肝脏是人体具有消化.doc

肝脏是人体具有消化、解毒、排泄功能的重要器官。它的结构和功能比较复杂，很容易受到多种病理累及。肝脏疾病是严重危害人类健康的常见的疾病之一。若肝损伤医治不当会引发多种并发症，如感染、肝创面胆漏、继发性出血，严重时甚至会导致肝纤维化、肝硬化及肝癌等[1,2]。其中最常见的是各种急慢性肝炎，它是由于病毒、化学药品、乙醇、免疫反应等致病因子引起的肝脏炎症反应。另外脂肪肝、自身免疫性疾病所致的肝损伤也有较高的发病率。肝脏在糖、脂类、蛋白质、维生素、激素等物质代谢中均有重要作用[3]。说明肝脏是机体重要的代谢器官。急、慢性肝损伤临床表现常见有乏力、食欲减退、体重减轻、肝区疼痛、腹胀。通过检测血清生化学可见血清氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶升高、肝组织谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶降低、丙二醛和一氧化氮升高等不同程度的肝功能实验异常[4]。
对各种肝脏疾病发病机制的深入探讨与治疗药物的筛选，很大程度上依赖于和人类肝病病理机制相似的实验动物模型的建立与应用[5，9]。在有关文献和实验指导书上已明确指定新药的药理实验方法以及原理。应用CCl4、D-GalN肝损伤动物模型是目前公认的，有保肝降酶作用的新药的药理实验[6]。CCl4多用于急性肝损伤模型的建立应用有着技术易于掌握、可靠性强、实验条件要求低、重复性好等优点。慢性CCl4肝损伤实验是根据反复多次给药造成慢性肝中毒[7]。D-氨基半乳糖胺（D-GalN）动物模型也是目前应用广泛的经典肝损伤模型之一，可诱发急性和慢性肝损伤。是一种选择性损害肝脏的肝干细胞的碳硫尿嘧啶核苷的干扰剂。D-GalN急性化学性肝损伤的特点是只在肝脏中发生病变，其他脏器没有任何影响[8]。对实验人员安全无毒。卡介苗加脂多糖(BCG/LPS)诱发小鼠免疫性肝损伤模型也是目前常用的经典模型，它的部分方法难度比化学性肝损伤模型较大[9,10]。
维吾尔医药是中华民族传统医学重要组成部分，是研究和开发新药的宝库。维吾尔族人民在与疾病不断做斗争过程中建立了医学体系并且在治疗肝病方面有着一定的优势。因此我们可以认为从维吾尔医药的宝库中发掘理想的抗肝炎的药物是目前的重要课题之一。
维药小茴香根皮为伞形科多年生草本植物小茴香(Foeniculum vulgare Mill)的干燥根皮。收录在部颁标准维吾尔药分册：夏秋采挖，剥取根皮，晒干。因含挥发油宜贮阴凉处。小茴香根皮性味：二级干热，味辛。功效：生干生热、成熟异常黏液质、散气退肿、通阻止痛、通经通尿、软便通肠。主治：湿寒性或黏液质性疾病，如湿寒性各种炎肿，两胁寒痛，腰背酸痛，闭经、闭尿、陈旧性肠梗阻等[11] 。《药物之园》中提到维药小茴香根皮为散发致病物质、补肝益脾、开通阻塞、祛寒止痛、补胃增视、解毒等；治肝脾疾病、肝、脾、肾、膀胱生阻，肝、脾、肾、膀胱寒性疼痛，胃脘虚弱，视力降低，毒虫叮伤等。
据研究证实,小茴香药材中主要含脂肪油、挥发油、甾醇及糖苷、氨基酸等,还含有三萜、鞣质、黄酮、强心苷、生物碱、皂苷、香豆素、挥发性碱、蒽醌、有机酸等多种类型化合物[12] 。小茴香果实中还含有丰富的维生素E、维生素B1、维生素B2、核黄素及胡萝卜素,且微量元素Fe、Cu、Zn、Mn、Se的含量也很高[13] 。
根皮含挥发油。成分含莳萝油脑（dillapiol)，α-松油烯（α-teerpinene)，L-松油烯，α-、β-蒎烯（α-，β-pinene)，β-月桂烯（β-pinene)，α-水芹烯（α-phellandrenc)，对伞形花素（p-cy-mene)，柠檬烯（limonene)等。尚含棕榈酸豆甾醇酯(stigmaster-yl palmitate),5-甲氧基呋喃香豆精(5-methoxyfuranocouma-rin),豆甾醇(stigmasterol)及伞形花内酯(umbelliferone)[11]。
