自然发酵与接种发酵“户太8号”葡萄酒品质及真菌微生物多样性分析.pdf

生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 181自然发酵与接种发酵“户太8号”葡萄酒品质及真菌微生物多样性分析文 栩1，王志磊1，袁佳璐1，线芷晨1，袁春龙1,2,*（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 宁夏贺兰山东麓葡萄酒实验示范站，宁夏 永宁 750104）摘 要：为增加鲜食葡萄产品的附加值，提高果农的收益，系统研究了“户太8号”酿酒过程中真菌微生物多样性与葡萄酒品质的关系，通过高通量测序研究两种发酵方式（自然发酵与接种发酵）在不同发酵阶段“户太8号”葡萄酒真菌微生物多样性的变化及葡萄酒的风味特征。结果表明：自然发酵的葡萄酒与接种发酵相比，其葡萄酒乙醇体积分数较低，乙酸含量高；醇类与酯类挥发性风味物质含量高于接种发酵，脂肪酸类含量较低。在发酵前期，自然发酵葡萄酒菌群中孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）占优势地位，发酵中期才出现大量酿酒酵母属（Saccharomyces），发酵结束阶段仍含有大量有孢汉逊酵母属。接种发酵过程中酿酒酵母属均占优势地位。乙酸乙酯及部分醇类物质，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇、顺-3-壬烯-1-醇与有孢汉逊酵母属、链格孢属（Alternaria）、枝顶孢属（Acremonium）、枝孢属（Cladosporium）具有相关性。而且，自然发酵“户太8号”葡萄酒存在破败风险，且产生大量乙酸乙酯，会对香气造成不利影响。因此，推荐使用接种发酵酿造“户太8号”葡萄酒。关键词：“户太8号”；发酵方式；真菌多样性Quality Characteristics and Fungal Diversity during Natural and Inoculated Fermentation of“Hutai8”WineWENXu1,WANG Zhilei1,YUANJialu1,XIANZhichen1,YUANChunlong1,2,*(1.CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling 712100,China;2.NingxiaHelanMountainsEastFoothillWineExperimentandDemonstrationStation,NorthwestA&FUniversity,Yongning 750104,China)Abstract:In order to increase the added value of table grape products and consequently improve the income of fruit farmers,this experiment systematically studied the relationship between fungal diversity and“Hutai8”wine quality during the winemaking process.Fungal diversity changes during natural and inoculated wine fermentation were studied by high-throughput sequencing,and changes in flavor characteristics were evaluated as well.The results showed that compared with inoculated fermentation,naturally fermented wine had lower alcohol content and higher acetic acid content.Moreover,the contents of volatile alcohols and esters were higher than those of the wine produced by inoculated fermentation,and the content of fatty acids was lower.At the early stage of natural fermentation,Hanseniaspora was