苗（Gene vaccine）或DNA疫苗（DNA vaccine），是利用病原的保护性抗原基因构建真核表达质粒，再将质粒DNA用肌肉注射或基因枪直接导入机体细胞，使外源基因通过机体内源性表达系统表达并提呈给免疫系统，从而诱发产生特异性的免疫应答。核酸疫苗是近年来新兴的一种疫苗，目前正处于试验研究阶段，因其免疫保护效率低及其他一些尚未克服的困难存在，其实际应用尚需时日。5 存在的问题 禽流感的预防主要仍赖于疫苗，综合国内外的研究，从目前来看，无论是灭活疫苗还是活疫苗均存在以下几点问题； 首先，AIV的15种HA亚型均可造成禽流感暴发。虽然历史上造成严重损失的都是H5或H7亚型，但每一次暴发至少15种可能亚型均需考虑，预防免疫须由病原分离和鉴定结果来确定，盲目用苗可能起不到预防免疫的效果。 其次，疫苗的使用，将代替传统的封锁、扑杀、净化、控制和扑灭禽流感，但接踵而来的是没有症状的病禽或感染的禽肉将进入商业贸易，会使地区与地区或国家与国家之间产生禽类贸易的负面影响。 再次，疫苗使用的可能潜在危险。正如Hinshow等实验报道的那样，疫苗的使用有可能使高致病力变异毒株出现。在禽类中以鸡和火鸡对禽流感病毒最为易感，其次为珠鸡、野鸡和孔雀；目前已经充分确定全世界在野鸟，尤其是在水禽中存在流感病毒。感染病毒禽及其尸体是主要传染源，常常通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜传染；吸血昆虫也可传播病毒。病鸡的卵可带毒，常使出壳后的雏鸡大批死亡，其它年龄鸡感染后发病率和死亡率均很高。33由此可见，禽流感既可水平传播，也可经卵垂直传播。AIV感染禽体后，可引起呼吸、消化、生殖和神经等多种系统的结构、机能破坏，母鸡产蛋量明显下降、肉鸡生长发育迟缓，该病潜伏期一般35天，常突然爆发，流行初期的急性病例，可不出现任何明显症状，鸡只突然死亡，严重时死亡率可高达100%。综合目前国内外对该病的研究，主要集中在流行病学调查、病原的分离鉴定、特异性诊断、病原的分子生物学以及疫苗的研制等，特别是在病原的分子生物学和疫苗的研制方面做了大量的工作，并取得了一定的成绩。但对AIV的致病机理和免疫发病机理，迄今未见研究报道，例如，对AI的临床症状和病理学变化只是处于一种简单的描述，尚缺乏深入系统的研究，对其免疫病理学的研究认为，局部IgA可起作用，在感染病毒的恢复中，体液与细胞免疫均起作用，但体液和细胞免疫在AIV感染中到底发挥什么作用、怎么发挥作用均不清楚。另外，研究最活跃的是细胞毒性T淋巴细胞（CTL），认为CTL在活病毒感染中发挥作用，对灭活的流感病毒CTL无作用，究其机理，目前仍不明了。根据AI的发病特点（起病急、流行快、死亡率高等）及造成的严重损失，对AIV的致病机理和免疫发病机理进行全面、深入细致的研究是十分必要的。因此，本项研究以SPF鸡为实验动物，应用病理学和免疫学新理论及新技术，全面、系统、深入地研究A型禽流感的致病机理，免疫发病机理以及细胞因子的相互作用、调节和变化，为禽流感的有效防制提供重要的科学依据。34主要参考文献：1. 郭元吉等 甲型流感病毒在我国动物中分布的初步调查 微生物学报，1981，21（3）：3793842. 毕英佐等 广东禽流感的血清学调查 中国兽医杂志，1994，20（7）：893. 陈伯伦等 禽流感研究I 鸡A型禽流感病毒的分离和血清学初步鉴定 中国兽医杂志，1994，20（10）：354. 陈伯伦等 禽流感研究II 禽流感的发生和血清学调查 中国兽医杂志，1994，20（10）：675. 程安春等 鸡A型流感病毒的分离及初步鉴定 四川畜牧兽医，1995，4：566. 甘孟侯 禽流感 北京农业大学出版社，1995，1127. 孙颖杰 禽流感研究进展 畜禽传染病，1998，18（1）：19228. 于康震等 97香港禽流感 中国畜禽传染病，1998，20（3）：1871919. 唐秀英等 中国禽流感流行株的鉴定 中国畜禽传染病，1998，20（1）：1510. 陈化兰等 DNA免疫诱导鸡对禽流感病毒的免疫保护反应 中国农业科学，1998，31（5）：636811. 陈伯伦等 关于禽流感几个问题的看法 中国畜禽传染病，1998，20增刊：23023112. 陈伯伦等 当前防制禽流感的建议 中国畜禽传染病，1998，20增刊：23123313. 陈化兰等 禽流感病毒及其分子生物学研究进展 畜禽重大疫病生物技术防制研究（白新盛、卢景良主编 中国农业科技出版社 1998，5）P：31332014. 崔尚金等 流感病毒的分子遗传学 畜禽重大疫病生物技术防制研究（白新盛、卢景良主编 中国农业科技出版社 1998，5）P：32132415. 郭元吉等 中华实验和临床病毒杂志，1998，12（4）：32232516. 陈化兰等 一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析 中国农业科学，1999，32（2）：879217. 