现代药理研究证明,小茴香具有显著的抑菌[14,15]、调节胃肠机能[16,17]、利尿等作用[18,19],同时还具有利胆[17]、保肝[20,21]、促渗[22]、抗癌[23]、抗突变[24]及性激素样[25,26]等作用。小茴香油还可作驱风剂,在腹气胀时可排除气体,减轻疼痛[17]。还有治疗糖尿病、肾结石、支气管炎、慢性咳嗽等作用。
目前对小茴香的研究很全面，对其地上部位研究较多，但对根皮尚未研究。通过小茴香地上部位的研究我们得知小茴香有保肝作用，因此，本实验对维药小茴香根皮化学成分进行了初步研究，首次通过体内药理实验对维药小茴香根皮进行药效学研究，观察对CCl4、D-GalN所致的小鼠急性化学性肝损伤，BCG/LPS所致的急性免疫性肝损伤和CCl4诱导的慢性肝损伤保护作用及其可能的作用机制。确定维药小茴香根皮保肝有效成分，为以后的研究和开发利用提供科学依据。

2 实验方法
2.1 对维药小茴香根皮化学成分进行初步研究
样品制备：取一定量的维药小茴香根皮适当粉碎，即为试验品粗粉，备用。
2.1.1 水提取液的制备：
称取维药小茴香根皮粗粉10g，加入100ml蒸镏水室温浸泡过夜，滤过，取滤液10ml,供检查蛋白质、氨基酸和多肽等。剩余药渣恒温60℃水浴上加热回流30min，过滤，即得热水供试液。
2.1.2 乙醇提取液的制备：
称取维药小茴香根皮粗粉10g，加入95 %乙醇100ml，于水浴上加热回流 30min ,过滤，即得。 　
2.1.3 酸水提取液的制备:
称取60ml维药小茴香根皮粗粉2g，加入5%盐酸60ml，于水浴上加热回流 30min，过滤，即得。
2.1.4 石油醚提取液的制备：
称取维药小茴香根皮粗粉2g，加入石油醚(60~90℃) 20ml，密闭，室温放置，2h后，过滤，滤液放置蒸发皿中浓缩后即得。
2.2 维药小茴香根皮不同提取物的制备工作
经过对维药小茴香根皮进行生药鉴定后按照常规提取分离方法进行药材的提取分离，分别得到了醇提取物和水提取物。醇提取物经过依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇试剂萃取得到了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种提取物。技术路线如图所示：
2.3 维药小茴香根皮的急性毒性试验[29]
2.3.1 预实验
取25只昆明种小鼠，♀♂各半，体重18~22g 。随机分为空白对照组、醇提和水提共3组。空白组分5只小鼠，其它两组每组10只。禁食不禁水12h，配制成最大浓度的小茴香根皮醇提物和水提物，早晨和中午灌胃，容量为0.4ml/10g。连续观察小鼠在24h之内的精神、行为和死亡情况。随后解剖观察小鼠内脏有无病变。
2.3.2 最大耐受量（MTD）的测定
取60只昆明种小鼠，♀♂各半，体重18~22g。随机分成石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提共4组，每组15只。给药前用0.5%羧甲基纤维素钠配制成最大浓度的小茴香根皮石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提物。禁食不禁水12h后早晨、中午、晚上按0.4ml/10g容量进行灌胃。连续观察7d并每天称重记录体重。实验结束后解剖观察小鼠内脏有无病变。计算MTD值受量。用公式计算出耐受量倍数：小鼠的最大耐受量倍数＝每只小鼠的耐受量×成人平均体重（60kg）/小鼠平均体重（20g）×成人每日用量。

2.4 维药小茴香根皮不同提取物对CCl4引起的急性肝损伤模型的影响[16-18]
2.4.1 动物分组情况