dominant in the microbial community of naturally fermented wine,a large number of Saccharomyces appeared at the middle stage,and there were still a large number of Hanseniaspora at the late stage.S.cerevisiae remained dominant during inoculated fermentation.Ethyl acetate and some alcohols,such as benzyl alcohol,benzyl alcohol,hexanol,cis-3-nonene-1-ol,were correlated with the genera Alternaria,Acremonium and Cladosporium.In addition,there could be a risk of naturally fermented“Hutai8”wine deteriorating and producing a large amount of ethyl acetate,which can adversely affect the aroma.Therefore,inoculated fermentation is recommended to produce“Hutai8”wine.Keywords:“Hutai8”;fermentation method;fungal diversityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220618-184中图分类号：TS262.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）14-0181-09收稿日期：2022-06-18基金项目：陕西省重点研发项目（2020ZDLNY05-05）第一作者简介：文栩（1999）（ORCID:0000-0003-2448-1673），女，硕士，研究方向为葡萄酒副产物。E-mail:*通信作者简介：袁春龙（1969）（ORCID:0000-0002-0561-8286），男，教授，博士，研究方向为葡萄与葡萄酒风味化学。E-mail:182 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程引文格式：文栩,王志磊,袁佳璐,等.自然发酵与接种发酵“户太8号”葡萄酒品质及真菌微生物多样性分析J.食品科学,2023,44(14):181-189.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220618-184.http:/WEN Xu,WANG Zhilei,YUAN Jialu,et al.Quality characteristics and fungal diversity during natural and inoculated fermentation of“Hutai8”wineJ.Food Science,2023,44(14):181-189.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220618-184.http:/“户太8号”葡萄属于欧美杂交种，由陕西西安葡萄研究所选育而得，是陕西主栽葡萄品种之一。近年来，陕西“户太8号”葡萄的种植面积与产量逐年增长，存在成熟期集中及季节性相对过剩等问题，影响了“户太8号”葡萄种植的经济效益。“户太8号”作为鲜食葡萄，并不常用来酿酒，梁艳英等1以“户太8号”作为原料酿造冰酒，但涉及到真菌微生物多样性方面的发酵研究很少。使用“户太8号”葡萄酿酒既可以避免因滞销及雨热同季气候造成的腐烂浪费，又可以增加产品附加值，提高果农的经济效益。葡萄酒的发酵主要有两种方式：一种是酿造过程中不人为添加商业酵母、SO2等辅料，依靠葡萄携带的本土微生物进行发酵的自然发酵；以及接种活性酵母进行发酵的控制性发酵方式。自然发酵能够产生具有地域特色的风味复杂的特色葡萄酒，展现葡萄酒的地域风格2。同时，自然发酵也会给酿造过程带来不可预测的风险3，且不同的栽培管理方式也会对葡萄酒真菌菌落结构产生影响4。近年来，国内外对自然发酵葡萄酒的研究越来越多5。且研究方向主要集中于挥发性香气物质6-7与真菌菌落组成的关系8。葡萄酒有机酸通常随着酿造过程中从葡萄转移至葡萄酒中，其种类、浓度都与葡萄酒品质有着很大关系9。