田国斌等 鸭源禽流感病毒的分类和鉴定 中国预防兽医学报，1999，21（1）：1318. 邓国华等 禽流感病毒核蛋白基因在杆状病毒中的表达 中国预防兽医学报，1999，21（2）：818319. 贾永清等 禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因序列分析 中国预防兽医学报，2000，22（1）：253020. 刘明 H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究 博士论文 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 ，2000，621. Ada Gordon AIV and pandemic influenza virus, two great infections disease challenges. Virology, 2000, 266：22723022. Alexander D J et al Experimental assessment of the pathogenicity of eight avian influenza A virus of H5 subtype for chickens , turkeys, duck and quail. Avian Pathol. 1986,15：64766223. Bean W J et al Evolution of the H3 influenza virus 333333 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（1） 研究目标 应用组织细胞培养、免疫细胞化学和免疫酶及电子显微镜技术等现代免疫学和病理学新手段，研究不同亚型A型禽流感病毒感染鸡的致病机理和免疫发病机理，全面系统地探索AIV导致鸡大批死亡的致病机理以及感染AIV鸡全身和局部的细胞免疫和体液免疫以及细胞因子的免疫调节变化及其相互关系，从细胞、亚细胞、分子水平揭示AIV的致病机理和AI的免疫发病机理，为AI的防制提供重要的科学依据，填补该项研究的国内外空白。（2） 研究内容 病毒的体内分布：研究不同AIV亚型在感染鸡体内的分布及其含量，揭示AIV的靶组织或靶细胞。 组织病理学：研究不同AIV亚型对感染鸡全身组织器官（包括心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、淋巴组织等）的损伤变化，为阐述AIV致病机理提供组织病理学基础。 超微病理学：应用电镜技术研究AIV感染鸡主要组织器官（包括心、肝、脾、肺、肾、脑及免疫器官等）的超微结构变化，从亚细胞水平揭示AIV的致病机理。 细胞因子的免疫调节：应用组织细胞培养技术，研究免疫器官组织中白介素2（IL2）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等细胞因子活性的变化，揭示细胞因子在AIV感染中的免疫调节作用。外周血液免疫学变化：包括细胞免疫和体液免疫的检测，揭示AIV感染时，鸡外周血液免疫学变化的规律以及与细胞因子调节的相互关系。免疫器官免疫学变化：包括免疫器官的细胞免疫和体液免疫指标的检测，揭示AIV感染时，鸡免疫器官的免疫学变化规律及其与外周血液免疫学变化的关系。粘膜免疫：包括消化道、呼吸道局部粘膜的细胞和体液免疫指标的检测，揭示AIV感染时，鸡粘膜免疫的变化规律及其与全身免疫的关系。（3） 拟解决的关键问题 本研究的关键在于全面深入地揭示A型禽流感病毒不同亚型的致病特点以及机体免疫系统的功能在禽流感发病中究竟发挥什么作用。为阐明禽流感的免疫发病机理提供科学依据。需要解决的关键问题是：不同亚型的A型禽流感的致病特征及其与致死率的关系；全身免疫状态与致死的内在联系；细胞因子在禽流感免疫发病中的免疫调节作用。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析本项研究拟选用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心的SPF雏鸡为实验动物。实验共分7日龄和21日龄两个大组，每个大组又分为感染禽流感H5（鹅体分离株）亚型病毒组（简称I1组）、感染禽流感H7亚型病毒组（简称I2组）和未感染病毒的对照组（简称C组）。其中，I1和I2组雏鸡分别于7和21日龄时，经静脉接种H5或H7亚型流感病毒尿囊液（1：10稀释）0.2ml/只；C组雏鸡未感染病毒为空白对照组。每组雏鸡分别饲养于负压隔离器内，按SPF雏鸡要求严格隔离饲养。