植物组织原位杂交.doc

植物组织原位杂交

一、植物材料的固定和包埋
在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡瓶（瓶盖高压湿热灭菌）、烧杯、量筒和药勺均需180℃烘5 hr以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。切割后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。

第一天
一、配制甲醛溶液（按300 mL量为例）
1、 用三角瓶配制300 mL PBS缓冲液，加入1粒NaOH，摇动溶化。
2、 把上述溶液在微波炉中加热（通常用600 W，1 min，一般不超过60℃）。
3、 在通风橱中往三角瓶中加入4%多聚甲醛、0.1% tween、0.1% triton（分别是12 g，300 μL，300 μL），然后用parafilm封口，摇匀直到完全溶解。包埋水稻时还要再加3 mL25%的戊二醛。
4、 置于冰上降至室温，用硫酸调pH 至7.0。
5、 -20℃分装保存备用（一般用20 mL的小瓶，倒满至18 mL左右）。
6、 分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用，-20℃分装保存备用的只能冻融一次。

二、固定材料
1、 取植物新鲜材料，切至适当大小。注意：所固定的材料越小越好，尽可能切除无用多余的部分。
2、 把切块投入装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（一般切块为15×5×3 mm时，每瓶中的切块数不多于5个）。固定液：材料 ≥ 20：1
3、 材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数min，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准）。抽气减压时，尽量不要时液体过分沸腾。有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。
4、 抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。
5、 更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。
注意：多聚甲醛有剧毒，药品的称取和溶液的配制必须在通风橱内进行！多聚甲醛极易飞散，称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及时清理。
第二天 按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭菌过的双蒸水）。
1、0.85% NaCl 冰浴，30 min
2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴， 5 hr
3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴 ，5 hr
4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜
注意：进入50%乙醇后，材料应开始脱色。
第三天
1、95%乙醇/水 4℃，5 hr
2、100%乙醇 4℃，5 hr
3、100%乙醇 4℃，过夜
注意：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。
第四天
1、100%乙醇 室温，2 hr
2、50%乙醇/50% 二甲苯 室温，1 hr
3、100% 二甲苯 室温，1 hr
4、100% 二甲苯 室温，1 hr
5、100% 二甲苯 室温，1 hr
6、50% 二甲苯/50%石蜡 58℃，过夜（使用熔蜡台）
注意：使用二甲苯 后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。
第五至七天
每天换两次100%石蜡（58℃），倾倒时避免产生气泡。
注意：在换石蜡前1~2 hr，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。
第八天
纸盒处理：将折好的纸盒于氯仿中泡一会，取出晾干。（废氯仿可回收重复利用）
包埋蜡块：将大小合适的包埋用纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把一个材料（有时可多至2~3个）放到此盒内。用加热的解剖针迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。当石蜡表面凝固形成一层薄膜时，平放入冷水中，数s后翻转蜡块。约30 min后取出，放在有吸水纸的塑料盒中晾干。包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。

二、载玻片和盖玻片的处理
1、 洗液（2%HCL+70%乙醇溶液： 74 mL 95%乙醇+2 mL浓HCL+24 mL H2O）浸泡过夜，流水冲洗干净，同时用戴手套的手摸洗。
2、 准备4烧杯的双蒸水和3烧杯的95%乙醇，将洗好的载玻片依次经过这7个烧杯，每次间隔10 min。
3、 载玻片经酒精灯烧干后，放在折好的锡箔纸上通风橱中晾干，最后用锡箔纸包裹。
4、 180℃烘5 hr。
5、 待载玻片冷却，加4 μL多聚-L-赖氨酸（1 mg/mL）于一端，用盖玻片（已经过180℃烘5 hr处理）的一边接触液滴，进行涂片。涂片时应观察到“虹膜”的形成。
注意：若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。
6、 涂片之后放入37℃的烫板中干燥过夜（最短可以4 hr），然后放入切片盒中，经过处理的载玻片应尽快（一周内）使用。
7、 盖玻片的处理：用丙酮处理15 min，通风橱中晾干，用锡箔纸包裹。180℃烘5 hr。
8、 最后封片用的盖玻片不需要做任何处理。使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。但一般也经过处理较好。

三、切片和展片
1、 修块，操作同普通切片，将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。用刀片将蜡块修成梯形，在材料的周围各留2 mm的石蜡即可（尽可能少留）。
2、 切片，厚度为7~10 μm。在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。
3、 展片。将DEPC处理过的蒸馏水（不用DEPC处理也可）滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，将蜡带漂浮于其上放入烫板上（37℃）进行展片。蜡带完全展开后（数分钟至数十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不开裂为度），吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。置于37℃烫板上干燥过夜。
4、 制好的片子应在一星期内进行杂交。

10×PBS (1.3 M NaCl, 0.03 M Na2HPO4, 0.03 M NaH2PO4)
NaCl 74 g
Na2HPO4 9.94 g
NaH2PO4 4.14 g
in 1 L ddH2O. pH 6.5~7.0（无需调，配好刚好在此范围内）