本研究以“户太8号”葡萄为原料，使用自然发酵与接种发酵两种方式进行葡萄酒酿造，研究两种发酵方式“户太8号”葡萄酒中基本理化指标、有机酸成分、挥发性风味物质和真菌微生物多样性的变化，深入研究“户太8号”发酵过程中真菌微生物多样性变化与葡萄酒品质的相关性，旨在为“户太8号”葡萄酒发酵方式选择及风味改良提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料葡萄品种“户太8号”，采自陕西西安鄠邑区崔家湾村（东经108.6，北纬34.1），采收时间为2020年10月，原料含糖量170g/L，可滴定酸3.60g/L（以酒石酸计）。1.2 仪器与设备GC-2014C气相色谱仪 日本岛津公司；1260infinityII高效液相色谱仪 德国安捷伦公司；IQ7000超纯水机 密理博中国有限公司；SBA-40D生物传感分析仪 山东科学院生物研究所。1.3 方法1.3.1 发酵方法采用小容器酿造法进行葡萄酒的发酵。将“户太8号”葡萄除梗破碎，并调整葡萄醪糖质量浓度为216g/L，分装于5L发酵罐中分别用于自然发酵和接种酵母。发酵罐提前进行高温高压灭菌处理，每组用3 个发酵罐进行发酵。自然发酵组（记为ZF）：直接进行发酵；接种发酵组（记为SF）直投接种200mg/L的商业酵母（酿酒酵母SY，安琪酵母股份有限公司）进行发酵。预实验表明，发酵温度为20 的葡萄酒表现出良好品质，因此确定发酵温度为20。每天测定葡萄酒基本理化指标以监测葡萄酒发酵过程。并在两种发酵方式的除梗破碎阶段、发酵初期（葡萄醪中糖含量刚开始明显降低）、发酵中期（葡萄醪中糖含量变为原来的一半）、发酵末期（葡萄醪中糖质量浓度4g/L）进行取样。分别记除梗破碎阶段、发酵初期、发酵中期、发酵末期为发酵0、1、2、3阶段，自然发酵葡萄酒在1、2、3阶段的取样分别记为Z1、Z2、Z3，接种酵母葡萄酒在1、2、3阶段的取样分别记为S1、S2、S3。由于在除梗破碎阶段两种发酵方式未进行差异化处理，因此统一计为Z0。取样前先将每个发酵罐中的发酵液搅拌混匀，后从发酵罐上中下3 个不同位置取15mL酒样装入离心管立刻用液氮冷冻，并贮存于超低温冰箱中（80）用于有机酸含量、挥发性风味物质及真菌多样性测定。1.3.2 发酵过程中葡萄酒样品的高通量测序葡萄酒发酵过程中真菌微生物的高通量测序工作委托深圳华大基因股份有限公司完成。取质量合格的基因组DNA样品30ng及对应的融合引物配制聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）体系，设置PCR参数进行PCR扩增，使用AgencourtAMPureXP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于ElutionBuffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent2100Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。下机数据过滤，剩余高质量的cleandata用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；将生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 183tags聚类成可操作分类单元（operationaltaxonomicunits，OTU）并与数据库比对、物种注释；基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析，以及关联分析与模型预测等。序列拼接使用软件FLASH（v1.3.11），利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的tags。利用软件USEARCH（v7.0.1090）将拼接好的tags聚类为OTU。1.3.3 葡萄酒基本理化指标测定指标测定基于王华10方法，葡萄酒中还原糖含量采用菲林试剂热滴定法测定；可滴定酸采用酸碱滴定法测定；pH值使用pH计进行检测；可溶性固形物采用手持糖量计进行测定；乙醇体积分数采用SBA-40C生物传感器测定。所有指标均重复测定3 次。1.3.4 发酵过程中葡萄酒有机酸的测定使用高效液相色谱法。取一定量发酵液，加入离心管中，5 000 r/min离心10 min，取上清液用超纯水稀释至2 倍，过0.22m滤膜，并收集滤液进行分析。