取120只昆明种小鼠，♀♂各半，体重18~22g。随机分成12组，分别为正常对照组、模型组、溶剂组、阳性对照组（即联苯双酯组，0. 3 g·kg-1·d-1）、石油醚低剂量（0.2g·kg-1·d-1）、乙酸乙酯低剂量（0.9g·kg-1·d-1）、正丁醇低剂量组（1.1g·kg-1·d-1）、水提低剂量组（1.5g·kg-1·d-1），石油醚高剂量（0.4g·kg-1·d-1）、乙酸乙酯高剂量（1.8g·kg-1·d-1）、正丁醇高剂量组（2.2g·kg-1·d-1）、水提高剂量组（3g·kg-1·d-1），每组10只。正常对照组和CCl4模型组均给予蒸馏水，溶剂组给予0.5%羧甲基纤维素钠。其他各组分别给予相应的受试药物并给药前用0.5%羧甲基纤维素钠配成混悬液，qd×14d，每日灌胃前称体重调整灌胃量。
2.4.2 动物模型的建立方法[27]
第13天给药后1h，模型组与各给药组小鼠均ip 0.1% CCl4橄榄油溶液10 ml·kg-1。正常对照组和溶剂组ip等容量的橄榄油溶液，当日下午加强给药一次。随即禁食不禁水，24 h后进行最后一次称重，记录体重，随后处理小鼠。
2.4.3 动物处理方法及检查项目
每鼠摘眼球取血0.5~1.2 mL，血浆置于4℃冰箱中静置半个小时，3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，用BS-320型全自动生化分析仪检测血清ALT、AST的活性；断头处死小鼠，解剖取出肝脏和脾脏。随后用4℃生理盐水冲洗取出来的脏器，滤纸吸干水分，称重。脏器重量(g)/体重(g)×100% =脏器系数(% )。代入公式计算肝脏、脾脏系数；取小鼠肝右叶相同部位的肝组织在冰生理盐水中制成10%的肝匀浆；离心15 min 转速为3000 r·min-1，离心后取上清液放入-80℃冰箱保存。按说明书测定肝组织GSH-PX、SOD的活性及MDA的含量。
2.4.4 肝脏病理组织学观察
取小鼠肝左叶相同部位的一小块肝组织，用10%甲醛溶液固定。随后进行石蜡包埋切片，HE染色。用电子显微镜以10个视野点为标准观察每个组织切片。统计切片中各种病变所占视野的面积的次数，累计每一组小鼠肝脏病变总情况并进行分析。急性肝损伤病理切片观察是否有点状坏死、灶性坏死、肝细胞水肿、脂肪变性、间质和汇管区炎细胞浸润、细胞质质地杂乱、核分裂、凋亡、淤血、肝细胞再生和肝细胞浆凝聚等病变类型。

讨论

经过研究证实小茴香精油处理大鼠的肝看其对肝再生度的保护作用，小茴香对大鼠肝纤维化的预防作用，小茴香挥发油对于CCl4所致的小鼠肝脏的毒害的保护作用，对肝硬化腹水大鼠总排尿量有明显的促进作用。在通过以上小茴香研究结果的基础上我们选用小茴香根皮并对它的保肝作用进行了一系列研究。
本课题分别采用CCl4、D-GalN、BCG/LPS小鼠慢性肝损伤模型和CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤模型，从化学性肝损伤、免疫性肝损和急、慢性肝伤等几个内容观察维药小茴香根皮提取物的保肝作用。
总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）反映的是肝脏的合成功能。通过总蛋白和白蛋白的值相减可以计算出球蛋白（GLB）含量。此后根据白蛋白和球蛋白含量求出白球蛋白（A/G）比值。一若在人的血清中TP小于35g/L 时，就说明有肝脏出现了腹水现象。本实验中模型组大鼠虽然可以降低TP、ALB、A/G的比值可是结果发现没有统计学意义。说明这些生化指标基本在正常范围内。这可能跟CCl4给药浓度逐步递增有联系，也就是说CCl4浓度未达到严重肝损伤的程度，只是发生了轻度肝纤维化。而血清转氨酶是肝细胞损害的敏感标志之一，反映了细胞坏死损害程度，而血清ALT、AST的活性反映肝损害程度更具有特异性。当肝细胞受一定的损伤后ALT、AST的活性明显升高导致肝细胞坏死。原理是因为ALT、AST主要存在于肝细胞内，肝细胞变性或细胞膜被破裂时，存在膜浆中的ALT、AST流入血液[36]，因此上述指标就会升高。通过本课题所做的大量研究发现，维药小茴香根皮不同提取物可显著降低小鼠血清ALT、AST的活性，说明维药小茴香根皮具有一定的抗肝损伤作用。