并分别与感染后7、14、21、28、35、42、49和63天，每组随机抽取相同数量鸡只迫杀或发病死亡前剖杀取材，做相应处理，检测以下指标：1）病毒的体内分布检测：取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊等组织器官，采用冰冻切片和酶标（或荧光）抗体法检测病毒在体内的分布及其含量。2）组织病理学检查：取心、肝、脾、肺、肾、肠及淋巴器官等石蜡包埋，常规HE染色，检查各组织器官的病理学变化。3）超微病理学检查：用透射电镜技术对主要组织器官（心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊等）的超微结构变化以及病毒在感染细胞中的分布等进行全面检测。4）细胞因子的检测 胸腺、脾脏的IL2活性测定细胞培养及MTT法 肿瘤坏死因子（TNF）测定微量细胞病变法 干扰素（IFN）测定微量细胞病变法5）外周血液免疫学变化检测：细胞免疫指标测定T、B细胞数量免疫SPA菌体花环法T、B细胞功能淋巴细胞转化试验51体液免疫指标测定血清IgG、IgM 、IgA含量间接ELISA法6）免疫器官免疫学变化检测：细胞免疫指标测定CD4+ 和CD8+ T细胞数量冰冻切片及免疫酶标间接法T细胞（胸腺、脾脏）增殖功能MTT法体液免疫指标测定B细胞（法氏囊、脾脏）增殖功能MTT法IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量彩色免疫金银（CIGSS）法或酶标抗体间接法7）粘膜免疫的检测消化道（盲肠扁桃体、丕氏斑）、呼吸道（哈德尔腺）局部粘膜免疫组织的免疫指标测定：CD4+ 和CD8+ T细胞数量组织切片及免疫酶标间接法IgA、IgG、IgM抗体生成细胞数量CIGSS法或酶标抗体间接法局部体液（泪液、气管液、肠液、胆汁）的体液免疫测定IgA、IgG、IgM含量间接ELISA法本试验采用现代免疫学和免疫病理学的新技术、新理论，其研究方法均为申请者十几年来在实验中不断完善和使用，其条件及技术环节上都是可行的。就项目本身而言，是自1986年以来，本研究室连续承担完成鸡传染性法氏囊病免疫抑制机理、鸡传染性贫血病发病机理的研究等四项国家自然基金项目，并取得了有意义的创新性研究成果的基础上，结合当前国内外对“禽流感”研究中亟待解决和需要阐明的实际问题及其发展动向提出的，试验条件较为优越，按研究方案实施，定能取得有重要实际意义的研究成果。523. 本项目的创新之处（1） 选题上：本项研究是综合当前国内外禽病的研究动态和生产中急待解决的实际问题提出的。禽流感是严重危害现代化养禽业大发展的世界性I类烈性传染病，阐明AIV的致病机理和AI免疫发病机理，是国内外广大兽医工作者多年的共同心愿，特别是禽病免疫病理的研究一直是动物医学界所关注的热门话题。综合目前已有的资料，对AIV的致病机理及其免疫发病机理目前均缺乏全面系统的研究。因此，本项目拟对AIV的致病机理及其全身和粘膜免疫系统在AI的发生中的作用进行全面深入细致的研究，不仅可填补该项研究的国内外空白，更为重要的是为该病的免疫防治提供可靠的科学依据。（2） 研究内容和技术路线上，应用免疫学的新理论和新技术，结合病理学的特点和电镜技术，从细胞、亚细胞及分子水平综合研究AIV的致病机制以及通过细胞因子、外周血液和全身免疫器官及局部粘膜的细胞免疫和体液免疫变化的测定，揭示机体免疫机能，特别是细胞因子在禽流感免疫发病中的作用及免疫调节中的作用，在国内外该项目的研究中尚未见报道，独具特色，具有综合研究优势。（3） 本项目申请者自1986年以来，作为主要参加者，在完成刘忠贵教授连续主持的鸡传染性法氏囊病免疫抑制机理、鸡传染性贫血病发病机制的研究等四个国家自然基金项目的基础上，综合目前禽流感研究的动态及生产实际需要提出的，是继禽类免疫抑制病研究之后，又一新的研究领域，具有对禽类疾病免疫研究的连贯性和系列化特点。64. 年度研究计划及预测进展2003.12003.12实验准备及进一步完善检验手段；7日龄动物感染发病实验及被检材料采取；外周血液T、B细胞功能的检测；细胞因子IL2、TNF、IFN的检测；病毒在体内的分布检测。2004.12004.1221日龄动物感染发病实验及被检材料采取；外周血液T、B细胞功能的检测；细胞因子IL2、TNF、IFN的检测；病毒在体内的分布检测。外周血液T、B细胞数量的检测；2005.12005.12 局部免疫组织的细胞免疫和体液免疫指标检测； 局部体液（肠液、胆汁、泪液、气管液）的体液免疫指标检测；免疫器官的细胞免疫和体液免疫指标的检测；2006.12006.12全身各组织器官的组织病理学检测；主要组织器官超微结构的检测。 全面分析，工作总结，写出总结报告。 5. 预期研究成果本研究应用免疫学和病理学新理论、新技术，通过对不同亚型AIV感染雏鸡的病毒在体内的分布、组织病理学、主要组织器官超微结构以及细胞因子、外周血液和全身免疫器官组织的免疫学变化的全面系统研究：（1）从细胞、亚细胞水平，全面系统地揭示AIV的致病