色谱柱：BIO-RADAminexHPX-87H（300 mm 7.8 mm）；色谱柱温55；流速0.5mL/min；进样量为20L；紫外检测器；检测波长215 nm。流动相：5 mmol/L硫酸溶液。1.3.5 发酵过程中葡萄酒挥发性风味物质的测定使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱对发酵液的挥发性风味物质测定11，每个样品重复测定3 次。固相微萃取：将待测发酵液10 000 r/min离心5 min，取2mL上清液加入20mL顶空瓶中，用超纯水将发酵液稀释4 倍，加入2gNaCl，再加入40g/L2-辛醇溶液作为内标，拧紧瓶盖，于40 磁力搅拌15 min，然后插入已活化或解析过的萃取头，于40 搅拌30 min，待挥发性物质在三相（顶空、萃取头和液体部分）中分布达到平衡，取下萃取头，立即送至气相色谱进样口，230 热解吸5 min。色谱条件：载气为高纯度氦气（纯度99.999%），流速为1mL/min；温度控制程序为：先升温至40 并持续5 min，再以2/min速率升至130，随后以5/min 速率升至220 并持续10 min。质谱条件：采用不分流模式进行，电子电离源；全扫描模式，扫描范围35350 u；离子源温度为200；进样口温度为230；电子能量为70 eV；连接杆温度为220。挥发性风味物质的定性及相对定量：通过与标准品在相同检测条件下的保留时间、质谱图特征离子对比，结合NIST 2017质谱数据库对挥发性风味物质进行定性定性，并通过内标物进行相对定量分析。1.4 数据处理采用MircosoftExcel2019软件进行数据整理；IBMSPSSStatistics26、TheUnscramberX10.4软件进行化学计量学分析；Origin2021软件进行作图。2 结果与分析2.1 两种发酵方式葡萄酒基本理化指标如表1所示，两组均可以正常完成乙醇发酵（总糖4g/L），达到干型酒的标准。然而自然发酵组发酵时间为15d，远高于接种酵母组（发酵时间为7d）。自然发酵组酒样可滴定酸含量高于接种酵母组，pH值低于接种酵母组。此外，接种酵母组酒样乙醇体积分数为11.17%，接近潜在酒度12%，然而自然发酵组酒样乙醇体积分数为8.33%，表明自然发酵乙醇发酵速率及乙醇转化效率均比接种发酵低。两组酒样可溶性固形物含量无显著差异。表 1 两种发酵方式葡萄酒基本理化指标Table 1 Major physicochemical indexes of wine from natural and inoculated fermentation组别可滴定酸质量浓度/（g/L）总糖质量分数/（g/L）pH可溶性固形物质量分数/%乙醇体积分数/%发酵时间/dZF5.180.10a3.743.15a3.630.02b6.330.21a8.330.29b15SF4.690.05b1.720.08a3.940.02a6.530.18a11.170.29a7注：同列不同小写字母表示差异显著（P0.05）。2.2 两种发酵方式的有机酸含量葡萄酒中的有机酸按其来源主要可分为两大类，一类是来源于葡萄浆果，如苹果酸、柠檬酸、酒石酸等12-13；一类来源于酵母或细菌的代谢，如琥珀酸、乳酸和乙酸等14。这些有机酸的含量与组成决定葡萄酒的酸度，对葡萄酒的口感也存在重要影响15。由图1a可知，采用两种发酵方式进行葡萄酒发酵的过程中，两组柠檬酸含量均呈现出下降趋势。接种酵母组在除梗破碎阶段及发酵初期两个阶段柠檬酸含量下降速率较快，而自然发酵组则在下个阶段内柠檬酸含量下降速度快（即发酵初期及中期）。发酵中期后两组柠檬酸含量无显著差异。由于接种发酵组中酿酒酵母是优势菌种，发酵过程旺盛，在发酵初始阶段糖可能无法满足酵母的需要，而柠檬酸作为碳源迅速被微生物代谢，致使柠檬酸含量下降16。酒石酸作为葡萄和葡萄酒的主要成分对葡萄酒品质可产生较大影响。一些乳酸菌也可以代谢酒石酸，生成乳酸和乙酸17。由图1b可知，在发酵过程中，酒石酸含量逐渐降低，且在两种发酵方式的相同阶段含量无显著差异，变化趋势相似。发酵末期接种酵母组酒石酸含量相对较高，而自然发酵组酒石酸含量较低，可能是自然发酵过程中的杂菌导致酒石酸被分解。苹果酸是果汁最重要的组成成分之一，酸性较强，具特殊香气。但当其含量较高的时候，会给口腔带来刺激感。由图1c可知，待发酵结束时，两组苹果酸含量相近。184 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程乳酸是葡萄酒发酵过程中产生的有机酸，口感柔和，可用于改善葡萄酒的结构感。由图1d可知，在除梗破碎阶段，葡萄醪中未检测出乳酸。