研究发现肝损伤是一种不同的因素参与的较为复杂过程。自由基过剩和脂质过氧化反应在一系列肝病中起到非常重要的作用[37]。如果自由基产生的过多或者是清除过慢说明体内的动态平衡将被破坏[38]。在微血管中黏附、聚集，造成微循环障碍。MDA为脂质过氧化的最终产物[39]，它可以引起细胞坏死和肿胀，严重破坏细胞膜结构。若想得知机体内脂质过氧化的程度，我们经常会测得MDA的含量得出结论。所以说MDA能够间接地反映出细胞损伤的程度[40] 。在本课题研究中发现不管是急性还是慢性实验，小茴香根皮不同提取物均可以不同程度的降低MDA含量。SOD是抗氧化酶系统主要物质之一，它能清除生物氧化导致的氧自由基，在机体的氧化与抗氧化平衡关系中起着非常重要的作用，这说明SOD起到保护肝脏作用[41]。本课题研究中发现小茴香根皮提取物均可以使SOD活性升高，有显著性差异。GSH-PX是内源性抗氧化系统的重要组成部分。GSH-PX在保护肝细胞免疫过氧化损害中起重要作用。本课题的研究，维药小茴香根皮不同提取物能够通过显著降低肝内MDA含量，抑制过氧化反应，减轻MDA对机体的损伤；同时它还能通过提高SOD、GSH-PX活性。实验结果说明小茴香根皮不同提取物可能通过清除自由基、提高机体内自由基清除酶活性和抗脂质过氧化而发挥保护肝细胞作用。
NO在体内既有损伤作用又有保护作用。少量的、基础的NO是维持肝组织局部的血液循环、抑制白细胞粘附及血小板聚集等正常生理功能所必需的[42]。当LPS引起肝细胞损伤时，由于活性氧的生成超过清除，肝脏处于氧化应激状态，生成大量的NO，NO与氧自由基结合形成毒性很强的过氧化亚硝酸盐阴离子，诱导巯基氧化和脂质过氧化作用[38]。NO能抑制线粒体呼吸链，阻碍能量的产生，抑制DNA和肝细胞蛋白质的合成，诱导肝细胞凋亡与坏死[43]。小茴香根皮不同提取物能抑制肝组织中NO的升高，减轻肝损伤并调节其对肝脏的生理功能而起到抗肝损伤的作用。
病理组织学检查能较客观地反映肝损伤的基本程度。本实验结果显示，维药小茴香根皮不同提取物各剂量组肝脏病变程度明显减轻肝细胞水肿、脂肪变、点状坏死和炎细胞浸润的情况，肝细胞再生很明显，通过急慢性肝损伤病理切片观察结果我们得知除了正常组以为所有的切片都有不同程度的肝细胞再生。肝细胞再生说明，肝脏的保护反应是通过促进肝细胞再生和修复完成的，因此可以推断维药小茴香不同提取物对肝细胞有一定保护作用。
以上4种实验性肝损伤模型结果表明，从维药小茴香根皮中得到的四种提取物对CCl4、D-GalN、BCG/LPS及CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤，不管是血清酶学还是肝脏病理组织学变化均具有良好的保护作用。本次实验中的这些肝毒物对肝损伤的机理各不相同，因而可以认为维药小茴香根皮提取物对肝脏的保护作用对多种机制的环节都有影响并不是通过单一的保护机制实现的。
小 结
本课题通过两种急性化学性肝损伤动物模型，一种急性免疫性肝损伤动物模型和一种慢性肝损伤动物模型，研究小茴香根皮不同提取物的保肝作用及其作用机制。结果表明，从小茴香根皮中得到的四种提取物均具有一定的抗急慢性肝损伤的作用，其作用机制可能与清除自由基、保护细胞膜和抗脂质过氧化等有关。小茴香根皮不同提取物均有抗肝损伤作用，目前认为乙酸乙酯部位和水提部位是体内肝损伤实验中最具有抗损伤作用的有效部位，两者相乙酸乙酯部抗肝损伤作用比水提部位稍强。这可能跟乙酸乙酯部位所含黄酮类化合物有关。正如有关文献报道，黄酮类化合物不仅是护肝活性成分也是微体酶的诱导剂。维药小茴香根皮抗肝损伤的有效部位的确定和其保护作用的具体环节和机制还需进一步做体外实验的研究才能充分确定抗肝损伤有效部位，此课题为维药小茴香根皮在肝病的防治方面提供了一定的实验依据。