大肠菌群检验.ppt

二、大肠菌群的定义及检测方法,1、大肠菌群的传统定义 大肠菌群（Coliform group）系指一群需氧及兼性厌氧，在37 24小时能发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 包括肠杆菌科的艾希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。其中以艾希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属习惯上称为典型大肠杆菌。2、大肠菌群检验的标准方法（1）最近拟数法（MPN）（GB4789.2-1994）,第一页，共13页。,样品 0.1g3 0.01g 3 0.001g 3 乳糖胆盐发酵管 37 24hr 产酸产气管 伊红美蓝平板（分离） 37 24hr可疑菌落 乳糖发酵管（证实） 37 24hr 根据经证实的乳糖胆盐发酵管 阳性管数，查MPN表。,第二页，共13页。,（2）平板直接计数法（SN0169-92）,样品 0.1g2 0.01g 2 0.001g 2 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）37 24hr 计数紫红色菌落，乘以稀释倍数报告,第三页，共13页。,3、ISO关于大肠菌群的定义（ISO9308-1：2000）（ISO：INTERNATIONAL STARDIZATION ORGANIZATION国际标准化组织）,大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，可需氧或兼性厌氧地生长在含胆盐（或其他具有同样抑制生长性能的表面活性剂）的培养基上，当在36 2培养时，通常能于48hr内发酵乳糖产酸和醛。它们还具有-半乳糖苷酶。,第四页，共13页。,4、依据-半乳糖苷酶快速测定大肠菌群的原理,大肠菌群产生的-半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基与-半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反应灵敏快速。 测定-半乳糖酶常用的底物有4-甲基伞形酮-D半乳糖苷（MUGal）、5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）、3，4-环已酮-D-半乳糖苷和8-羟基喹啉-D-半乳糖苷等。1993年Brenner等人用加4-甲基伞形酮-D-半乳糖苷（MUGal）和吲哚氧基-D-葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌3，取得满意结果。1995年该方法被美国国家环境保护署采纳（Code of Federal Regulation 40,141.21 Protection Of Environment）。美国SIGMA公司有商品化试剂，但价格昂贵。 2000年James等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物茜素-D-半乳糖苷（Aliz-gal）。该试剂具有比同类酶底物更灵敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为脂溶性不扩散，易与辨别，另还可以和不同的阳离子（Fe、Al、K、NH4）形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内外均无商品化试剂出售。,第五页，共13页。,三、应用4-甲基伞形酮-D-半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群,1、检测步骤 样品 0.1g3 0.01g 3 0.001g 3 MUGal肉汤 37 24hr 在紫外光下观察产荧光管数，查MPN表得MPN值 大肠菌群-D-半乳糖苷酶 4-甲基伞形酮-D-半乳糖苷 4-甲基伞形酮（兰色荧光）,第六页，共13页。,MUGal肉汤： 胰蛋白胨20g 氯化钠5g 无水磷酸氢二钾2.75g 无水磷酸二氢钾2.75g 月桂基硫酸钠0.1g MUGal0.08g 水1000ml 加热使溶化，调Ph7.4，分装试管，每管10ml，116高压灭菌10min。待培养基冷却后，以无菌手续在每管培养液内加入0.1mL经过滤除菌的500ug/mL头孢磺啶稀释液。,第七页，共13页。,2、试验情况简介,当在MUGal肉汤中生长的大肠菌群数量较少时也可在紫外灯下呈现明显的蓝色荧光，反应较乳糖产酸显色快速灵敏，结果易读。以13株与肠杆菌科相关的标准菌株验证MUGal肉汤，其结果与在LST和乳糖胆盐肉汤中的乳糖发酵结果完全一致，符合相关菌株的特性。将自制MUGal与SIGMA产MUGal比较测试26份样品，两者阳性符合率为94.6%。以自制MUGal肉汤与LST肉汤比较检测66份样品中大肠菌群，其24h阳性检出率是LST肉汤48h的1.5倍，但延长LST肉汤培养时间至96小时后，两者结果逐步接近。表明MUGal多检出的阳性部分多为受伤生长缓慢或迟缓发酵乳糖的大肠菌群类菌株所致。,第八页，共13页。,将MUGal肉汤阳性管中的可疑菌株进行触酶、氧化酶和硝酸盐还原试验，并任选其中18株用API 20E鉴定。证明95.1%的MUGal肉汤阳性管中含有大肠菌群。 综上所述，自制MUGal肉汤检测大肠菌群灵敏、快速、准确，无需验证，可一次完成。自制MUGal性质稳定，无游离荧光，可替代昂贵的进口产品使用。鉴于以MUGal检测大肠菌群的方法早在1995年即为美国国家环境保护署采纳 ，有关大肠菌群具有-半乳糖苷酶的特性，也在ISO 9308-1:2000给予了明确的定义。因此，经过本次试验我们认为，以MUGal肉汤快速检测食品中大肠菌群作为一种推荐的标准方法加以应用是可行的。,第九页，共13页。,四、应用茜素-D-半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群,1、检测步骤 样品 0.1g2 0.01g 2 0.001g 2 Aliz-gal琼脂37 24hr 计数紫色和红色菌落，乘以稀释倍数报告 大肠菌群-D-半乳糖苷酶 茜素-D-半乳糖苷 茜素Fe.NH4.Al.K（紫色和红色）,第十页，共13页。,茜素-D-半乳糖苷琼脂（Alig-gal琼脂）：Aliz-gal 50mg蛋白胨20g无水磷酸氢二钾2.75g无水磷酸二氢钾2.75g氯化钠5g月桂基硫酸钠0.1g异丙基硫代半乳糖苷0.03g硫酸铝钾0.5g 柠檬酸铁铵0.5g琼脂15g蒸馏水1000mL。调Ph7.4,第十一页，共13页。,2、试验情况简介,Aliz-gal检测食品中大肠菌群可在18-24h内显示出半乳糖苷酶反应，在同类性质的酶底物中，Aliz-gal的用量较低，做倾注培养时在琼脂深层菌落特征较明显。由于采用测定-半乳糖苷酶的方法易于检出迟缓发酵乳糖的大肠菌群和厌氧大肠杆菌。所以，本试验与4-甲基伞形酮-D-半乳糖苷试验所得阳性结果都比各自的对比培养基的高。 试验证明用Aliz-gal作-半乳糖苷酶底物以平板直接计数检测食品中的大肠菌群，具有特异性强、速度快、准确率高、结果稳定的特点，可作为标准方法加以应用。,第十二页，共13页。,谢谢各位的聆听,第十三页，共13页。,