其中自然发酵组在发酵初期乳酸大量生成，而接种酵母组乳酸生成量较少。接种酵母组由于添加了商业酵母，其快速生长抑制了乳酸的代谢活动菌，如酒酒球菌和乳酸杆菌18，同时，较高水平的乳酸不会给葡萄酒产生较大问题19。我们发现，当发酵结束时，自然发酵组相较于接种酵母组乳酸含量增加，但苹果酸含量无明显差别，可能是因为存在苹果酸回补代谢途径，将丙酮酸或其他物质转化为苹果酸。琥珀酸是一种口感较复杂的有机酸，其来源为酵母菌代谢以及谷氨酸转化，琥珀酸的含量对葡萄酒口感具有很大影响。由图1e可知，在葡萄酒发酵过程中，两组酒样琥珀酸的含量逐渐增加，接种发酵组琥珀酸的增加较为平稳，而自然发酵组则是在发酵初期及发酵中期琥珀酸含量有显著增幅。发酵中期及发酵末期，两种发酵方式酒样中琥珀酸含量相似。推测由于发酵初期接种酵母组的酵母菌相较于自然发酵组活跃，因此葡萄酒中琥珀酸产生量大于自然发酵组。少量乙酸可丰富葡萄酒的口感，含量过高则会产生不愉快的气味。从图1f可以看出，发酵过程中自然发酵组乙酸含量逐渐增加，而接种酵母组酒样中乙酸含量先有少许降低，后略微增加，发酵末期乙酸含量是自然发酵组乙酸含量的48.48%。葡萄酒中理想的乙酸质量浓度约为0.10.3g/L。可以看出，自然发酵葡萄酒中的乙酸质量浓度较高（0.66mg/L），表明自然发酵在发酵过程中存在破败风险，但未超过GB/T 150372006葡萄酒的规定。0.0002130.060.040.08a0.02?/?g/L?ZFSF0.402131.20.81.61.01.4b0.6?/?g/L?ZFSF0.802131.61.22.01.41.8c1.0?/?g/L?ZFSF0.002130.80.41.20.61.0d0.2?/?g/L?ZFSF0.202130.60.40.8e?/?g/L?ZFSF0.00.202130.60.41.00.8f?/?g/L?ZFSFa.柠檬酸；b.酒石酸；c.苹果酸；d.乳酸；e.琥珀酸；f.乙酸。图 1 两种发酵方式有机酸含量的变化Fig.1 Changes in organic acid contents in wine during natural and inoculated fermentation2.3 两种发酵方式挥发性风味物质的变化如表2所示，共计检测得到52 种挥发性风味物质，主要包括酯、醇、醛、酮、脂肪酸及其他六大类化合物。其中酯类和醇类是葡萄酒中最主要的风味物质，酯类25 种，占比48.08%；醇类17 种，占比32.69%；醛类5 种，占比9.6%；酮类和酸类各2 种，占比3.84%。由表2可知，在除梗破碎阶段，葡萄醪中存在22 种挥发性风味物质，其中青叶醛和苯乙醛为这个阶段葡萄醪中独有，发酵开始后消失。随着发酵的进行，葡萄酒中挥发性风味物质种类逐渐增多。自然发酵组在发酵末期存在33 种挥发性风味物质，其中酯类16 种，醇类13 种。自然发酵组发酵过程中，产生的特有的挥发性风味物质有8 种，分别为异戊酸乙酯、甲酸丁酯、乙酸庚生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 185酯、2-羟基丁酸乙酯、3-羟基十八烷酸甲酯、十四酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、十一烯醇。接种酵母组在发酵末期存在41 种挥发性风味物质，其中酯类22 种、醇类14 种。接种酵母组发酵过程中产生的特有挥发性风味物质有2 种，分别为丙酸乙酯和顺-3-壬烯-1-醇。表 2 7 个样品挥发性风味物质种类Table 2 Changes in types of volatile flavor substances during natural and inoculated wine fermentation样品编号酯类醇类醛类酮类脂肪酸类其他 总计Z068511122Z1105412123Z21311211129Z31613012133S1209222136S22111122138S32214112141如图2所示，随着发酵的进行，葡萄酒中的挥发性风味物质开始积累。在发酵初期，两组酒样挥发性风味物质总量相近，其挥发性风味物质组成结构也较为相似；发酵中期和发酵末期，自然发酵组酯类的相比含量继续增加，而组酯类风味物质的相对含量逐渐降低。发酵末期，自然发酵组醇类比接种酵母组高了12.5%，主要集中在苯乙醇；而自然发酵组酯类含量是接种酵母组的10.11 倍；其乙酸乙酯含量是接种酵母组的12.27 倍；自然发酵组的脂肪酸类挥发性风味物质只有接种酵母组的10.40%。080100a604020?/%?Z0Z1Z2Z3S1S2S3?0800 0001 200 0001 000 000b600 000400 000200 000?/?g/mL?Z0Z1Z2Z3S1S2S3?a.比例图；b.含量图。图 2 不同发酵方式挥发性风味物质组成Fig.2 Changes in contents of volatile flavor compounds during natural and inoculated wine fermentation 对两种发酵方式不同发酵阶段挥发性风味物质成分进行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA），结果如图3所示。葡萄酒挥发性风味物质通过PCA后提取2 个PC，这2 个PC可以反映全部信息的61%。可以看出，7 个葡萄醪/酒样品主要聚为4 部分。自然发酵组（Z1、Z2、Z3）PC1正方向，接种酵母组（S1、S2、S3）位于PC1负方向，Z0位于第1坐标轴0点附近，差异明显。在PC2上，未开始发酵的Z0组位于坐标轴正方向，而已经开始发酵的S1、S2、S3、Z2、Z3组位于坐标轴负方向。Z1位于PC20点附近，可能是因为Z1组自然发酵刚开始时发酵速率较慢，这个阶段产生的新挥发性风味物质较少。图中可以很明显区分开Z0与其他组样品。此外，在图中无法区分S1、S2、S3，说明接种酵母产生的挥发性风味物质较为相似。图中也无法区分Z2和Z3，表明在自然发酵中期和末期，葡萄酒挥发性风味物质较为相似。?5?10?50510015105PC2?29.1%?PC1?31.9%?S1S2Z1S3Z0Z2Z3图 3 葡萄酒挥发性风味物质的PCA图Fig.3 PCA plot of volatile flavor compounds in wine2.4 两种发酵方式真菌微生物多样性的变化2.4.1 物种丰富度与多样性分析表3反映了两种发酵方式不同样品真菌群落多样性指数及物种丰富度。覆盖率为测序深度指数，其值越高，则样品中序列没有被检测出的概率越低。可以看出，所有样品的覆盖率均大于99.98%，表明本次样品测序深度足够，本次测序结果能够代表样品的真实情况。表 3 不同样品真菌物种丰富度及群落多样性指数Table 3 Species richness and diversity indexes of fungal community in different wine samples样品编号 Sobs指数Chao指数 Shannon指数 Simpson指数 覆盖率/%Z073.6779.711.480.3599.99Z150.0060.881.110.5399.98Z232.3345.170.980.4999.99Z334.3364.500.780.6199.98S125.3328.580.180.9499.99S222.6727.670.090.9899.99S321.0024.680.050.9999.99丰富度指数不考虑每个物种的相对丰度，给予相对丰度高的物种与相对丰度低的物种相同权重20。除梗破碎样品的Sobs指数与Chao指数均为最大，说明在除梗破碎时期，186 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程葡萄醪中物种丰富度最高。发酵起始阶段（发酵1阶段），接种酵母组的Sobs指数与Chao指数迅速降低为原来的34.38%和35.85%，说明在接种酵母后，酒样中物种丰富度迅速降低。随着发酵的进行，接种发酵组的物种丰富度逐渐降低，Sobs指数和Chao指数均有所下降。自然发酵组的发酵初期相较于除梗破碎阶段，两指数也有所降低，但降幅没有接种酵母组大，表明在不进行认为干预的情况下，葡萄醪中也会缓慢发生群落演替。随着发酵的进行，与接种发酵组相似，自然发酵组的物种丰富度也逐渐降低。但在发酵结束阶段（发酵3阶段），相较于上一阶段，自然发酵组的Sobs指数与Chao指数均有所增加，说明这个过程中有新的物种出现，这个现象在接种发酵组中未观测到。物种多样性指数反映物种丰富度和均匀度的综合状况，常见的有Shannon、Simpson、Invsimpson指数等。Shannon指数反映物种丰富度与不同种类物种丰度的均匀性，而Simpson指数为在样本中抽取两条序列属于不同种的概率。随着发酵过程的进行，自然发酵组与接种发酵组的Shannon指数均在逐渐降低，Simpson指数均在逐渐升高，说明发酵过程中真菌多样性在逐渐降低，存在优势物种。而自然发酵组各阶段的Shannon指数均较接种发酵组高，Simpson指数均较接种发酵组低，说明自然发酵过程中的真菌多样性比接种酵母过程更为丰富。2.4.2 葡萄酒样品物种分类注释分析对两种发酵方式发酵过程中的样品进行高通量测序并进行物种分类注释，其结果如表4所示。两种发酵方式葡萄酒样品中共检测到2 个门，分别为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。样品中的微生物大多属于子囊菌门，少数为担子菌门。其中除梗破碎阶段的子囊菌门相对丰度最低，为95.27%，而其他几组子囊菌门的相对丰度均达到了98%。除梗破碎共检测出41 个目和59 个属，在发酵初期，自然发酵组共检测出了31 个科46 个属，接种发酵组检测出了24 个科及27 个属。在发酵末期，自然发酵组检测出了28 个科32 个属，接种发酵组检测出了17 个科18 个属。表 4 两种发酵方式葡萄酒样品物种分类统计Table 4 Statistics of fungal community composition in wine samples from natural and inoculated fermentation样品编号门纲目科属Z0211194159Z129143146Z228132836Z328132832S128132427S227122124S327121718图4展示了两种发酵方式不同阶段在属水平物种分布情况。随着发酵进程推进，两种方式属水平数量都依次减少，其中接种发酵的属水平数量比自然发酵少。在属水平，本次测序所检出的微生物主要包括链格孢属（Alternaria）、青霉属（Penicillium）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、枝孢属（Cladosporium）、酿酒酵母属（Saccharomyces）、枝顶孢属（Acremonium）和其他（others）。链格孢属是来自全球不同酿酒地区主要酿酒葡萄菌群的一部分21。作为一种病原体，它有可能在高压条件下引起葡萄果实腐烂。此外，据报道，链格孢菌菌株会在葡萄上产生AOH和AME真菌毒素22，具有潜在的毒理学风险。青霉属一般认为是酿酒葡萄的致病因子，是葡萄园中分离出来的最常见属之一。在葡萄酒酿造过程中，可以产生青霉毒素23和异味，如蘑菇味和泥土味24。有孢汉逊酵母属是葡萄酒中常见的非酿酒酵母，通常在发酵初期占据优势，并对葡萄酒的感官具有显著影响25。有孢汉逊酵母属可以分泌多种水解酶，增加葡萄酒中乙酸苯乙酯含量26，提高香气含量和复杂性，但也有可能产生过多的乙酸乙酯27。枝孢菌属是葡萄园中常见的病害微生物，它们以附生植物的形式存在于葡萄藤和其他寄主上，并经常出现在空气中28，通常感染可溶性固形物含量大于15%或存在机械损伤的葡萄29枝孢菌属感染会造成葡萄酒的果香（如脂类、内酯、酮和醇）损失，并对葡萄酒颜色造成负面影响30。酿酒酵母属是葡萄酒发酵过程中最重要的微生物，它促进乙醇发酵，将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，并产生大量副产物31。枝顶孢属是一种常见的真菌，主要为植物寄生、腐生和自生。其次生代谢产物具有良好的生物活性，如枝顶孢素对葡萄霜霉的孢子萌发具有抑制作用32，枝顶孢属的枝顶孢（Acremonium coenophilum）对多种体外培养的农作物病原真菌也具有抑制作用33。枝顶孢属真菌在工业上也常用来生产头孢菌素C34。080100604020?/%?Z0Z1Z2Z3S1S2S3AlternariaPenicilliumSaccharomycesAcremoniumHanseniasporaCladosporiumothers图 4 属水平物种分布柱状图Fig.4 Fungal community distribution at the genus level在除梗破碎葡萄醪中支孢属和枝顶孢属的真菌相对丰度最多，分别为占比30%和50%，酿酒酵母属仅占生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 1870.5%。发酵过程中接种发酵组由于人为添加酿酒酵母，酿酒酵母属相对丰度最大，占据绝对优势，发酵初期、中期、末期分别占比96.80%、98.75%和99.35%。而自然发酵组中，发酵初期有孢汉逊酵母属的相对丰度最大，为70.55%，其次是枝孢属，为14.72%，酿酒酵母属占比1.37%。随着发酵的进行，发酵中期自然发酵组有孢汉逊酵母属相对丰度降低，为39.20%；逐渐让位于酿酒酵母属，酿酒酵母属相对丰度增加，为57.04%。在发酵末期，酿酒酵母属相对丰度继续增加，达到75.34%，与接种发酵组不同，其有孢汉逊酵母属仍有21.91%的相对丰度。在除梗破碎阶段，葡萄表面附着的各种微生物进入葡萄醪中，其中包括各种霉菌（如链格孢属、青霉属、枝孢菌属等）、酵母菌（如有孢汉逊酵母属、酿酒酵母属等）以及与对霉菌有抑制作用的菌类（如枝顶孢属等）。在接种酵母的过程中，葡萄所携带真菌的相对丰度迅速降低，并随着发酵过程的进行其种类和丰度继续降低，发酵醪中以酿酒酵母属为绝对的优势菌种，占据主导地位。一方面，引入商业酿酒酵母后，在适宜的环境下（葡萄醪中），酿酒酵母大量生长，挤压了原始菌群的生活资源；同时代谢产生乙醇，对其他菌群产生抑制作用，而自己对乙醇具有较高耐受性。而自然发酵葡萄酒在发酵开始阶段，有孢汉逊酵母属占据主导地位，因为其具有较高的糖耐受性；随着发酵的进行，耐乙醇能力强的酿酒酵母丰度逐渐增加，并在发酵的中后期逐渐占据主导地位。同时也发现，自然发酵过程中，没有哪类菌种具有绝对的优势地位（如接种发酵组所表现），在发酵初期，枝孢菌属的相对丰度仍有14.72%，而在发酵末期有孢汉逊酵母属也有21.91%的相对丰度。这可能是因为葡萄表皮携带的有孢汉逊酵母生存能力强，而其携带的酿酒酵母嗜杀性或产乙醇弱（自然发酵组仅能产生8.33%的乙醇，而接种发酵组可以产生11.17%的乙醇）。在接种酵母过程中，葡萄所携带的霉菌的生长早早就被抑制，在未发生大量感染的情况下各种霉菌对葡萄酒产生的负面影响较小。而自然发酵过程中各种霉菌在葡萄醪中有较长时间的出现，且不易控制，可能会对葡萄酒品质有负面影响，并有可能产生有害物质。通过有机酸测定，发现自然发酵葡萄酒样品中乙酸含量是接种酵母的2.06 倍。因此，需要进一步研究以评估自然发酵过程中原始菌群对葡萄酒品质及有害物质累积的影响。2.4.3“户太8号”葡萄酒样品物种多样性分析采取了21 个样品的OTU数据进行主坐标分析（principalco-ordinatesanalysis，PCoA），以研究葡萄酒样品间真菌群落组成的物种多样性。如图5所示，PCo1贡献率为77.94%，PCo2贡献率为23.44%，表明图有较好的解释效果。分析PCo1方向上，Z0组与其他处理组可以在PCo1区分，PCo1反映的因素应为发酵与否，能解释不同处理组微生物种群差异的77.94%；在PCo2方向，Z0组处于0点附近，S1、S2、S3组样品主要处于正坐标轴方向，Z1、Z2、Z3组样品主要处于负坐标轴方向，具有较好的区分，PCo2反映的因素应为自然发酵还是接种酵母，能够解释不同处理组微生物种群差异的23.44%。S1、S2、S3组在PCoA图中聚在一起，表明其组间微生物多样性差异不显著。随着发酵的进行，自然发酵组逐渐靠近接种酵母组，其组间微生物种群差异逐渐降低。?0.8?1.5?1.0?0.50.00.5?0.2?0.4?0.60.40.20.0PCo2?23.44%?PCo1?77.94%?S2Z3Z1S3Z0S1Z2图 5 不同发酵方式样品的PCoA图Fig.5 Principal coordinate analysis plot of wine samples from natural and inoculated fermentation 2.4.4 真菌微生物多样性与挥发性风味物质相关性分析葡萄酒的挥发性风味物质与葡萄酒酿造过程中微生物的活动有很大关系。选取自然发酵组与接种发酵组发酵结束阶段真菌属微生物作为自变量X，两种发酵方式发酵结束阶段的挥发性风味物质作为因变量Y，利用TheUnscramberX10.4软件进行偏最小二乘（partialleastsquares，PLS）法分析，结果如图6所示。通过软件分析，选择两个PLS模型预测因子，两因子对自变量X有81%和12%的解释率，对因变量Y有62%和12%的解释率。变量点基本位于75%95%方差置信区间内，证明两因子对X和Y均有较好的解释。酿酒酵母与其他菌种分别位于X轴两侧，表明两者呈负相关。青霉菌属（Penicillium）位于第1象限，与2-丁烯酸乙酯和乙酸苯乙酯距离较近。有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、链格孢属（Alternaria）、枝顶孢属（Acremonium）、枝孢属（Cladosporium）位于第4象限，与乙酸乙酯、顺-3-壬烯-1-醇、苯甲醇、苯乙醇、正己醇距离较近，说明其相关性较强。酿酒酵母属（Saccharomyces）位于第4象限，与大多数挥发性风味物质距离较近，说明酵母菌属真菌是葡萄酒挥发性风味物质的重要来源。通过对葡萄酒进行真菌菌群结构与挥发性风味物质相关性分析，可以发现除酵母菌外大多数真菌与挥发性风味物质的醇类相关性较强，如苯乙醇、苯甲醇、正己醇以及顺-3-